皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察

陳 成，魏 東，李恪梅，付麗麗，黃長江，王國治*

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江溫州 325035；2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室，北京 100050）

皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察

陳 成1，2，魏 東2，李恪梅2，付麗麗1，2，黃長江1*，王國治1，2*

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江溫州 325035；2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室，北京 100050）

以小鼠為動物模型，通過檢測皮下注射布氏菌活疫苗后小鼠產(chǎn)生長期的體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答及保護(hù)力，對其進(jìn)行免疫學(xué)評價。將120只小鼠隨機(jī)分為3組，皮下注射免疫布氏菌活疫苗，分別在免疫后1，3，6，12個月，采血分離血清及脾臟淋巴細(xì)胞。ELISA法檢測免疫動物血清中抗Br-PPD IgG抗體；ELISPOT法檢測分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目，以及用ELISA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平；用羊布氏菌弱毒株M 5攻擊免疫動物，通過脾臟細(xì)菌計數(shù)評價布氏菌活疫苗的免疫保護(hù)力。皮下注射免疫布氏菌活疫苗，免疫1，3，6和12個月，均能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，體液免疫、細(xì)胞免疫及保護(hù)力呈先增強(qiáng)后減弱趨勢，免疫3個月效果最佳。通過皮下注射方式免疫小鼠布氏菌活疫苗顯示了很好的免疫原性，免疫后能誘導(dǎo)長期的體液免疫、細(xì)胞免疫及保護(hù)力。

布氏疫苗；體液免疫；細(xì)胞免疫；保護(hù)力

布魯氏菌簡稱布氏菌（Brucella），是革蘭氏陰性短小球桿菌。布魯氏菌屬分為6種:羊種布魯氏菌（Br.Melitensis）、牛種布魯氏菌（Br. Abortus）、豬種布魯氏菌（Br.Suis）、犬種布魯氏菌（Br.Cains）、綿羊附睪布魯氏菌（Br.Ovis）和沙林鼠種布魯氏菌（Br.Neotomae）。近幾年來，發(fā)現(xiàn)了4種新的布魯氏菌，分別是鰭腳目種（Br. Pinnidialis）、鯨魚種（Br.Ceti）、田鼠種（Br. M icroti）、小云雀種（Br.InoPinata）［1-3］。

布魯氏菌病（簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮僖鸬囊活惾诵蠊不技膊?，在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌具有高度的感染性，主要經(jīng)過消化道、皮膚黏膜和呼吸道等途徑侵入機(jī)體而發(fā)生感染和發(fā)病。布魯氏菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的病原菌，主要寄生于網(wǎng)狀淋巴組織，造成免疫系統(tǒng)病理進(jìn)程，并常伴隨有菌血癥，對生殖、神經(jīng)和骨骼系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害［4］。布病常呈地方性流行，人主要通過皮膚接觸、呼吸道和消化道感染，以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴(yán)重［5-6］，豬種布魯氏菌和犬種布魯氏菌感染人較為罕見，綿羊附睪布魯氏菌和沙林鼠種布魯氏菌基本不感染人。人感染則主要引起波浪熱和轉(zhuǎn)化為慢性感染［7-8］，家畜感染后可引發(fā)母畜流產(chǎn)和不育。對布病的防治，目前主要以接種疫苗為主，我國采用的人用布氏菌活疫苗［9］為牛種弱毒株104M菌株，該菌株免疫原性好，安全性高。目前，布氏菌活疫苗采用皮上劃痕接種，受種者接受性差，且進(jìn)入人體的有效劑量難以控制。

本次研究主要采用皮下注射免疫途徑對小鼠進(jìn)行布氏菌活疫苗長期免疫學(xué)評價。免疫1，3，6和12個月后，通過體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力試驗結(jié)果來評價疫苗免疫效果，為注射用布氏菌活疫苗的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物

SPF級BALB/C小鼠，6～8周齡，雌性，共120只，由中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK（京）2009-0017，飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

1.1.2 菌株

皮下注射用布氏菌活疫苗104M菌株及羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

1.1.3 實驗儀器

Bio-Ⅱ-A生物安全柜購自西班牙Telstar公司；Dragon-MK3酶標(biāo)儀購自芬蘭Labsystems公司；DH6000 AB型恒溫培養(yǎng)箱購自天津市泰斯特儀器公司；高速離心機(jī)購自德國ePPendorf；ImmunoSPot Analyzer購于CTL ImmunSPot；CO2培養(yǎng)箱購于NaPco Scientific ComPany；加樣槍購于Gilson公司。

1.1.4 試劑耗材

牛血清白蛋白和ConA購自美國Sigma公司；ELISPOT試劑盒Mouse IFN-γELISPot Kit購自美國BD公司；達(dá)優(yōu)-淋巴細(xì)胞分離液、無血清培養(yǎng)基、IFN-γ及IL-4 ELISA預(yù)包被試劑盒均購自達(dá)科為生物技術(shù)公司；辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；TMB底物顯色液購自美AMRESCO公司；Br-PPD（布魯氏菌純蛋白衍生物）由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫

