線(xiàn)粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協(xié)同下煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性

黃艷飛，陳慶園，王進(jìn)，薛娟娟，王茂勝，魯紅學(xué)，商勝華，張長(zhǎng)青，汪漢成

1長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025;

2貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550081;

3長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025

線(xiàn)粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協(xié)同下煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性

黃艷飛1，陳慶園2，王進(jìn)3，薛娟娟1，王茂勝2，魯紅學(xué)1，商勝華2，張長(zhǎng)青1，汪漢成2

1長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025;

2貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550081;

3長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025

測(cè)定了線(xiàn)粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協(xié)同下煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性。結(jié)果表明：嘧菌酯抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50值分別為25.8300 mg/L和0.0500 mg/L，在100 mg/L SHAM協(xié)同下，EC50值分別降低為15.5200和0.0038 mg/L；SHAM對(duì)煙草赤星病菌菌絲的生長(zhǎng)和分生孢子的萌發(fā)沒(méi)有影響。研究說(shuō)明SHAM增強(qiáng)了嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌的毒力，線(xiàn)粒體電子傳遞的旁路氧化途徑存在于煙草赤星病菌中，且在孢子萌發(fā)中的增效強(qiáng)于菌絲生長(zhǎng)階段。

煙草赤星病菌；嘧菌酯；水楊肟酸 ；敏感性

由 Alternaria alternata（Frises）Keissler引 起 的煙草赤星?。╰obacco brown spot）是煙草生長(zhǎng)中后期發(fā)生最為嚴(yán)重的葉部病害[1-5]，導(dǎo)致煙葉品質(zhì)下降，烘烤價(jià)值降低[6-8]?；瘜W(xué)防治是目前該病害防治上最為普遍的防治措施。然而，長(zhǎng)期大量的使用殺菌劑，導(dǎo)致了病原菌抗藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重[9-13]。

甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑是一種新型、高效、廣譜、內(nèi)吸性的殺菌劑，可抑制幾乎所有的真菌界病菌孢子的萌發(fā)及產(chǎn)生，控制菌絲體的生長(zhǎng)和病原孢子的侵入[14-16]。嘧菌酯是這類(lèi)殺菌劑中典型的代表，具有全新的生化作用機(jī)制，主要作用于真菌的線(xiàn)粒體，與線(xiàn)粒體上細(xì)胞色素b（cyt b）的Qo位點(diǎn)相結(jié)合，阻斷細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素c1之間的電子傳遞，破壞能量合成，從而抑制真菌生長(zhǎng)或殺死真菌[17-20]。近些年來(lái)，甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑(QoI類(lèi))在全球許多國(guó)家被登記用來(lái)防治鏈格孢屬真菌性病害，其中最為廣泛的為嘧菌酯[16,21]。由于真菌體內(nèi)的產(chǎn)能代謝不止線(xiàn)粒體呼吸作用一條，還包括真菌在呼吸作用受抑制的情況下，誘導(dǎo)啟動(dòng)的旁路氧化途徑[22]。旁路氧化途徑的補(bǔ)償作用是導(dǎo)致部分病原真菌對(duì)QoIs類(lèi)殺菌劑不敏感或敏感性下降的重要原因之一[23-26]。旁路氧化途徑被報(bào)道存在于辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中[23,27]；該途徑是否存在于煙草赤星病菌中目前還不清楚。

水楊肟酸是調(diào)節(jié)旁路氧化途徑中旁路氧化酶的專(zhuān)性抑制劑，作用于旁路氧化酶，使其失活，從而專(zhuān)一地抑制旁路氧化作用的產(chǎn)能[28]。本文旨在研究煙草赤星病菌旁路氧化途徑被抑制前后，煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的生物活性，以期為嘧菌酯防治煙草赤星病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌、培養(yǎng)基及供試藥劑

供試煙草赤星病菌菌株C2由貴州省煙草科學(xué)研究院真菌實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和提供，為敏感菌株。馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：土豆200 g煮沸20min后過(guò)濾，濾液添加20 g瓊脂和20 g葡萄糖煮沸，定容至1 L，滅菌，用于病原真菌的敏感性測(cè)定。相同階段敏感性測(cè)定，所有藥劑均采用同一批培養(yǎng)基以減少試驗(yàn)誤差。

