miR-181d對(duì)小細(xì)胞肺癌化療藥物敏感性的影響

王云濤白義鳳胡洪林許峰

·臨床研究與應(yīng)用·

miR-181d對(duì)小細(xì)胞肺癌化療藥物敏感性的影響

王云濤①白義鳳②胡洪林②許峰①

目的：探討miR-181d在調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌化療敏感性中的作用。方法：通過QRT-PCR和Western blot檢測(cè)小細(xì)胞肺癌敏感細(xì)胞株H69及耐藥細(xì)胞株H69AR中miR-181d的差異表達(dá)。上調(diào)H69AR細(xì)胞中的miR-181d表達(dá)，檢測(cè)miR-181d和BCL2表達(dá)；通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞對(duì)各種化療藥物（ADM、DDP、VP-16）的敏感性變化，QRT-PCR檢測(cè)87例小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中miR-181d表達(dá)，所有患者均接受EP方案（依托泊苷+順鉑）化療，分析其與患者預(yù)后及生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果：miR-181d在H69AR及對(duì)化療耐藥患者中呈低表達(dá)，同時(shí)伴隨著BCL2高表達(dá)（P＜0.001）。上調(diào)miR-181d能降低BCL2表達(dá)水平，增加H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物（ADM、DDP、VP-16）的敏感性（P＜0.01）。miR-181d的表達(dá)與腫瘤的分期、對(duì)化療藥物的敏感性及生存時(shí)間相關(guān)（P＜0.001），高表達(dá)miR-181d的患者總生存時(shí)間（OS）和無進(jìn)展生存時(shí)間（DFS）較低表達(dá)者延長(zhǎng)（P＜0.001）。結(jié)論：miR-181d可能在小細(xì)胞肺癌多藥耐藥中發(fā)揮著重要的作用，miR-181d可望作為評(píng)價(jià)小細(xì)胞肺癌療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

小細(xì)胞肺癌 miR-181d 多藥耐藥

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是一種惡性程度很高的肺癌，以生長(zhǎng)迅速、早期轉(zhuǎn)移、高度侵襲性為特點(diǎn)。由于絕大多數(shù)患者于確診時(shí)已伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且無手術(shù)治療指征，故化療和放療成為其主要治療方法。小細(xì)胞肺癌的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療都非常敏感，但數(shù)十年來多方案的臨床試驗(yàn)并未找到徹底治愈小細(xì)胞肺癌的有效方法，多數(shù)患者在一線治療以后因化療耐藥導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后差，因此小細(xì)胞肺癌的多藥耐藥已成為目前亟待解決的問題［1-2］。miR-181d是一個(gè)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，功能涉及生物體免疫、炎癥、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及分化等病理生理的過程［3］。

前期有研究通過基因芯片發(fā)現(xiàn)miR-181d在SCLC耐藥細(xì)胞株中呈低表達(dá)［4］，然而關(guān)于其在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與多藥耐藥的關(guān)系及可能的機(jī)制目前尚未見相關(guān)報(bào)道?；蛐畔W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-181d與BCL2之間有靶向作用關(guān)系，本研究通過檢測(cè)miR-181d與BCL2在SCLC耐藥細(xì)胞株及組織中的表達(dá)，進(jìn)一步分析其對(duì)SCLC多藥耐藥的影響及臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般資料

收集2009年1月至2014年1月在四川省人民醫(yī)院及成都市第五醫(yī)院行手術(shù)切除的小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本87例，其中男性49例、女性38例；患者年齡30～82歲，中位年齡55歲，55歲以下患者44例，55歲以上患者43例；廣泛期45例，局限期42例；化療敏感者43例，化療耐藥者44例，組織標(biāo)本放入液氮冷凍后，用錫紙包裹，在研缽中充分研磨，研磨后用Trizol反復(fù)洗滌研磨的碎末，用經(jīng)DEPC水處理后的凍存管收集，放入液氮，用時(shí)提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。所有病例術(shù)前均未行放化療，臨床資料完整，患者未并發(fā)其他系統(tǒng)疾病。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為小細(xì)胞肺癌，87例患者均接受EP方案（依托泊苷+順鉑）化療。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化療5～6個(gè)周期后腫瘤完全緩解或部分緩解定義為化療敏感者，化療5～6個(gè)周期后疾病穩(wěn)定或進(jìn)展者定義為化療耐藥者［5］。全部87例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話和門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀和影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2014年9月30日，截止隨訪終止時(shí)，生存病例41例，死亡病例46例，無失訪病例。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69及耐藥細(xì)胞株H69AR均來自美國(guó)ATCC公司。用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基為細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2建立穩(wěn)定表達(dá)miR-181d的細(xì)胞株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%匯合時(shí)，加入包含miR-181d的前體表達(dá)質(zhì)粒（中國(guó)上海Ambion），用LipofectamineTM2000和OPTI-MEMI（美國(guó)Invitrogen）分別將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-181d的細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白和RNA備用。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析miR-181d的表達(dá)收集SCLC細(xì)胞，同時(shí)收集SCLC組織及癌旁組織（50～100 mg）在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨（樣品總體積不超過所用Trizol體積的10%），分別移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。取上述準(zhǔn)備的RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣。用于特異擴(kuò)增miR-181d的引物和試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。以U6 snRNA作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

