CD46 CD55 CD59在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義

顧勇楊艷尚玉龍孟宏濤

·臨床研究與應(yīng)用·

CD46 CD55 CD59在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義

顧勇①楊艷②尚玉龍②孟宏濤①

目的：檢測(cè)CD46、CD55、CD59在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性及意義。方法：選取有詳細(xì)性別、年齡、組織分化、病理分期、腫瘤部位、組織類型資料的組織芯片標(biāo)本，包括121例結(jié)腸癌和121例癌旁結(jié)腸組織，均為2004年10月至2006年6月第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)改良二步法分別檢測(cè)CD46、CD55、CD59的表達(dá)情況。結(jié)果：CD46、CD55及CD59在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率均顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P＜0.001）。CD46表達(dá)水平與性別、年齡、組織分化、TNM病理分期、腫瘤位置、病理組織類型均無關(guān)（P＞0.05）。CD55、CD59的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤位置、病理類型無關(guān)（P＞0.05），而與組織分化、TNM病理分期有關(guān)（P＜0.05）。其表達(dá)強(qiáng)度陽性率中低分化組明顯高于高分化組（P＜0.05）。TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期患者腫瘤病理組織強(qiáng)陽性表達(dá)率高于Ⅰ、Ⅱ期陽性表達(dá)率，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：CD46、CD55及CD59在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，特別是CD55、CD59的表達(dá)與腫瘤分化、病理分期相關(guān)，提示三者表達(dá)水平與結(jié)腸癌生物學(xué)行為密切相關(guān)。

CD46 CD55 CD59 結(jié)腸癌 免疫組織化學(xué)

隨著單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）介導(dǎo)的腫瘤免疫治療應(yīng)用于臨床，補(bǔ)體效應(yīng)系統(tǒng)的作用日益受到重視，mAb主要通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）、補(bǔ)體激活介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）等途徑間接或直接殺傷并抑制腫瘤細(xì)胞生長，而后者的作用更為重要［1-2］。補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性針對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用，是

破壞性的、不可逆的，補(bǔ)體激活受補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（complement regulatory proteins，CRPs）調(diào)控。膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins，mCRPs）是CRPs存在的一種形式。mCRPs主要包括CD46、CD55和CD59，也稱作膜輔蛋白（membrane cofactor protein，MCP），幾乎在所有類型的細(xì)胞中都有表達(dá)。已有研究顯示，mCRPs在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞逃避補(bǔ)體的攻擊，產(chǎn)生免疫逃逸［3-4］。目前mCRPs在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與調(diào)控作用報(bào)道很少。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸癌組織中CD46、CD55、CD59的表達(dá)情況，為進(jìn)一步深入探討與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的mCRPs生物學(xué)功能，尋找新的腫瘤治療的潛在基因靶點(diǎn)提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本

所有組織標(biāo)本均取自于組織芯片，本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)腸癌及相匹配的癌旁組織芯片由西安艾麗娜生物科技有限公司、第四軍醫(yī)大學(xué)病理科提供，121例結(jié)腸癌和121例癌旁結(jié)腸組織均為2004年10月至2006年6月第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除標(biāo)本，其中男75例，平均40～74歲，中位年齡61歲；女46例，平均31～82歲，中位年齡55歲。所有患者均未行化療、放療或生物治療（表1）。本項(xiàng)研究經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 CD46的表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系Table 1CD46 expression in normal and neoplastic colon tissues

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)改良二步法分別檢測(cè)CD46、CD55和CD59的表達(dá)。方法如下：切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶12 min。PBS洗滌3 min×3次。0.4 g檸檬酸/3g檸檬酸鈉混合溶液（1L，pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS洗滌3 min×3次。分別滴加CD46、CD55和CD59（1:100或1:200，美國Santa公司）一抗稀釋液4℃過夜。用小鼠IgG代替一抗作為陰性對(duì)照。PBS洗滌5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（Santa Cruz），室溫孵育30 min。PBS洗滌5 min×3次。DAB顯色約2 min。蘇木素復(fù)染3 min。梯度酒精脫水，二甲苯浸泡，中性樹脂封片。待干燥后顯微鏡下觀察。