將120只BALB/C小鼠隨機(jī)分成3組，每組40只，分別為布氏菌活疫苗104M低劑量組（5× 107個菌·只-1）與高劑量組（2×108個菌·只-1），生理鹽水對照組，3組均為后肢皮下注射，劑量為0.2 m L·只-1。

1.2.2 動物血清和脾臟淋巴細(xì)胞的制備

免疫1，3，6和12個月后，分別對每組5只小鼠進(jìn)行摘眼球取血，分離血清，20℃保存，用于抗體水平檢測。將每只動物無菌取出的脾臟放在篩網(wǎng)上，滴加淋巴細(xì)胞分離液研磨，研磨液用巴氏管吸入到15 mL離心管中，滴加200～500μL達(dá)優(yōu)-無血清培養(yǎng)基進(jìn)行低速離心，在25℃條件下，800 g離心30 m in，吸出淋巴細(xì)胞層，加入10 m L無血清培養(yǎng)基，顛倒洗滌，室溫，250 g離心收集細(xì)胞，用于ELISPOT細(xì)胞免疫的檢測。

1.2.3 體液免疫檢測

用間接ELISA法檢測免疫1，3，6和12個月后小鼠血清抗Br-PPD IgG的效價。以Br-PPD蛋白4μg ·m L-1的濃度包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；以PBS-T 300μL洗板5次，用1%的BSA封閉（200μL·孔-1），37℃靜置1 h；每孔加入100μL的50×開始倍比稀釋的待檢血清，37℃靜置1 h；按1∶5000倍稀釋辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，洗板后每孔加入100μL，37℃靜置1 h；洗板，加入100μL·孔-1的TMB底物顯色液，室溫避光15 min后，在波長為450 nm處檢測吸光值D450。

1.2.4 細(xì)胞免疫檢測

分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)目檢測。小鼠免疫1，3，6和12個月后，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加混有2.0×106個·mL-1濃度細(xì)胞100μL，分別加入100 μL布氏Br-PPD抗原（終濃度為10μg·m L-1）刺激，做復(fù)孔，另用細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對照，一孔加ConA作陽性對照（終濃度為5μg·m L-1）。共同孵育22 h后，按ELISPOT操作依次加入檢測抗體等試劑，洗板，顯色，計數(shù)斑點數(shù)。

體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子產(chǎn)生水平檢測。取48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加2.0×106個· m L-1濃度細(xì)胞400μL，每孔分別加入50μL布氏Br-PPD抗原（終濃度為10μg·m L-1）刺激。分別以ConA（終濃度為5μg·m L-1）和培養(yǎng)基為陽性和陰性對照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育22 h，孵育完畢后，對培養(yǎng)物進(jìn)行離心，取各孔細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用小鼠IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒檢測體外刺激物刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4的情況。

1.2.5 布魯氏菌活疫苗長期免疫保護(hù)力檢測

對免疫1，3，6和12個月后每組動物皮下攻擊羊種布魯氏菌M5弱毒株，攻擊劑量為5×108只-1，攻擊部位為后肢皮下。攻擊4周后斷頸處死動物，無菌取脾臟，通過脾臟細(xì)菌計數(shù)評價布魯氏菌活疫苗皮下注射的免疫保護(hù)力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以ˉX±S表示，各組動物的效價取以10為底的對數(shù)后進(jìn)行t檢驗；用GraPhPad Prism 6繪圖及SPSS統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清中抗Br-PPD IgG水平測定

小鼠血清用間接ELISA方法測抗體水平，結(jié)果顯示，陰性組小鼠檢測不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出抗體，但整體滴度不高，同一免疫時間點，低、高劑量組IgG效價水平無顯著性差異（P＞0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月抗體效價呈先上升再下降趨勢，結(jié)果表明，隨著免疫時間增加，體液免疫應(yīng)答先增強(qiáng)后減弱。結(jié)果見圖1。

圖1 血清IgG抗體效價

2.2 酶聯(lián)免疫斑點（ELISOPT）結(jié)果

將以形成斑點的96孔板終止反應(yīng)，自然風(fēng)干過夜后上機(jī)計數(shù)并拍照，對每孔內(nèi)的斑點進(jìn)行質(zhì)控。最終斑點計數(shù)顯示低劑量組和高劑量組在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ總體數(shù)量呈下降趨勢；IL-4數(shù)量相對較少，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ斑點數(shù)目

圖3 脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-4斑點數(shù)目

2.3 體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子檢測結(jié)果

利用ELISA方法檢測以Br-PPD抗原體外刺激小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的含量明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-γ含量呈先上升后下降的趨勢，免疫3個月分泌量最高；IL-4含量呈先下降后上升的趨勢，但總體含量較低，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-γ含量

