LC-MS/MS法測定水基膠中的3種異噻唑啉酮類防腐劑

盧昕博，肖衛(wèi)強(qiáng)，許高燕，史春云，蔣健，周國俊

浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,杭州市西湖區(qū)科海路118號 310024

LC-MS/MS法測定水基膠中的3種異噻唑啉酮類防腐劑

盧昕博，肖衛(wèi)強(qiáng)，許高燕，史春云，蔣健，周國俊

浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,杭州市西湖區(qū)科海路118號 310024

建立了測定水基膠中3種異噻唑啉酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法。水基膠樣品經(jīng)水萃取、離心后進(jìn)行LCMS/MS 分析，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：MI、CMI在濃度范圍2.5～250 ng/mL、BIT在濃度范圍5～500 ng/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2≥0.9996），3 個加標(biāo)水平的加標(biāo)回收率在96.3%～109.6%之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.5%～6.7%之間，方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.011～0.015 mg/kg和0.035～0.051 mg/kg。該方法適用于水基膠中MI、CMI、BIT的快速測定。

異噻唑啉酮；LC-MS/MS；水基膠

異噻唑啉酮類化合物是一類高效、廣譜防腐劑，對細(xì)菌、真菌、藻類等具有良好的殺滅效果，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)循環(huán)冷卻水、膠黏劑、紡織、涂料、造紙等領(lǐng)域[1-4]。

水基膠是通過乳液聚合而成的含水膠乳，易受微生物侵襲，在水基膠中添加異噻唑啉酮可以起到殺菌防腐的作用。異噻唑啉酮類化合物，尤其是5-氯-2-甲基-異噻唑啉-3-酮（CMI）和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）具有皮膚刺激性，并且是強(qiáng)過敏源，即使在規(guī)定濃度范圍仍有可能導(dǎo)致過敏[5-7]。歐盟指令規(guī)定化妝品中CMI/MI(3:1)混合物的添加上限為0.0015%，MI的添加上限為0.01%[8]。煙用水基膠由于可能會直接接觸消費(fèi)者的口腔，其安全性非常重要，因此有必要建立水基膠中異噻唑啉酮含量的測定方法。

已報道的異噻唑啉酮類化合物分析方法的研究主要集中在家居產(chǎn)品、護(hù)膚品、環(huán)境水監(jiān)測、紙制品等領(lǐng)域[9-12]。異噻唑啉酮的檢測方法主要有紫外分光光度法[13]、氣相色譜法(GC)[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (GC-MS)[15]，液相色譜法 (HPLC)[16-17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[18]等。已有報道采用高效液相色譜法測定水基膠中異噻唑啉酮[19,20]，但高效液相色譜法分析時間長、靈敏度不高，相比之下LCMS/MS分析時間短、節(jié)省溶劑、靈敏度高，選擇性好，更加適合復(fù)雜體系中異噻唑啉酮類化合物的測定。本文建立了同時測定水基膠中3種異噻唑啉酮類防腐劑的LC-MS/MS方法，旨在快速準(zhǔn)確測定水基膠中異噻唑啉酮的含量。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

市購水基膠樣品。

2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-異噻唑啉-3-酮（CMI）、1,2-苯并異噻唑基-3(2H)-酮（BIT）（純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司），內(nèi)標(biāo)1,2-苯并異噻唑基-3(2H)-酮-13C6（BIT-13C6）（純度≥98.0%，加拿大Tornoto Research Chemical公司）標(biāo)樣，甲醇、甲酸（色譜純，美國Dikma 公司），水為自制超純水。

Thermo Scienti fi c TSQ Quantum Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀、Thermo Scienti fi c Surveyor Plus 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；CORTECS C18+ 色譜柱（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm，90 ?，美國Waters 公司）；Sigma 4-16K高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；KQ500-DB 超聲波發(fā)生器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；XP205 電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取50 mg MI、CMI、BIT于各自的50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到濃度為1 mg/mL MI、CMI、BIT的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別取1 mL BIT，0.5 mL的MI、CMI標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL 容量瓶中，以水定容，得到MI、CMI、BIT濃度分別為5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確稱取1 mg內(nèi)標(biāo)BIT-13C6于10 mL 容量瓶中，用水定容，得到濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 樣品處理與分析

準(zhǔn)確稱取1 g樣品于100 mL錐形瓶中，加入20 mL水及20 μL內(nèi)標(biāo)溶液振蕩萃取10 min，以10000 rpm轉(zhuǎn)速離心15 min，取上層清液，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后直接進(jìn)樣分析。