1.2.4Western blot檢測(cè)BCL2蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，每孔中加樣50 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%BSA/TBST室溫封閉1 h，加入鼠抗人BCL2單克?。?:200）孵育，4℃過夜。TBST漂洗3次，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5 000）孵育，室溫2 h，TBST漂洗3次，ECL檢測(cè)，暗室曝光10 s至10 min，顯影。

1.2.5CCK8法檢測(cè)藥物敏感性收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后重懸，計(jì)數(shù)后按5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積100 μL。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染miR-181d過表達(dá)質(zhì)粒，每孔總體積100 μL。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別將化療藥物（ADM、DDP、VP-16）加入培養(yǎng)基中并進(jìn)行倍比稀釋，并設(shè)不加藥物的陽(yáng)性對(duì)照孔，每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)副孔。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入CCK8反應(yīng)液，在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀上測(cè)得450 nm吸光度，計(jì)算存活率。

存活率=藥物濃度的A值的平均值-空白孔A值/不含藥物的陽(yáng)性對(duì)照組A值。

根據(jù)不同藥物濃度細(xì)胞存活率，繪制對(duì)數(shù)曲線，計(jì)算細(xì)胞生存率50%時(shí)的藥物濃度（IC50）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或One-way ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料、miR-181d的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)；生存分析用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-181d基因在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)

QRT-PCR法檢測(cè)miR-181d在H69、H69AR細(xì)胞及43例化療敏感與44例化療耐藥的SCLC組織中的表達(dá)，結(jié)果提示miR-181d在化療耐藥細(xì)胞株H69AR中的表達(dá)明顯低于化療敏感細(xì)胞株H69，差異具有統(tǒng)

計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A）。miR-181d在化療耐藥患者組織標(biāo)本中的表達(dá)較化療敏感者明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1B）。

圖1 QRT-PCR檢測(cè)miR-181d在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及組織標(biāo)本中的表達(dá)Figure 1Expression of miR-181d in the SCLC cells and tissues was detected by QRT-PCR

2.2BCL2在H69與H69AR細(xì)胞株中的差異表達(dá)

QRT-PCR及Western blot提示H69AR細(xì)胞株中無論是BCL2基因還是蛋白表達(dá)較H69細(xì)胞明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A，B，P＜0.001）。

圖2 QRT-PCR和Western blot檢測(cè)H69及H69AR細(xì)胞中BCL2的表達(dá)Figure 2Expression of BCL2 in H69 and H69AR was detected by QRTPCR and Western blot

2.3轉(zhuǎn)染miR-181d過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)細(xì)胞株中miR-181d的表達(dá)

通過轉(zhuǎn)染miR-181d過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)細(xì)胞株中miR-181d的表達(dá)，通過QRT-PCR檢測(cè)miR-181d的表達(dá)。H69AR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181d過表達(dá)質(zhì)粒后，與空白對(duì)照H69AR及陰性對(duì)照H69AR-NC比較，H69AR-eGFP-miR-181d細(xì)胞中miR-181d的表達(dá)上調(diào)7.584倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3A）；與空白對(duì)照及陰性對(duì)照組比較，H69AR-eGFP-miR-181d細(xì)胞中BCL2的表達(dá)無論是在基因水平還是蛋白水平均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3B，C）。

圖3 通過轉(zhuǎn)染eGFP-miR-181d上調(diào)miR-181d的表達(dá)后BCL2的表達(dá)變化Figure 3Expression of BCL2 was measured after H69AR cells were transfected with eGFP-miR-181d

2.4細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化

CCK8檢測(cè)顯示H69AR細(xì)胞轉(zhuǎn)染eGFP-miR-181d后對(duì)順鉑（DDP），阿霉素（ADM）及依托泊苷（VP-16）的敏感性明顯增加，IC50值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，P＜0.01）。

2.5下調(diào)細(xì)胞中miR-181d的表達(dá)，細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化

通過轉(zhuǎn)染miR-181d的抑制劑下調(diào)H69細(xì)胞株中miR-181d的表達(dá)，QRT-PCR檢測(cè)miR-181d的抑制劑的表達(dá)。H69細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181d的抑制劑后，與空白對(duì)照H69及陰性對(duì)照H69-inhibitor-NC比較，H69-miR-181d的抑制劑中miR-181d的表達(dá)下降了82.164%，差