圖5 脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-4含量

2.4 布氏菌活疫苗免疫保護(hù)力檢測結(jié)果

為評價皮下注射布氏菌活疫苗的長期免疫保護(hù)力，用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻擊免疫動物，以脾臟布氏菌分離數(shù)為指標(biāo)。結(jié)果顯示，在同一免疫時間點，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)明顯低于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)呈先減少后增加趨勢，表明免疫3個月保護(hù)力最強(qiáng)，隨后免疫保護(hù)力隨時間延長逐漸減弱，結(jié)果見圖6。

圖6 羊布氏菌M5攻擊感染后脾臟中的細(xì)菌載量

3 小結(jié)和討論

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，家畜感染后導(dǎo)致流產(chǎn)，人感染后引發(fā)波狀發(fā)熱、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和骨髓炎。機(jī)體對布氏菌的清除依賴于體液免疫和細(xì)胞免疫的聯(lián)合作用。布氏菌感染宿主后被APC提呈給吞噬細(xì)胞，同時激發(fā)APC分泌IL-12、IL-4細(xì)胞因子，引起Th0細(xì)胞（CD4+）分別分化Th1和Th2細(xì)胞［10-11］。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ激活吞噬細(xì)胞的吞噬功能，參與細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌IL-4細(xì)胞因子主要參與體液免疫［12-13］。

本試驗以低、高劑量皮下免疫布氏菌活疫苗，免疫1個月、3個月、6個月、12個月后分別檢測抗體水平，結(jié)果顯示，陰性組小鼠檢測不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出抗體，但整體滴度不高，同一免疫時間點，低、高劑量組IgG效價水平相近；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月抗體效價呈先上升再下降趨勢，即1～3個月體液免疫在逐漸增強(qiáng)，到達(dá)3～6個月整體水平相對較穩(wěn)定，隨后6～12個月衰減。細(xì)胞免疫ELISPOT檢測結(jié)果顯示，在Br-PPD抗原刺激下分泌IFN-γ和IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯多于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ總數(shù)目呈下降趨勢；IL-4水平相對較低。ELISA方法檢測體外刺激細(xì)胞因子檢測顯示，在Br-PPD抗原刺激下分泌的IFN-γ、IL-4的含量明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月脾臟脾細(xì)胞分泌IFN-γ含量呈先上升后下降的趨勢，免疫3個月含量最高；分泌IL-4含量呈先下降后上升的趨勢，免疫3個月含量最低，但與IFN-γ含量相比總體含量較低。本次試驗細(xì)胞免疫結(jié)果顯示，在Br-PPD抗原刺激下，檢測到分泌IFN-γ脾細(xì)胞數(shù)目及含量遠(yuǎn)高于IL-4，結(jié)果表明參與細(xì)胞免疫應(yīng)答主要以Th1型為主，Th2型為輔。

疫苗的效力試驗是評價疫苗免疫保護(hù)力最可靠的指標(biāo)。傳統(tǒng)布氏疫苗的效力評價主要是使用豚鼠，效力實驗用強(qiáng)毒株攻擊，本次研究參照中國藥典效力測定的方法［14］，以小鼠為動物模型，使用羊布氏菌M5弱毒株攻擊，大大提高了實驗的經(jīng)濟(jì)性和安全性。結(jié)果顯示，在同一免疫時間點，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)明顯低于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；從長期免疫效果來看，免疫1，3，6，12個月，低劑量組和高劑量組動物脾臟載菌數(shù)均呈先減少后增加趨勢，免疫3個月低、高劑量脾臟分離不出攻擊株，表明免疫3個月保護(hù)力達(dá)到最強(qiáng)，隨后免疫保護(hù)力隨時間延長逐漸減弱，這一點與細(xì)胞免疫中IFN-γ含量結(jié)果基本一致。高劑量免疫組，在免疫后6～12個月脾臟載菌數(shù)明顯低于低劑量，顯示出一定效量關(guān)系?？傮w上，免疫后12個月的保護(hù)力與免疫后1個月基本持平，表明該疫苗長期保護(hù)力較好。

本次試驗是皮下注射布氏菌活疫苗長期免疫學(xué)評價及免疫保護(hù)力的初步研究，試驗表明，布氏疫苗采用皮下免疫途徑是可行的，免疫后能長時間獲得很好的免疫效果，因此皮下注射用布氏菌活疫苗有希望成為新一代布氏疫苗，不但接種方式簡單，而且接種劑量更低、長期誘導(dǎo)機(jī)體免疫，至于能否真正應(yīng)用于人用疫苗，還有待強(qiáng)毒布魯氏菌攻擊保護(hù)試驗和臨床試驗進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

S 852.61+4，R 378.5

A

0528-9017（2015）03-0412-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20150341

2014-12-19

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2014ZX09304311-002）人獸共患病鼠疫、布氏等疫苗評價技術(shù)研究

陳 成（1989-），男，安徽安慶人，碩士生，研究方向為生物學(xué)。E-mail:ccbioteam@sina.com。

王國治。E-mail:tbtestlab@viP.tom.com；黃長江。E-mail:cjhuang5711@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式:陳成，魏東，李恪梅，等.皮下注射布氏菌活疫苗免疫持久性觀察［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（3）:412-416.