對(duì)照藥劑95.3%氟硅唑、96%醚菌酯、95%苯醚甲環(huán)唑原藥分別由南通柯林化學(xué)品有限公司、鹽城福利德化工有限公司和江蘇揚(yáng)農(nóng)化工集團(tuán)有限公司提供。將上述藥劑溶于甲醇，分別配成10000 mg/L的母液。對(duì)照藥劑96%多菌靈由江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司生產(chǎn)，將其溶于0.2M的稀鹽酸配成10000 mg L-1的母液。對(duì)照藥劑97.3%異菌脲由泰安圣聚華有限公司生產(chǎn)，將該藥劑溶于丙酮配成10000 mg/L的母液。用無(wú)菌水將上述母液稀釋成系列濃度的藥液，于4 ℃黑暗條件下保存、備用。96.8%嘧菌酯由先正達(dá)(中國(guó))投資有限公司提供，溶于甲醇，配成10000 mg/L的母液。99%水楊肟酸（salicyhydroxamic acid， SHAM）美國(guó)Acros Organics公司生產(chǎn)，溶于甲醇配置成1.0×105mg/L的母液，4℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)將上述系列濃度的藥液加至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中制備含藥平板，其中甲醇、丙酮、稀鹽酸的含量小于待測(cè)溶液體積的0.25%，此濃度的甲醇、丙酮、稀鹽酸不影響煙草赤星病菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)(數(shù)據(jù)略)。無(wú)菌水中加入相同體積的甲醇、丙酮或稀鹽酸處理作為空白對(duì)照。

1.2 煙草赤星病菌對(duì)6種殺菌劑的敏感性

采用“菌絲生長(zhǎng)速率”法，將供試煙草赤星病菌菌株移至PDA培養(yǎng)基上，于28℃、黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)5 d，用5mm孔徑打孔器在菌落邊緣打制菌碟。將制好的菌碟置于9 cm直徑的含系列濃度藥劑的PDA平板上。嘧菌酯和醚菌酯的最終供試濃度為（0、3.13、6.25、12.50、25、50、100） mg /L。多菌靈、氟硅唑、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑的最終供試濃度為（0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5、10 ）mg/ L。各藥劑處理均重復(fù)3次。接菌后，28℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d，用“十字交叉法”測(cè)量各菌落直徑，并計(jì)算各藥劑處理對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。菌落增長(zhǎng)直徑=菌落直徑-菌碟直徑

1.3 水楊肟酸協(xié)同下煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性

參照上述方法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行測(cè)定。配制含100 mg/L水楊肟酸的待測(cè)藥劑系列濃度的PDA平板。將制好的菌碟置于PDA平板上。嘧菌酯的最終供試濃度為0、3.13、6.25、12.50、25、50、100 mg/L。所有處理均重復(fù)3次。在28℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d，用“十字交叉法”量取菌落直徑。

參考袁善奎等的方法[29]，將煙草赤星病菌在PDA培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，用打孔器(5mm)在菌落邊緣制取菌碟，挑出5塊菌碟，將其分散于含有500 μL系列濃度嘧菌酯的1 mL離心管中，以含有相同體積無(wú)菌水的離心管為對(duì)照，渦旋后獲得含不同濃度藥劑的孢子懸浮液。嘧菌酯的最終供試濃度為（0、0.03、0.05、0.10、0.20、0.40） mg/L。協(xié)同作用下所有處理中水楊肟酸的濃度均為100 mg/L。取上述含藥孢子懸浮液各20 μL于載破片上，將載玻片置于一次性培養(yǎng)皿中，保濕，各濃度藥劑處理均重復(fù)3次。28℃黑暗培養(yǎng)10 h，在顯微鏡下（10 × 10倍）鏡檢孢子萌發(fā)的數(shù)量，每個(gè)玻片隨機(jī)挑選3個(gè)視野，3次重復(fù)。當(dāng)萌發(fā)芽管的長(zhǎng)度超過(guò)孢子長(zhǎng)度一半時(shí)，視為萌發(fā)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以藥劑的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以對(duì)病菌所測(cè)對(duì)象抑制率的幾率值為縱坐標(biāo)，建立線(xiàn)形回歸方程，并進(jìn)行相關(guān)性分析（r）[30]。根據(jù)方程計(jì)算各種藥劑抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的EC50和EC90值。最后根據(jù)EC50值，分析比較不同殺菌劑對(duì)煙草赤星病菌的毒力。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草赤星病菌對(duì)6種殺菌劑的敏感性