異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖5A）。下調(diào)miR-181d的表達(dá)后，CCK8檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑（DDP），阿霉素（ADM）及依托泊苷（VP-16）敏感性的變化，結(jié)果提示H69-miR-181d-inhibitor組細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性較NC組及H69組明顯降低，IC50值明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001，圖5B）。

圖4 通過轉(zhuǎn)染eGFP-miR-181d上調(diào)miR-181d的表達(dá)后細(xì)胞對(duì)化療藥物（DDP，ADM及VP-16）敏感性的變化。P＜0.01.DDP：順鉑；ADM：阿霉素；VP-16：依托泊苷Figure 4Sensitivities of cells to chemotherapy drugs（DDP，ADM，and VP-16）were measured after H69AR cells were transfected with eGFP-miR-181d，**P＜0.01.DDP，Cis-platinum；ADM，Adriamycin；VP-16，Etoposide

圖5 通過轉(zhuǎn)染miR-181d抑制物下調(diào)miR-181d的表達(dá)后細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化Figure 5Sensitivities of cells to chemotherapy drugs were measured after H69 cell transfection with miR-181d-inhibitor

2.5miR-181d在SCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

miR-181d在小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果提示miR-181d在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織中的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖6）。miR-181d的表達(dá)與患者的性別、年齡無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與疾病的分期、患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)及生存時(shí)間相關(guān)，miR-181d在局限期（LD）患者中的表達(dá)較廣泛期（ED）患者高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.017，P＜0.001）。miR-181d在耐藥患者中的表達(dá)較化療敏感患者中的低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.884，P＜0.001）。miR-181d在生存患者中的表達(dá)較死亡患者增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=27.418，P＜0.001，表1）。

圖6 miR-181d在小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果提示miR-181d在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織中的表達(dá)明顯降低，**P＜0.001Figure 6Differential expression of miR-181d in SCLC and paraneoplastic tissues，**P＜0.001

表1 miR-181d的表達(dá)與87例患者臨床病理特征的關(guān)系Table1Association of miR-181d expression with clinicopathologic parameters

2.6SCLC患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-181d的患者的總生存時(shí)間（OS）為31.563個(gè)月，較低表達(dá)者的18.809個(gè)月明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.415，P＜0.001，圖7A）。高表達(dá)miR-181d的患者的無進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）為21.665個(gè)月，較低表達(dá)者8.922個(gè)月明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.642，P＜0.001，圖7B）。

圖7 miR-181d在SCLC中的表達(dá)意義及與患者生存時(shí)間的關(guān)系Figure 7Relationship between miR-181d expression in SCLC and patients'survival time

3 討論

我國(guó)肺癌發(fā)病率逐年增加，SCLC發(fā)病率占原發(fā)性肺癌的15%～20%，多年來的研究主要集中在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）治療上，而SCLC的發(fā)病率增長(zhǎng)，數(shù)十年來治療無明顯突破。盡管小細(xì)胞肺癌患者對(duì)化療敏感，但很快出現(xiàn)的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，極易復(fù)發(fā)［4，6-7］。因此，明確小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥機(jī)制，成為臨床上治療SCLC及提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間亟需解決的重要問題。

miRNA是長(zhǎng)度約22 nt的單鏈非編碼RNA，其主要作用在于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控成百上千個(gè)基因的表達(dá)，因而具有廣泛的生物學(xué)功能，miRNA的異常表達(dá)的是不同類型腫瘤的一個(gè)共同的特征，并且在不同的腫瘤中有其特征性的表達(dá)譜，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為有著重要的影響［8-9］。miRNA-181是一個(gè)在生物進(jìn)化中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)因子，在人類基因組中，miR-181家族成員包括miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b-2、miR-181b-2、miR-181c和miR-181d［10］。miR-181最早是在小鼠B淋巴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)其特異高表達(dá)，且能調(diào)控早期造血系統(tǒng)的形成［11］。miR-181在小鼠胸腺、腦、肺等器官中高表達(dá)，骨髓和脾臟中也可檢測(cè)出其存在，而在造血前體細(xì)胞中低表達(dá)［12-13］。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR和肺癌耐藥細(xì)胞株A549/CDDP中低表達(dá)，上調(diào)miR-181b的表達(dá)能增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［14］；miR-181b的缺失可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，上調(diào)miR-181b的表達(dá)，可增加肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物多柔比星的抵抗［15］；miR-181d在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-181d的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，miR-181d通過靶向作用于K-ras和miR-181d基因相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮腫瘤抑制劑作用［16］。miRNA-181通過調(diào)節(jié)DAX-1基因的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖［17］，上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-181a/b/c/d任何亞單位的表達(dá)都能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性［18］。miR-181d通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）的表達(dá)，可作為膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺敏感性預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物［19］。miR-181在對(duì)順鉑耐藥的肺腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)［20］，然而關(guān)于miR-181與小細(xì)胞肺癌耐藥的相關(guān)性目前研究少。本研究發(fā)現(xiàn)miR-181d在小細(xì)胞肺癌多藥耐藥細(xì)胞株H69AR中呈低表達(dá)，同時(shí)伴隨著BCL2的高表達(dá)。過表達(dá)miR-181d降低BCL2的表達(dá)水平，增加H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物（ADM、DDP、VP-16）的敏感性。本研究結(jié)果提示miR-181d可能通過影響B(tài)CL2的表達(dá)參與調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌化療敏感性。

