華南虎獅弓蛔蟲(chóng)三種線粒體基因的遺傳進(jìn)化分析

宋美冉，李康信，石先利，胡 偉，譚立娉，羅 琴，林麗琴，路鵬云，陳 武，李國(guó)清

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642；2. 廣州動(dòng)物園獸醫(yī)院，廣州 510075）

·研究論文·

華南虎獅弓蛔蟲(chóng)三種線粒體基因的遺傳進(jìn)化分析

宋美冉1，2，李康信1，石先利1，胡 偉1，譚立娉1，羅 琴1，林麗琴1，路鵬云1，陳 武2，李國(guó)清1

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州510642；2. 廣州動(dòng)物園獸醫(yī)院，廣州 510075）

為研究華南虎獅弓蛔蟲(chóng)（Toxascaris leonina）線粒體基因的分子特性，對(duì)來(lái)源于4只華南虎的獅弓蛔蟲(chóng)的pcox1、pnad1和pnad4三種線粒體基因進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，采用DNAStar和MEGA5.05軟件對(duì)所獲序列，以及GenBank中公布的獅弓蛔蟲(chóng)等相關(guān)序列進(jìn)行了同源性比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，4只華南虎的獅弓蛔蟲(chóng)擴(kuò)增的pcox1、pnad1、pnad4基因序列長(zhǎng)度分別為393、366、399 bp，3段基因序列種內(nèi)變異明顯低于種間變異。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，獅弓蛔蟲(chóng)可分為貓科和犬科動(dòng)物兩大分支，其中4只華南虎的獅弓蛔蟲(chóng)與已報(bào)道的孟加拉虎、東北虎、華南虎、非洲獅、猞猁的獅弓蛔蟲(chóng)聚為一支；另外狼和犬的獅弓蛔蟲(chóng)聚為一支；以pnad1、pnad4建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，虎源獅弓蛔蟲(chóng)又單獨(dú)聚為一支，表明獅弓蛔蟲(chóng)在不同虎類(lèi)之間并沒(méi)有嚴(yán)格的宿主特異性。該研究為獅弓蛔蟲(chóng)的分子鑒定和分子遺傳學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

獅弓蛔蟲(chóng)；華南虎；線粒體基因；遺傳進(jìn)化

獅弓蛔蟲(chóng)（Toxascaris leonina）是珍稀野生哺乳動(dòng)物尤其是貓科、犬科動(dòng)物（如獅、虎、豹、狐等）的一種常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，屬于線形動(dòng)物門(mén)（Nematoda）、尾感器綱（Phasmidia）、蛔目（Ascaridida）、蛔科（Ascaridae）、弓蛔屬（Toxascaris）。獅弓蛔蟲(chóng)感染可以影響虎的營(yíng)養(yǎng)代謝，造成生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至死亡［1］。其幼蟲(chóng)還可感染人，特別是獸醫(yī)、工作人員及游客［2］，屬于人獸共患寄生蟲(chóng)。線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）是真核細(xì)胞的核外環(huán)狀遺傳物質(zhì)，其特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，母系遺傳，極少發(fā)生重組，進(jìn)化速度快［3］。mtDNA在種間、種內(nèi)都具有廣泛的多態(tài)性，可作為研究種群遺傳多樣性的良好分子標(biāo)記［4］。由于線粒體基因具有較高的突變率，在同一基因組內(nèi)各基因之間突變率不同，使得這些基因在寄生性蠕蟲(chóng)分子分類(lèi)學(xué)和群體遺傳學(xué)研究中成為有用的遺傳標(biāo)記，特別是對(duì)那些隱藏種，線粒體基因比rDNA基因顯得更為有效［5，6］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)犬貓及部分野生動(dòng)物獅弓蛔蟲(chóng)的細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（cox1）、煙酰胺脫氫酶亞基I（nad1）、煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ（nad4）基因進(jìn)行了擴(kuò)增與遺傳進(jìn)化分析［7，8］。本研究通過(guò)擴(kuò)增廣州某動(dòng)物園華南虎獅弓蛔蟲(chóng)的部分線粒體基因（pcox1、pnad1、pnad4），結(jié)合GenBank上公布的其他地區(qū)不同動(dòng)物的獅弓蛔蟲(chóng)線粒體基因，分析獅弓蛔蟲(chóng)線粒體基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步開(kāi)展獅弓蛔蟲(chóng)的分子鑒定和分子遺傳學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體樣品和主要試劑 蛔蟲(chóng)樣品（T1、T2、T3、T4）分別采自廣州市某動(dòng)物園的4只華南虎的糞便，蟲(chóng)體洗滌后，置于75%酒精中-20℃保存。DNA提取試劑盒WizardTMDNA Clean Up System購(gòu)自Promega公司；ExTaq酶、DL-2000 DNA Marker、pMD18-T 載體、top10感受態(tài)細(xì)胞、IPTG和X-gal購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白酶K、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 蟲(chóng)體DNA的提取 4條蟲(chóng)體各剪取一小段，用滅菌雙蒸水沖洗3次，剪碎，加入275 μL 10%SDS DNA裂解液，混勻后放入恒溫箱中，55℃消化過(guò)夜。將消化好的蟲(chóng)體懸液按WizardTMDNA Clean Up System試劑盒使用說(shuō)明提取蟲(chóng)體DNA。