結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑?qū)煵莩嘈遣【木z生長(zhǎng)毒力最強(qiáng)，其EC50值和EC90值分別為0.3000 mg/L、0.3300 mg/L和 10.6700 mg/L、3.4600 mg/L；其次為異菌脲及嘧菌酯，其EC50值和EC90值分別為2.1500 mg/L、25.8300 mg/L和 7.9700 mg/L、＞ 100 mg/L，醚菌酯和多菌靈的毒力較弱，其EC50值均＞100 mg/L（表1）。空白對(duì)照處理黑暗條件下培養(yǎng)6d后煙草赤星病菌的菌落直徑為67mm。

表1 煙草赤星病菌對(duì)6種殺菌劑的敏感性Tab. 1 Sensitivity of Alternaria alternata to six fungicides

2.2 水楊肟酸協(xié)同下煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性

結(jié)果表明，嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)均有抑制作用，其中對(duì)孢子萌發(fā)的毒力較強(qiáng)。隨著藥劑濃度的增加，對(duì)分生孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)抑制逐漸增強(qiáng)（圖1、3），其EC50和EC90值分別為0.0500和0.3200 mg/L，25.8300和＞100 mg/L（表2）。嘧菌酯低劑量處理時(shí)，煙草赤星病菌分生孢子萌發(fā)芽管顯著畸形（圖3）。空白對(duì)照分子孢子萌發(fā)率為90%。

100 mg/L水楊肟酸作用下，煙草赤星病菌分生孢子具有同空白對(duì)照處理一樣的孢子萌發(fā)率（90%）和菌絲生長(zhǎng)速率（65.50mm），水楊肟酸對(duì)赤星病菌孢子的萌發(fā)（圖3A、4A）和菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制作用圖（2A、2B）。

100 mg/L水楊肟酸協(xié)同作用下，嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的毒力均顯著增強(qiáng)（圖2、4），其EC50和EC90值分別為0.0038和0.1200 mg/L，15.5200和100 mg/L（表2）。

表2 嘧菌酯及其與水楊肟酸協(xié)同作用下對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的毒力Tab. 2 Toxicity of azoxystrobin and its synergistic effect with salicylhydroxamic acid against mycelial growth and conidial germination of Alternaria alternata

圖1 嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of azoxystrobin on mycelial growth of Alternaria alternata (A to G were 0, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50, 100 mg/L azoxystrobin, respectively.)

圖2 水楊肟酸100 mg/L協(xié)同下嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of azoxystrobin on mycelial growth of Alternaria alternata in combination of 100 mg/L SHAM (A was water treatment; B to H were 0, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50, 100 mg/L azoxystrobin, respectively.)

圖3 嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的影響 (100倍)Fig.3 Effect of conidial germination of Alternaria alternata under various pressures of azoxystrobin (A to F were 0, 0.025, 0.05, 0.10, 0.20 and 0.40 mg/L azoxystrobin, respectively.)

圖4 水楊肟酸100 mg/L協(xié)同下嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌分生孢子萌發(fā)的影響（100倍）Fig.4 Effect of azoxystrobin on conidial germination of Alternaria alternata in combination of 100 mg/L SHAM (A to F were 0,0.025, 0.05, 0.10, 0.20 and 0.40 mg/L azoxystrobin, respectively.)

3 討論

在SHAM的作用下，嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌的毒力增強(qiáng)（對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)毒力分別提高1.66和14倍），進(jìn)一步證實(shí)了煙草赤星病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)過(guò)程中均存在旁路呼吸作用。旁路呼吸作用能削弱嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌的生物活性；但煙草赤星病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)階段，該呼吸途徑在電子傳遞上的貢獻(xiàn)存在差異，差異的大小可能與孢子萌發(fā)階段病原菌需要大量的能量（ATP），而其菌絲生長(zhǎng)階段需要ATP的量較少有關(guān)[27]。

本文所測(cè)定的藥劑中，多菌靈對(duì)煙草赤星病菌的生物活性較低；苯醚甲環(huán)唑、異菌脲及氟硅唑?qū)煵莩嘈遣【z的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，測(cè)定結(jié)果與嚴(yán)清平等的報(bào)道一致[31]，也與其他類(lèi)鏈格孢屬病原菌對(duì)上述藥劑的敏感性相似[31-33]，但由于三唑類(lèi)藥劑對(duì)作物易產(chǎn)生藥害、且殘留較高等方面的原因[34-35]，尚未在煙草上正式登記。而赤星病菌已經(jīng)對(duì)異菌脲產(chǎn)生廣泛的抗藥性[36]。所以上述藥劑均不宜用于煙草赤星病的防治。