越來越多的研究證實(shí)miR-181在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，一項(xiàng)關(guān)于miR-181a在直腸癌組織及正常直腸組織中的差異表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-181a的患者的組織分化低，總生存時(shí)間及無進(jìn)展生存時(shí)間縮短［21］。一項(xiàng)納入11個(gè)研究1 252例患者的Meta分析結(jié)果顯示，針對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的miR-181a/b表達(dá)與患者總生存時(shí)間及風(fēng)險(xiǎn)比的關(guān)系中，高表達(dá)miR-181a/b能夠延長(zhǎng)患者總生存時(shí)間（HR= 0.717，P＜0.000 1），但miR-181a/b的表達(dá)對(duì)生存時(shí)間的影響在各種腫瘤之間無差異（HR=0.861，P= 0.356）［22］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-181d在耐藥患者組織中低表達(dá)，高表達(dá)miR-181d的患者的總生存時(shí)間（OS）和無進(jìn)展生存時(shí)間（DFS）較低表達(dá)者顯著延長(zhǎng)，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)miR-181d的表達(dá)與腫瘤的分期、對(duì)化療藥物的敏感性及生存時(shí)間相關(guān)（P＜0.001），高表達(dá)miR-181d的患者的總生存時(shí)間（OS）和無進(jìn)展生存時(shí)間（DFS）較低表達(dá)者延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果提示miR-181d通過調(diào)節(jié)BCL2的表達(dá)與患者的化療敏感性及生存時(shí)間和臨床預(yù)后相關(guān)，然而影響SCLC化療敏感性和臨床預(yù)后的因素很多，miR-181d是通過何種途徑影響SCLC的發(fā)生、發(fā)展及其機(jī)制目前尚未完全闡明，值得進(jìn)一步研究。

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（2015-01-22收稿）

（2015-03-02修回）

（編輯：楊紅欣）

Effect of miR-181d on chemo-sensitivity in human small cell lung cancer

Yuntao WANG1,Yifeng BAI2,Honglin HU2,Feng XU1

Feng XU;E-mail:fengxuster@gmail.com

Objective:To investigate the possible role of miR-181d in regulating the multidrug resistance(MDR)of small cell lung cancer(SCLC)and its clinical significance.Methods:Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction(QRT-PCR) and Western blot were used to investigate the differential expression of miR-181d and BCL2 from mRNA and protein levels in the chemo-sensitivity cell H69 and the chemo-resistance cell H69AR.The miR-181d expression in H69AR was then upregulated.Moreover,CCK8 assay was employed to detect the sensitivities of the cells to chemotherapy drugs,such as ADM,DDP,and VP-16.Meanwhile,the expression of miR-181d in the specimens of 87 cases with SCLC were detected using QRT-PCR.All patients received the chemotherapeutic regimen of EP(etoposide+cisplatin).Correlation of the miR-181d expression with clinicopathological features,prognosis,and survival time of the patients was studied.Results:miR-181d was downregulated in the SCLC multidrug-resistant cell line H69AR and chemo-resistant patients.Moreover,miR-181d was concurrent with the upregulation of BCL2 protein compared with the parental H69 cell line and chemo-sensitive patients(P<0.001).miR-181d expression in H69 cells resistant to chemotherapy drugs (ADM,DDP,and VP-16)was inhibited(P<0.01).Enforced miR-181d expression reduced the BCL2 protein level and sensitized H69AR cells to chemotherapy drugs(P<0.01).miR-181d expression was associated with tumor stage,sensitivity of chemotherapy,and survival time(all P<0.001).Patients with high miR-181d expression had longer overall survival and progress-free survival time compared with those with low miR-181d expression(P<0.001).Conclusion:miR-181d may play a role in the development of MDR in SCLC and may be a potential predictive factor for treatment efficacy.

small cell lung cancer,miR-181d,multidrug resistance

10.3969/j.issn.1000-8179.20150125

①四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院腫瘤中心（成都市610041）；②四川省人民醫(yī)院

許峰fengxuster@gmail.com

1Cancer Center，Sichuan University West China Hospital，Chengdu 610041；2Department of Oncology，Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610000，China

王云濤專業(yè)方向?yàn)槟[瘤放化療敏感性研究。

E-mail：515190980@qq.com