1.3 ITS序列的PCR擴(kuò)增 參照王培園等［9］設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增ITS序列，上游引物為5'-GTAGGTG AACCTGCGGAAGGATCATT-3'，下游引物為5'-TTAGTTTCTTTTCCTCCG CT-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1000 bp，上述引物由英維捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）3.0 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL、上下游引物（25 μmol/mL）各1.0 μL、模板DNA 1 μL、EX Taq酶（5U/μL）0.25 μL，ddH2O加至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 pcox1、pnad1、pnad4基因的PCR擴(kuò)增 參照Gasser等［10］設(shè)計(jì)的引物JB3（5'-TTTTTTGGGCAT CCTGAGGTTTAT-3'） 和JB4.5（5'-TAAAGAAAG AACATAATGAAAATG-3'）擴(kuò)增pcox1基因，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約450 bp。參照李明偉等［11］設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增pnad1和pnad4基因，pnad1上游引物為 5'-TTCTTATGAGATTGCTTTT-3'，下游引物為 5'-TATCATAACGAAAACGAGG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約370 bp；pnad4上游引物為 5'-TTATTATTTAATTTTTTAT-3'，下游引物為 5'-ATATGA GTAACAGAAGAATAAGC-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約400 bp。上述引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。以提取的蟲(chóng)體DNA為模板，利用相應(yīng)引物擴(kuò)增pcox1、p n a d1、p n a d4基因片段，擴(kuò)增體系均為：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL（pcox1、pnad4）/3.0 μL（pnad1）、dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL、上下游引物（25 μmol/ mL）各1.0 μL、模板DNA 1 μL、ExTaq酶（5U/μL）0.25 μL，ddH2O加至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃（cox1、nad1）/44℃（nad4）退火30 s，72℃（cox1、nad1）/68℃（nad4）延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 PCR產(chǎn)物的純化、克隆與測(cè)序 利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細(xì)胞，再涂布到含氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB平板上，無(wú)菌挑選白色單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的菌液送到北京華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 序列比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析 在GenBank中下載有關(guān)線蟲(chóng)的pcox1、pnad1及pnad4基因序列，采用DNAStar中MegAlign軟件比較華南虎獅弓蛔蟲(chóng)與其他線蟲(chóng)pcox1、pnad1及pnad4基因序列的同源性；采用MEGA5.05軟件分析不同序列間的堿基組成與變異位點(diǎn)，并用該軟件以最大似然法（maximum likelihood，ML）繪制種系發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 獅弓蛔蟲(chóng)的分子鑒定 4個(gè)樣品的ITS序列長(zhǎng)度：T1為907 bp，T2為902 bp，T3為908 bp，T4為904 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度相符。將4個(gè)樣品的序列與GenBank公布的相關(guān)蛔蟲(chóng)ITS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該4個(gè)序列與獅弓蛔蟲(chóng)（JF837175.1）的相似性最高，達(dá)99.6%以上，證實(shí)4個(gè)樣品均為獅弓蛔蟲(chóng)。