LC-MS/MS條件為：色譜柱：CORTECS C18+色譜柱，配有預(yù)柱（2.1×5 mm，2.7 μm，90 ?）；流動相：A為甲醇，B為水；洗脫梯度：0～4 min，30%A → 60%A；4.1～6 min，100%A；6.1～ 8 min，30%A；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃ ；進(jìn)樣體積：10 μL；離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；電噴霧電壓：4000 V；離子源溫度：350℃ ；氣化溫度：350℃；碰撞氣為高純氬氣，壓力為0.20 Pa；鞘氣、輔助氣為氮?dú)猓蕷饬髁浚?0 L/min，輔助氣流量：5 L/min；各防腐劑及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。

表1 MI、CMI、BIT、BIT-13C6的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab. 1 MS/MS acquisition parameters for MI, CMI, BIT and BIT-13C6

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的建立

MI、CMI、BIT均是含氮雜環(huán)化合物，易于結(jié)合氫離子形成正離子，因此選擇正離子模式進(jìn)行檢測。將異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液及內(nèi)標(biāo)溶液稀釋一定倍數(shù)，得到濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過注射泵將標(biāo)準(zhǔn)樣品以5 μL/min的流速導(dǎo)入質(zhì)譜儀，同時以30%甲醇溶液做流動相并設(shè)置流速為0.2 mL/min，進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，使待測化合物的準(zhǔn)分子離子峰峰強(qiáng)度為106左右，優(yōu)化透鏡補(bǔ)償電壓、噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子源溫度、氣化溫度獲得待測化合物穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子峰。之后選擇碰撞氣壓力為0.2 Pa，分別對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片分析，優(yōu)化碰撞能量，找到強(qiáng)度較大的3個子離子，其中豐度最高的特征子離子作為定量離子，其它兩個作為定性離子（表1）。定性條件為：樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間偏差在6s之內(nèi)；具有1個定量離子、2個定性離子；待測樣品定性離子的相對豐度與濃度臨近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液定性離子的相對豐度之間的偏差應(yīng)在20%以內(nèi)。

2.2 流動相的選擇

以甲醇-水作為流動相，考察了在0%～0.2%濃度范圍內(nèi)甲酸對目標(biāo)化合物質(zhì)譜響應(yīng)的影響。采用1.2.2的梯度洗脫程序，調(diào)節(jié)流動相中的甲酸濃度，待系統(tǒng)平衡后，進(jìn)樣濃度為25 ng/mL的異噻唑啉酮混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，平行進(jìn)樣6次，取平均值，結(jié)果如圖1所示。隨著甲酸濃度的增加，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)降低，因此，采用甲醇-水溶液作為流動相。

圖1 甲酸濃度對異噻唑啉酮質(zhì)譜響應(yīng)的影響Fig. 1 Effect of formic acid concentration on the MS response to isothiazolinones

2.3 前處理?xiàng)l件的確定

2.3.1 萃取溶劑的選擇

異噻唑啉酮在水及醇中溶解性都較好，但采用高濃度甲醇溶液萃取會產(chǎn)生以下兩個問題：水基膠中的異噻唑啉酮得到的萃取溶液與流動相不匹配，在流動相中會有不溶物析出；高濃度甲醇做萃取溶劑得到的樣品，由于溶劑效應(yīng)會導(dǎo)致樣品峰變型、柱效降低。本文考察了水、30%甲醇、50%甲醇溶液對萃取效果的影響。選取市購含有3種異噻唑啉酮的水基膠樣品，分別稱取樣品1 g，加入20 mL溶劑萃取，在其他條件不變的情況下按1.2.2方法處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖2所示：不同濃度的甲醇溶液對萃取效果影響不明顯。由于，水基膠在水溶液中的分散性更好，并且以水做溶劑萃取樣品經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，因此本文選擇水作為萃取溶劑。

圖2 不同濃度甲醇水溶液對異噻唑啉酮萃取效果的影響Fig. 2 Effect of methanol concentration on the extraction of isothiazolinones

2.3.2 萃取方式和時間的選擇

其他條件不變的情況下對樣品分別進(jìn)行超聲萃取30 min和振蕩萃取30 min，結(jié)果如圖3所示。兩種萃取方式測得的異噻唑啉酮濃度接近，根據(jù)目測效果，振蕩萃取更有利于水基膠的分散，因此選擇振蕩萃取方式。

圖3 萃取方式對異噻唑啉酮萃取效果的影響Fig. 3 Effect of different extraction methods on the extraction of isothiazolinones

其他條件不變的情況下對樣品分別進(jìn)行振蕩萃取10 min、20 min、30 min，結(jié)果如圖4所示。由于水基膠在水中分散性好，延長萃取時間對萃取效果沒有影響，因此，選擇萃取時間為10 min。

