表沒食子兒茶素沒食子酸酯與西妥昔單抗聯用體內外抗食管癌細胞Eca-109的作用研究

商悅，劉旭杰，陳淑珍

·論著·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯與西妥昔單抗聯用體內外抗食管癌細胞Eca-109的作用研究

商悅，劉旭杰，陳淑珍

目的研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與西妥昔單抗聯用體內外抗食管癌Eca-109的作用。

方法采用MTT法檢測化合物對腫瘤細胞增殖的影響；采用克隆形成法檢測EGCG對腫瘤細胞克隆形成的影響；采用流式細胞術檢測化合物對腫瘤細胞凋亡的影響；采用動物實驗評價藥物或EGCG對移植于裸鼠的移植瘤的生長抑制作用；同時采用免疫組化的方法檢測藥物或EGCG對血管形成的影響。

結果EGCG能夠劑量依賴性地抑制Eca-109細胞增殖，其IC50值為43.22 μmol/L。經克隆形成法檢測結果表明，EGCG能夠明顯抑制Eca-109細胞的克隆形成，IC50值為28.49 μmol/L。EGCG能夠顯著引起Eca-109細胞凋亡，60和80 μmol/L EGCG誘導的凋亡百分率分別為（21.70± 0.62）%、（57.13±9.09）%。EGCG和西妥昔單抗聯用對Eca-109細胞的增殖抑制作用較單獨用藥組強，具有相加作用。體內實驗結果表明，EGCG和西妥昔單抗均能抑制Eca-109裸鼠移植瘤的生長，兩者聯用存在增強作用。EGCG和西妥昔單抗均能抑制裸鼠移植瘤的血管形成，兩者聯用血管形成抑制作用較單用組更強。

結論EGCG能夠抑制食管癌Eca-109的細胞增殖和克隆形成，具有誘導Eca-109細胞凋亡作用，與西妥昔單抗聯用在體內外均具有增強作用。

兒茶酚類；藥物篩選試驗，抗腫瘤；食管腫瘤；西妥昔單抗

世界范圍內，食管癌的發(fā)病率在腫瘤發(fā)病率中排名第六，每年新發(fā)病例約為450 000［1］。我國是世界上食管癌相對高發(fā)的地區(qū)。對食管癌的預防和治療進行研究將具有重要意義。

茶多酚是綠茶的主要活性成分，主要以兒茶素的單體形式存在，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在兒茶素中含量最高，活性最大［2］。EGCG單用具有中度的抗腫瘤活性，能夠增強抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性、降低抗腫瘤藥物的毒性、逆轉耐藥性等［3］，如EGCG與紫杉醇聯用能夠協(xié)同抑制非小細胞肺癌H460細胞增殖［4］。EGCG不但能抑制腫瘤的生長，也能抑制腫瘤的侵襲和轉移，抑制腫瘤的血管形成，具有多重效應［5］。

西妥昔單抗（cetuximab，Cet）是靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的IgG1型的嵌合型單克隆抗體，能與內源性的EGFR配體競爭性地結合EGFR，且親和力明顯高于內源性配體［6］，是一種大分子靶向抗腫瘤藥物。在臨床上單用或與伊立替康聯用于EGFR過度表達的、對以伊立替康為基礎的化療方案耐藥的轉移性直腸癌的治療，其作用機制是通過拮抗EGFR受體介導的信號通路，從而產生抑制腫瘤的細胞生長、血管形成、侵襲轉移等多重效應；同時也可以通過抗體依賴的細胞毒作用（antibodydepedent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）產生抗腫瘤作用［7］。

基于以上所述，EGCG和Cet均具有抑制腫瘤的細胞生長、血管形成、侵襲轉移等多重效應，因此，我們研究兩者聯用對食管癌是否具有增效作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑綠茶提取物EGCG由綠康天然產物有限責任公司提供，批號為D98-120602；Cet注射液由勃林格殷格翰藥業(yè)公司生產（100 mg/瓶，進口藥品注冊號S20110009）；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒和ZLI-9018濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司；一抗CD31購自美國Abcam公司，批號為2530-1；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.1.2 實驗動物6～8周BALB/c裸鼠，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2007-0001。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人食管癌Eca-109細胞由本室保存。細胞用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液在含5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)，每周傳代2～3次，常規(guī)消化，細胞長至對數生長期備用。

1.2.2 MTT法檢測藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用取對數生長期細胞，消化計數后按3000～5000個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用不同濃度的藥物處理細胞48 h或72 h，每組至少3個平行孔，MTT用PBS緩沖液配成2 mg/ml溶液，每孔加20 μl，37℃溫箱中溫育4 h。吸出上清液，加入150 μl DMSO，振蕩15 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀在570 nm處測定每個孔的光密度（OD）。