2.2 pcox1、pnad1、pnad4基因的擴(kuò)增結(jié)果 4只華南虎獅弓蛔蟲(chóng)擴(kuò)增的pcox1、pnad1、pnad4基因片段分別為450、370、400 bp，與預(yù)期大小相符，且無(wú)非特異性條帶（圖1）。

2.3 pcox1基因序列分析 4個(gè)樣本pcox1片段長(zhǎng)度均為441 bp，剔除引物后，得到393 bp的序列，其中A、T、C、G堿基含量分別為18.3%～18.6%、47.8%～48.3%、9.2%～9.7%、23.9%～24.2%。序列比對(duì)結(jié)果顯示（圖2），4個(gè)樣品之間pcox1相似率為98.7%～99.7%，與已報(bào)道的貓科動(dòng)物東北虎、非洲獅、孟加拉虎、華南虎、猞猁的獅弓蛔蟲(chóng)（登錄號(hào)分別為：JF780947.1、JF780948.1、JF780949.1、JF780950.1、JF780951.1）相似率為97.2%～100%，與犬科動(dòng)物狼、犬獅弓蛔蟲(chóng)（登錄號(hào)：JF780946.1、KC293930.1、KC293933.1、AJ920063.1、AJ920064.1）的相似率為92.6%～94.1%，與蛔科其他線蟲(chóng)（登錄號(hào)：KC543477.1、EU628682.1、AB591803.1、KC172104.1、AB591800.1）相似率為90.3%～92.6%，與蛔目其他線蟲(chóng)（登錄號(hào)：AJ616898.1、JF780943.1、AJ920062.1）的相似率為89.1%～90.6%。

圖1 獅弓蛔蟲(chóng)pcox1（A）、pnad1（B）、pnad4（C）基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplifi cation result of pcox1 （A）， pnad1 （B）and pnad4 （C） gene of Toxascaris leonina

2.4 pnad1基因序列分析 4個(gè)樣本pnad1片段長(zhǎng)度均為368 bp（包含上下游引物），A、T、C、G堿基含量分別為15.0%～15.3%、53.3%～53.6%、8.2%～8.5%、23.0%～23.2%。序列比對(duì)結(jié)果顯示，4個(gè)樣本pnad1之間的相似率為98.9%～99.7%，與已報(bào)道的貓科動(dòng)物東北虎、孟加拉虎、華南虎、非洲獅、猞猁獅弓蛔蟲(chóng)（登錄號(hào)分別為：JF833961.1、JF833963.1、JF833964.1、JF833962.1、JF833965.1）相似率為97.0%～100%，與犬科動(dòng)物狼、犬獅弓蛔蟲(chóng)（登錄號(hào)：KC293954.1、AJ937267.1、KC293967.1、JF833960.1）的相似率為91.0%～92.6%，與浣熊拜林蛔蟲(chóng)（Baylisascaris procyonis，JF951366.1）的相似率為90.7%，與犬弓首蛔蟲(chóng)（Toxocara canis，KC293923.1）和貓弓首蛔蟲(chóng)（T. cati，JF833957.1）相似率為84.2%～86.6%，與諾曼副絲蟲(chóng)（Parafilaroides normani，KJ801815.1）和疑似栓尾線蟲(chóng)（Passalurus ambiguous，KF472130.1）的相似率分別為70.8%和72.7%（圖3）。

圖2 華南虎獅弓蛔蟲(chóng)與部分其他蛔蟲(chóng)pcox1序列的同源性比對(duì)Fig.2 The homological comparison of pcox1 gene between T. leonina from the South China Tiger and partial other roundworms