圖4 萃取時間對異噻唑啉酮萃取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction of isothiazolinones

2.4 方法評價

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限與定量限

準(zhǔn)確移取0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于50 mL容量瓶中，然后準(zhǔn)確加入50 μL濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，以水定容至刻度，即得MI、CMI濃度范圍為2.5～250 ng/mL BIT濃度范圍為5～500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照1.2.2 節(jié)所述條件進(jìn)行LCMS/MS 分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液選擇離子色譜圖如圖5、圖6所示。以異噻唑啉酮和內(nèi)標(biāo)物峰面積比對其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸，得到3種異噻唑啉酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。由表2可知，在所采用的色譜條件下，3種異噻唑啉酮均具有較好的相關(guān)性（R2≥0.9996），適合于定量分析。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)進(jìn)樣10次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法的檢出限（LOD），10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限（LOQ）。異噻唑啉酮的LOD范圍為 0.011～0.015 mg/kg，LOQ 范圍為 0.035～0.051 mg/kg。

圖5 異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM色譜圖Fig. 5 SRM chromatograms of isothiazolinones standards

圖6 樣品溶液SRM色譜圖Fig. 6 SRM chromatograms of isothiazolinones samples

表2 MI、CMI、BIT的回歸方程、檢出限及定量限Tab. 2 Regression equations, LOD and LOQ of MI, CMI and BIT

2.4.2 回收率與重復(fù)性

取水基膠樣品3份，分別按照低、中、高三個水平加入3種異噻唑啉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平重復(fù)測定5個樣品，并由加標(biāo)量以及加標(biāo)測定量計算回收率，結(jié)果見表3。從表3可知，3種異噻唑啉酮的平均加標(biāo)回收率在96.3%～109.6%之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.5%～6.7%之間，表明本方法回收率高，重復(fù)性好，適合定量。

表3 方法的的回收率與精密度Tab. 3 Recoveries and precisions of the method

2.5 實(shí)際樣品分析

采用本方法測定了10個市購樣品。10 個樣品中均檢出MI，含量范圍為0.13～2.47 mg/kg；有8個樣品檢出CMI，含量范圍為0.22～1.16 mg/kg；有1個樣品檢出有BIT，含量為0.37 mg/kg，其中，BIT不在歐盟指令化妝品防腐許可使用名單內(nèi)。10個水基膠樣品中MI和CMI含量之和小于3.63 mg/kg，小于歐盟指令規(guī)定化妝品中CMI/MI混合物的添加上限。

3 結(jié)論

建立了水基膠中3種異噻唑啉酮類防腐劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）分析方法。該方法線性良好（R2≥0.9996），加標(biāo)回收率在96.3%～109.6%之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.5%～6.7%之間，檢出限范圍為0.011～0.015 mg/kg，定量限范圍為0.035～0.051 mg/kg。相比液相色譜法[19,20]，該方法分析時間短、節(jié)省溶劑、靈敏度高、選擇性好，適合水基膠中MI、CMI、BIT的快速測定。

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Determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by LC-MS/MS method

LU Xinbo, XIAO Weiqiang, XU Gaoyan, SHI Chunyun, JIANG Jian, ZHOU Guojun
China Tobacco Zhejiang Industrial Co., LTD., Hangzhou 310024, China

A method for determining 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed. The sample was extracted with water, centrifugated, and then analyzed by LCMS/MS and quanti fi ed by internal standard method. Results showed that: the linear relationship was good with determination coef fi cients R2≥ 0.9996 in the MI and CMI concentration range of 2.5～250 ng/mL and in the BIT concentration range of 5～500 ng/mL. The recoveries of standard addition ranged from 96.3% to 109.6% with relative standard deviation (RSD) of 1.5%～6.7%. The limit of detection was between 0.011 and 0.015 mg/kg, and that of quanti fi cation was between 0.035 and 0.051 mg/kg. It was concluded that this method was suitable for the determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive.

isothiazolinone; LC-MS/MS; water-based adhesive

盧昕博,肖衛(wèi)強(qiáng),許高燕,等. LC-MS/MS法測定水基膠中的3種異噻唑啉酮類防腐劑[J]. 中國煙草學(xué)報，2015,21（4）

盧昕博（1981—），博士，工程師，主要從事煙草化學(xué)研究工作，Email：luxb@zjtobacco.com

周國俊（1973—），博士，研究員，主要從事煙草化學(xué)研究工作，Email：zhougj@zjtobacco.com

2015-02-14

:LU Xinbo, XIAO Weiqiang, XU Gaoyan, et al. Determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by LCMS/MS method [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)