細胞存活率（%）=OD藥物組/OD對照組×100%

各測試孔的OD值減去本底（完全培養(yǎng)基加MTT，無細胞）OD值，3個平行孔OD值取平均數。以存活率為50%的藥物濃度為IC50。

1.2.3 克隆形成法檢測藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用取對數生長期細胞，消化計數后按5000個/10 ml的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔50個細胞/100 μl，每組設3個平行孔。置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用不同濃度的藥物處理細胞，加藥后放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，計數含50個細胞以上的集落，顯微鏡下計細胞集落數，并計算藥物單獨作用的IC50。聯合用藥給藥方式為先加EGCG 50 μl/孔，6 h后加其他藥物50 μl/孔。

1.2.4 Annexin V-FITC雙染法檢測細胞凋亡將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，10萬～20萬個/孔（2 ml），培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的藥物，并設空白對照，每組設3個平行孔。作用48 h后，吸出舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗細胞1次，胰酶消化，用舊培養(yǎng)液中和胰酶，收集細胞液稍混勻，轉移到離心管內，1000×g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數，取5萬～10萬個重懸細胞，1000×g離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入5 μlAnnexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。1000×g離心5 min，棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10 μl碘化丙啶（PI）染色，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.5 小鼠腫瘤模型建立將培養(yǎng)好的人食管癌Eca-109細胞接種于BALB/c裸鼠右腋皮下，接種細胞數為（800～1000）×104個/只。

1.2.6 動物體內療效觀察在BALB/c裸鼠右腋皮下接種人食管癌Eca-109細胞，待腫瘤生長后，剝離瘤體，切成2 mm3大小的腫瘤塊，移植入裸鼠右腋皮下。接種后7 d，將動物按體重分層，并隨機分組，每組6只，共6個實驗組：對照組、EGCG單藥150 mg/kg、EGCG單藥100 mg/kg、Cet 20 mg/kg、EGCG單藥150 mg/kg與Cet 20 mg/kg聯合、EGCG單藥100 mg/kg與Cet 20 mg/kg聯合。EGCG口服給藥每周5次，連給3周，共15次。Cet腹腔注射每周2次，連給3周，共6次。定期測量動物體重及瘤塊的長徑和短徑。一周測量2～3次，按以下公式計算腫瘤體積：

V=a（長徑）×b（短徑）×1/2

第30天處死動物，取瘤塊稱重，計算抑瘤率及動物體重變化。

1.2.7 兩藥相互作用指數兩藥相互作用指數CDI，CDI=AB/（A×B）。AB為兩藥聯合作用組的細胞抑制率，A、B是藥物單獨作用組的細胞抑制率。當CDI＜1時藥物作用為協(xié)同；當CDI＜0.7時藥物作用為協(xié)同顯著；當CDI=1時藥物作用性質為相加，CDI＞1，表示兩藥無相加或協(xié)同作用。

1.2.8 免疫組化法研究CD31在腫瘤組織的表達將腫瘤組織制備成石蠟切片，脫蠟后侵入0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復，PBS沖洗2 min×2次，3%雙氧水室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗2 min×3次，滴加一抗4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，37℃孵育10～20 min，PBS沖洗2 min×3次。滴加二抗，37℃孵育10～20 min，PBS沖洗2 min×3次。DAB染色：1 ml DAB底物緩沖液中加1滴DAB濃縮液，混勻。組織切片上滴加DAB顯色液，上色后立即自來水沖洗，終止染色。蘇木素復染5 min，用水沖洗，氨水、酸乙醇反藍，脫水后中性樹脂封片。光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 EGCG對Eca-109細胞的增殖抑制作用

采用MTT法檢測了EGCG對Eca-109細胞增殖的影響，結果表明，EGCG能夠劑量依賴性地抑制Eca-109的增殖，40 μmol/L時顯示出明顯療效，與對照組相比存在統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。EGCG在本實驗條件下的IC50值為43.22 μmol/L（圖1）。

圖1 EGCG對Eca-109細胞增殖的影響（***P＜0.001）Figure 1Effect of EGCG on the proliferation of Eca-109 cells（***P＜0.001）

2.2 EGCG對Eca-109細胞克隆形成的影響

克隆法是體外檢測化合物是否具有抑瘤作用的一個有效方法。表1結果表明，EGCG能夠抑制Eca-109細胞的克隆形成，具有濃度依賴性，10 μmol/L EGCG的克隆形成抑制率為72.22%，與對照比較具有顯著差異（P＜0.001）。EGCG對Eca-109細胞克隆形成的IC50值為28.49 μmol/L。