2.5 pnad4基因序列分析 4個(gè)樣本pnad4片段長(zhǎng)度均為402 bp（含上下游引物），其中A、T、C、G堿基含量分別為17.0%～17.3%、49.4%～49.9%、12.0%～12.5%、20.8%～21.1%。序列比對(duì)結(jié)果顯示（圖4），4個(gè)樣本pnad4之間的相似率為99.0%～100%，與已報(bào)道的貓科動(dòng)物東北虎、孟加拉虎、華南虎、非洲獅、猞猁的獅弓蛔蟲(chóng)（登錄號(hào)分別為：JF833972.1、JF833974.1、JF833975.1、JF833973.1、JF833976.1）相似率為96.2%～100%，與來(lái)自狼、犬的獅弓蛔蟲(chóng)（登錄號(hào)：JF833971.1，AJ937630.1）相似率為89.2%～90.5%，與弓首科犬弓首蛔蟲(chóng)（AJ937618.1）、貓弓首蛔蟲(chóng)（AJ937624.1）的相似率為82.7%～84.0%，與蛔目其他線蟲(chóng)（登錄號(hào)：F J 4 2 6 2 3 6.1、A Y 9 0 9 4 6 5.1、K J 7 2 4 4 8 4.1）相似率為77.1%～79.8%。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于pcox1、pnad1、pnad4基因序列以ML法建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)基本一致（圖5），獅弓蛔蟲(chóng)可分為兩大分支，其中4條華南虎獅弓蛔蟲(chóng)（T1、T2、T3、T4）與已報(bào)道的孟加拉虎、東北虎、華南虎、非洲獅、猞猁的獅弓蛔蟲(chóng)聚為一支（▲標(biāo)記），形成一個(gè)寄生于貓科動(dòng)物的分支；另外狼和犬的獅弓蛔蟲(chóng)聚為一支（◆標(biāo)記），形成一個(gè)寄生于犬科動(dòng)物的分支；而以pnad1、pnad4建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，虎源獅弓蛔蟲(chóng)則單獨(dú)聚為一支（★標(biāo)記）。

圖3 華南虎獅弓蛔蟲(chóng)與部分其他蛔蟲(chóng)pnad1序列的同源性比對(duì)Fig.3 The homological comparison of pnad1 genes between T. leonine from the South China tiger and partial other roundworms

圖4 華南虎獅弓蛔蟲(chóng)與部分其他蛔蟲(chóng)pnad4序列的同源性比對(duì)Fig.4 The homological comparison of pnad4 genes between T. leonina from the South China Tiger and partial other roundworms

3 討論

圖5 獅弓蛔蟲(chóng)pcox1 （A）、pnad1（B）、pnad4 （C）基因以ML法建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on pcox1 （A）， pnad1 （B）， pnad4 （C） gene of T. leonina by maximum likelihood （ML） method

mtDNA在種間、種內(nèi)均具有廣泛的多態(tài)性。Feagin等［12］研究表明cox1基因序列中度保守且堿基替換率較高，可作為優(yōu)良的分子標(biāo)記。陳志港等［7］研究證實(shí)nad1是NADH氧化還原酶的第一個(gè)亞基，可從種的水平來(lái)推斷某個(gè)屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。而B(niǎo)rown等［13］和Liu等［14］的研究表明nad4變異適中，含有準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育信息，是系統(tǒng)進(jìn)化和種群遺傳研究中理想的分子標(biāo)記。本研究選取上述3段線粒體基因?qū)V州市某動(dòng)物園華南虎獅弓蛔蟲(chóng)的遺傳變異情況進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3段基因在堿基組成上均存在偏倚，其中A+T含量均明顯高于G+C含量，這與李明偉等［11］關(guān)于線粒體遺傳密碼組成偏好A、T的報(bào)道一致。4只華南虎獅弓蛔蟲(chóng)（T1、T2、T3、T4）3段線粒體基因的變異率均在0%～1.3%，與已報(bào)道的獅弓蛔蟲(chóng)線粒體基因相比，其種內(nèi)差異明顯小于與其他蛔蟲(chóng)的種間差異。貓科、犬科動(dòng)物獅弓蛔蟲(chóng)3段基因的變異率大小依次為nad4＞nad1＞cox1，這與Li等［8］的研究結(jié)果一致，支持了nad4基因變異最大，nad1基因次之，cox1基因變異最小的觀點(diǎn)。研究還發(fā)現(xiàn)，4個(gè)樣品3段基因與文獻(xiàn)報(bào)道的貓科動(dòng)物獅弓蛔蟲(chóng)的變異率明顯小于它們與文獻(xiàn)報(bào)道的犬科動(dòng)物獅弓蛔蟲(chóng)的變異率。進(jìn)化樹(shù)分析表明，貓科動(dòng)物與犬科動(dòng)物的獅弓蛔蟲(chóng)分屬于兩個(gè)不同的進(jìn)化分支。從pnad1、pnad4角度考察，4個(gè)樣品與虎源獅弓蛔蟲(chóng)的變異率均小于與貓科其他動(dòng)物獅弓蛔蟲(chóng)的變異率，而pcox1并沒(méi)有表現(xiàn)此特征。基于pnad1、pnad4基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，虎源獅弓蛔蟲(chóng)與獅子、猞猁的獅弓蛔蟲(chóng)明顯分開(kāi)，這在一定程度上反映線粒體基因nad4和nad1進(jìn)化較快，比cox1基因更適合用于寄生蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)生的研究，這與Blouin［15］對(duì)20種線蟲(chóng)的cox1和nad4基因序列的分析以及Gasser等［10］對(duì)9種帶科絳蟲(chóng)的cox1、nad1基因序列分析結(jié)果一致。