甲氧基丙烯酸酯類(lèi)的嘧菌酯和醚菌酯對(duì)赤星病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均有一定的生物活性，因此，它們對(duì)赤星病的防治可能同時(shí)表現(xiàn)出保護(hù)和治療活性。由于嘧菌酯對(duì)孢子萌發(fā)的毒力（EC50值0.0540 mg/L）高于菌絲生長(zhǎng)的毒力（EC50值25.8300 mg/L），因此，在煙草上它的保護(hù)作用（病菌侵染前對(duì)孢子的抑制）可能優(yōu)于治療作用（病菌侵染后對(duì)菌絲的抑制），但如何用于煙草赤星病的防治，其防治技術(shù)有待深入研究，如嘧菌酯的最宜使用劑量、使用次數(shù)、使用間隔期、藥劑在煙草上的內(nèi)吸性與傳導(dǎo)活性、殘留與持效期等。

此外，由于甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑作用靶標(biāo)單一，國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期高濃度、高頻率的使用這類(lèi)殺菌劑，已經(jīng)導(dǎo)致部分其它病原菌對(duì)包括嘧菌酯在內(nèi)的多種此類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性；因此，嘧菌酯用于煙草赤星病的防治需要遵循國(guó)際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（Fungicide Resistance Action Committee）的使用指南。

4 結(jié)論

研究結(jié)果證實(shí)嘧菌酯對(duì)赤星病菌孢子萌發(fā)的毒力（EC50值0.0540 mg/L）高于菌絲生長(zhǎng)的毒力（EC50值25.8300 mg/L）。水楊肟酸能增強(qiáng)嘧菌酯對(duì)煙草赤星病菌的毒力，且孢子萌發(fā)階段更為明顯。真菌線(xiàn)粒體電子傳遞的旁路氧化途徑存在于煙草赤星病菌中，由于對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都具有較強(qiáng)的生物活性，嘧菌酯可進(jìn)一步用于煙草赤星病的防治研究。

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Sensitivity of Alternaria alternata to azoxystrobin at the synergism of alternative oxidative inhibitor salicylhydroxamic acid

HUANG Yanfei1, CHEN Qingyuan2, WANG Jin3, XUE Juanjuan1, WANG Maosheng2, LU Hongxue1, SHANG Shenghua2,ZHANG Changqing1, WANG Hancheng2

1 College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;
2 Key Laboratory of Molecular Genetics, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China;
3 College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China

This paper investigates the sensitivity of Alternaria alternata to Azoxystrobin in the synergistic effects of alternative oxidative inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Results showed that azoxystrobin inhibited both mycelial growth and conidial germination of A.alternata, with EC50 values of 25.8300 and 0.0500 mg L-1, respectively; while in the combination of 100 mg L-1 SHAM, it showed EC50 values of 15.5200 and 0.0038 mg L-1, respectively. SHAM presented no effects on mycelial growth or conidial germination of the pathogen.Studies showed that SHAM enhanced the sensitivity of A. alternata to azoxystrobin, and alternative oxidative pathway of electron transport chain existed in pathogen A. alternata., especially in the stage of conidial germination.

tobacco brown spot; azoxystrobin; salicylhydroxamic acid; sensitivity

黃艷飛，陳慶園，王進(jìn),等. 線(xiàn)粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協(xié)同下煙草赤星病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015,21（6）

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360448、31501679）；中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（201305，201336，201436）；黔西南州煙草公司（2013-06）

黃艷飛(1989—)，在讀碩士研究生，主要從事煙草微生物研究，Email：974603170@qq.com

汪漢成(1982—)，博士，研究員，主要從事煙草植保及微生物方面的研究，Email：xiaobaiyang126@hotmail.com

張長(zhǎng)青(1960—)，教授，植物病害，Email：qingchangzhang@tom.com

2015-03-13

:HUANG Yanfei, CHEN Qingyuan, WANG Jin, et al. Sensitivity of Alternaria alternata to azoxystrobin at the synergism of alternative oxidative inhibitor salicylhydroxamic acid [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(6)