2.3 EGCG對Eca-109細胞凋亡的影響

細胞凋亡是化合物或藥物抑制細胞增殖的一個途徑，本文采用Annexin V-FITC雙染法經流式細胞術檢測細胞凋亡。結果表明，EGCG處理細胞48 h能夠劑量依賴性地誘導Eca-109細胞凋亡，60和80 μmol/L EGCG都能顯著誘導細胞凋亡，凋亡百分率分別為（21.70±0.62）%、（57.13± 9.09）%，其凋亡百分率和對照比較均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.001）（圖2）。

表1 EGCG對Eca-109細胞的克隆形成的影響Table 1Effect of EGCG on colony formation of Eca-109 cells

2.4 EGCG與Cet聯用對Eca-109細胞增殖的影響

本研究采用MTT法檢測了EGCG與Cet聯用對Eca-109細胞增殖的影響。實驗中采用的藥物作用濃度分別為10 μmol/L EGCG、1 μg/ml Cet。實驗采用兩種加藥順序，先加EGCG 2 h，再加Cet（圖3A）；或者先加Cet 2 h，再加EGCG（圖3B），兩種順序均兩藥共同作用72 h。圖3A表明，Cet能夠顯著抑制Eca-109細胞增殖，與對照相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩藥聯用，作用明顯增強，此種情況下CDI值為1.05。圖3B也表明，兩藥聯用作用明顯增強，CDI值為1.11。從以上CDI值均大于1可以看出，兩藥聯用沒有相加或協(xié)同作用，但存在增強作用。

2.5 EGCG與西妥昔單抗聯用對Eca-109裸鼠移植瘤的影響

動物實驗是評價藥物或化合物抑制腫瘤生長是否有效的金標準，因此本實驗中采用食管癌裸鼠移植瘤實驗觀察了兩藥聯合應用的情況。本實驗中，Cet采用20 mg/kg。圖4結果表明，在本實驗劑量條件下，Cet、EGCG和兩者聯用對動物體重均沒有明顯的影響，聯用情況下，動物體重也是逐漸增加的，因此說明此劑量條件下無論是單藥還是聯用均對動物沒有明顯毒性。圖5是腫瘤的生長曲線，從中可以看出，單用EGCG能夠劑量依賴性地抑制腫瘤的生長，Cet對Eca-109移植瘤的生長也具有生長抑制作用，兩者聯用作用明顯增強。從剝離瘤塊后稱重結果可以看出，各劑量組均能顯著抑制腫瘤的生長（P＜0.05），且兩藥聯用的CDI值在1～1.06之間，接近1，因此具有一定的相加作用。

圖2 EGCG對Eca-109細胞凋亡的影響（***P＜0.001）（A～D為凋亡的散點圖；A：0 μmol/L；B：40 μmol/L；C：60 μmol/L；D：80 μmol/L；E：三次實驗的平均結果圖）Figure 2Effect of EGCG on the apoptotic rate of Eca-109 cells（***P＜0.001）（A-D was a scatter plot of apoptosis；A：0 μmol/L；B：40 μmol/L；C：60 μmol/L；D：80 μmol/L；E：Average result of triple）

圖3 EGCG與Cet聯用對Eca-109細胞增殖的影響（*P＜0.05，***P＜0.001）（A：EGCG預處理2 h，兩藥共同作用72 h；B：Cet預處理2 h，兩藥共同作用72 h）Figure 3Effect of the combination of EGCG and Cet on the proliferation of Eca-109 cells（*P＜0.05，***P＜0.001）（A：The cells were pretreated with EGCG for 2 h，followed by exposure to both drugs for 72 h；B：The cells were pretreated with Cet for 2 h，followed by exposure to both drugs for 72 h）

2.6 EGCG與Cet聯用對腫瘤組織中血管形成的影響

處理動物，腫瘤組織進行石蠟切片包埋并進行免疫組化實驗。實驗中采用CD31抗體作為一抗，研究化合物對血管形成的影響。圖6結果表明，Cet作用后，瘤塊中的新生血管明顯減少，EGCG作用后新生血管較對照組有所減少，但不如Cet組明顯，兩者聯用后，新生血管明顯減少。

圖4 EGCG與Cet聯用對攜帶移植瘤裸鼠體重的影響Figure 4Effect of the combination of EGCG and Cet on the body weight of nude mice with tumor xenografts of Eca-109 cells

圖5 EGCG與Cet聯用對Eca-109裸鼠移植瘤的生長抑制作用Figure 5Combination of EGCG and Cet inhibited the growth of tumor xenografts of Eca-109 cells in nude mice

圖6 EGCG和Cet聯用對血管形成的影響［A：對照；B：EGCG（150 mg/kg）；C：Cet（20 mg/kg）；D：EGCG（150 mg/kg）+Cet（20 mg/kg）；圖中箭頭表示新生血管（×200）］Figure 6Effect of the combination of EGCG and Cet on the angiogenesis［A：Control；B：EGCG（150 mg/kg）；C：Cet（20 mg/kg）；D：EGCG（150 mg/kg）+Cet（20 mg/kg）；The direction of the arrow showed the neovascularization（×200）］