此外，本研究比較了廣州市某動(dòng)物園華南虎獅弓蛔蟲(chóng)與文獻(xiàn)報(bào)道的其他虎源獅弓蛔蟲(chóng)（均來(lái)自四川省某動(dòng)物園）3段線粒體基因的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)廣州動(dòng)物園華南虎獅弓蛔蟲(chóng)間的3段基因變異率與四川動(dòng)物園華南虎和其他虎獅弓蛔蟲(chóng)相應(yīng)基因變異率沒(méi)有明顯的區(qū)別，可能是獅弓蛔蟲(chóng)在不同虎類(lèi)之間并沒(méi)有嚴(yán)格的宿主特異性。本研究結(jié)果為獅弓蛔蟲(chóng)的分子鑒定和分子遺傳學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)具有一定的指導(dǎo)意義。

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PHYLOGENETIC ANALYSIS OF THREE MITOCHONDRIAL GENES OF TOXASCARIS LEONINA FROM SOUTH CHINA TIGER

SONG Mei-ran1，2， LI Kang-xin1， SHI Xian-li1， HU Wei1， TAN Li-ping1， LUO Qin1， LIN Li-qin1，LU Peng-yun1， CHEN Wu2， LI Guo-qing1
（1. College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Veterinary Hospital of Guangzhou Zoo， Guangzhou 510075， China）

In order to study the molecular characteristics of mitochondrial gene of Toxascaris leonina from South China tigers， three mitochondrial genes， pcox1， pnad1 and pnad4 were amplifi ed， cloned and sequenced. The sequence similarities and genetic evolutional relationship among T. leonina strains were analyzed by the DNAStar and MEGA version 5.05 software. The results showed that the sequence lengths of pcox1， pnad1 and pnad4 genes of four samples were 393 bp， 366 bp and 399 bp， respectively， and their intra-specifi c diff erences were signifi cantly lower than inter-specifi c diff erences. The phylogenetic trees based on the three genes demonstrated that the T. leonina were divided into two groups， one comprising isolates from feline， the other comprising those from canine. In phylogenetic trees based on pnad1 and pnad4， all the T. leonina isolates from tigers located in same small clade. These results indicated that there might be no host specifi city between T. leonina from diff erent tigers. The present study highlighted the research of molecular identifi cation and genetic characterization of T. leonina.

Toxascaris leonina； South China tiger； mitochondrial genes； phylogenetic analysis

S852.65

A

1674-6422（2015）06-0068-08

2015-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272551）

宋美冉，女，碩士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲(chóng)研究

李國(guó)清，E-mail：ggLi@scau.edu.cn；陳武，E-mail：guangzhouchenwu@sina.com