3 討論

眾所周知，茶葉具有一定的防癌功能。EGCG是茶葉具有生物學活性的主要成分，兼具一定的抗腫瘤作用。EGCG能夠抑制肝癌細胞生長，誘導肝癌細胞凋亡，引起肝癌細胞周期阻滯，這些與EGCG抑制Akt信號通路相關［8］。因此，我們研究了EGCG對Eca-109細胞增殖和克隆形成的影響，同時觀察了EGCG的凋亡誘導作用。本研究結果表明，EGCG能夠劑量依賴性地抑制食管癌細胞Eca-109的增殖，在體外具有顯著的抑制腫瘤細胞生長和克隆形成的作用，同時，其還具有誘導腫瘤細胞凋亡的功能，凋亡也是化合物或藥物引起腫瘤細胞死亡的機制之一。但是，EGCG對食管癌細胞作用的分子機制還有待進一步研究。

腫瘤靶向治療是近年來腫瘤研究的熱點，由于EGFR在腫瘤中高表達，它已經成為腫瘤治療的靶點［9］。腫瘤化療一般以聯合治療為主，靶向藥物也需要與傳統(tǒng)的化療藥物聯用來達到治療腫瘤的最大效能。Cet主要通過拮抗EGFR信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，與之相聯用的化療方案正在進行不同腫瘤的臨床試驗［10-11］。本研究將EGCG與Cet聯用，結果表明，在體外，兩者聯用對Eca-109的細胞增殖具有一定的增強作用。體內試驗表明，EGCG和Cet單獨應用也能明顯抑制攜帶Eca-109裸鼠移植瘤的生長，兩者聯用能夠顯著抑制移植瘤的生長，強于單獨用藥組。

CD31為內皮細胞分子標記［12］，EGCG和Cet都具有血管形成抑制作用，因此該研究也進行了CD31表達的免疫組化分析。結果表明，Cet能夠明顯抑制腫瘤組織中的血管形成，EGCG具有較Cet弱的血管形成抑制作用，兩者聯用后血管形成抑制作用明顯增強。EGCG與Cet聯用產生明顯抗腫瘤作用的機制可能與它們抑制腫瘤血管形成相關。本研究為EGCG的抗腫瘤作用提供一些實驗依據，為茶多酚開發(fā)成藥提供了一些思路。

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MethodsMTT assay and colony formation assay were used to detect the effect of cell proliferation.Cellular apoptosis was examined using flow cytometry.Animal experiments were performed to evaluate the reduced growth of tumor xenograft in nude mice administrated by EGCG and cetuximab.Immunohistochemical technique was applied to examine the expression of endothelial cells in tumor tissue.

ResultsEGCG inhibited the proliferation of Eca-109 cells in a dose-dependent manner and the IC50value was 43.22 μmol/L.The results from colony formation assay showed that EGCG dose-dependently decreased the number of colony formation at the IC50value of 28.49 μmol/L.EGCG also induced apoptosis of Eca-109 cells and the percentage of apoptosis was（21.70±0.62）%and（57.13±9.09）%at the concentration of 60 and 80 μmol/L，respectively.The inhibitory effect of the combination of EGCG and cetuximab on the proliferation was more potent than that of either single treatment with EGCG or cetuximab，indicating an additive effect for the combination treatment.At the same time，the combination reduced the growth of tumor xenografts in nude mice more potently than EGCG or cetuximab alone.Moreover，expression level of CD31 in the tumor tissue from xenografts in the combination group was decreased more significantly than that of single EGCG or cetuximab treatment.

ConclusionEGCG inhibits the proliferation and colony formation，and induces significantly apoptosis in human esophageal cancer cell line Eca-109.An additive effect was observed for the combination of EGCG and cetuximab treatment on the growth of Eca-109 cells in vitro and in vivo.

Antitumor effect of the combination of EGCG and cetuximab on the human esophageal cancer cell line Eca-109 in vitro and in vivo

SHANG Yue，LIU Xu-jie，CHEN Shu-zhen

ObjectiveTo explore the antitumor effect of the combination of EGCG and cetuximab on human esophageal cancer cell line Eca-109 in vitro and in vivo.

Catechols；Drug screening assays，antitumor；Esophageal neoplasms；Cetuximab

CHEN Shu-zhen，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.005

國家自然科學基金（81373437）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-022）

100050北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所腫瘤室

陳淑珍，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

2014-04-29

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術，2015，10（1）：18-24

AuthorAffiliation:Department of Oncology，Institute of Medicinal Biotechnoloty，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（1）：18-24