1.2.2結(jié)果判定由3位觀察者采取盲法觀察，每張切片選5個(gè)視野（×200倍），每個(gè)視野計(jì)數(shù)150個(gè)細(xì)胞，觀察癌細(xì)胞及癌旁黏膜的染色情況，評(píng)分方法如下［5］：1）依據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)弱，無著色為0分，淺黃或淺褐色為1分，棕黃或褐色為2分，深褐色為3分。2）依據(jù)陽性細(xì)胞比例＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。3）以上兩者乘積為最終評(píng)分：0～4分為弱表達(dá)，5～12分為強(qiáng)表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析CD46、CD55和CD59蛋白與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，兩組之間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組之間使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CD46在結(jié)腸癌和癌旁組織中的定位與表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD46在121例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CD46主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分為胞膜表達(dá)。CD46蛋白在結(jié)腸癌與癌旁組織中強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為53.7%（65/121）和11.0%（11/ 124）。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。進(jìn)一步分析與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)陽性率與性別、年齡、組織分化、TNM病理分期、腫瘤位置、病理組織類型均無關(guān)（P＞0.05，圖1，表1）。

圖1 SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD46在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Figure 1Immunohistochemical staining of CD46 in normal and neoplastic colon tissues

2.2CD55在結(jié)腸癌和癌旁組織中的定位與表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)顯示CD55主要分布于結(jié)腸癌組織的胞漿和胞膜，在間質(zhì)細(xì)胞中也有少量表達(dá)。121例結(jié)腸癌組織中有77例（63.6%）CD55染色強(qiáng)陽性，而在癌旁組織中染色強(qiáng)陽性率為5.8%（7/121）。CD55在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2，表2）。分析表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性（表2），CD55的表達(dá)與TNM分期和組織學(xué)類型相關(guān)（P＜0.05），但與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤病理類型無相關(guān)性（P＞0.05）。而且觀察到CD55的表達(dá)組織學(xué)類型不同，定位有所不同：高分化以胞膜表達(dá)為主，中低分化主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2）。

2.3CD59在結(jié)腸癌和癌旁組織中的定位與表達(dá)

CD59和CD46、CD55類似，也主要分布于結(jié)腸癌組織的胞漿和胞膜，但在間質(zhì)細(xì)胞未見有表達(dá)。121例結(jié)腸癌及其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為61.9%（75/121）和6.6%（8/121），陽性率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001，圖3、表3）。CD59的表達(dá)陽性率與性別、年齡、腫瘤位置、病理類型無關(guān)（P＞0.05），而與組織分化、TNM病理分期有關(guān)（P＜0.05）。其表達(dá)強(qiáng)度陽性率中低分化組明顯高于高分化組（P＜0.05，圖3）。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期強(qiáng)陽性表達(dá)率為51.1%（24/47），Ⅲ、Ⅳ期陽性表達(dá)率為68.9%（51/74），兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 CD55的表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系Table 2CD55 expression in normal and neoplastic colon tissues

圖2 SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD55在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Figure 2Immunohistochemical staining of CD55 in normal and neoplastic colon tissues

圖3 SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD59在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Figure 3Immunohistochemical staining of CD59 in normal and neoplastic colon tissues

表3 CD59的表達(dá)和結(jié)腸癌臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系Table 3CD59 expression in normal and neoplastic colon tissues

3 討論

結(jié)直腸癌位居全球癌癥發(fā)病率第三位，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，在臨床上缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)的患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，往往最終死于腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)和化療后多藥耐藥。因此深入探討結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于

早期診斷、療效預(yù)測(cè)和判定及改善患者預(yù)后均具有十分重要的意義。

以往對(duì)mCRPs的研究［6-7］多集中在其調(diào)節(jié)補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面，而本試驗(yàn)使用了基因芯片大規(guī)模檢測(cè)結(jié)腸癌mCRPs中CD46、CD55和CD59的表達(dá)定位及相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果提示三者在結(jié)腸癌中的表達(dá)陽性率明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，且CD55和CD59的表達(dá)強(qiáng)度與TNM分期和組織學(xué)類型密切相關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其表達(dá)定位主要分布在腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，間質(zhì)細(xì)胞很少有表達(dá)。Koretz等［8-9］研究結(jié)果顯示CD46在結(jié)腸癌組織及正常組織均有高表達(dá)，CD59在結(jié)腸癌組織中弱表達(dá)，但其研究樣本量僅有20例，病理學(xué)指標(biāo)也未細(xì)化分類。

由于mCRPs的活性效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)同源補(bǔ)體的攻擊高度耐受。腫瘤細(xì)胞在免疫逃逸中，通常不僅僅過表達(dá)一種mCRPs，可能是多種［10］。關(guān)于補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白具備的這種針對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，已有多項(xiàng)體外研究。本文研究顯示，這些補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑在結(jié)腸癌中表達(dá)增強(qiáng)，表明mCRPs在保護(hù)結(jié)腸癌細(xì)胞免于補(bǔ)體的攻擊中發(fā)揮著特殊作用。這種現(xiàn)象在乳腺癌中也存在，mCRPs滅活之后，乳腺癌細(xì)胞系的CDC可由10%增加到80%［11］。但是各補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在不同腫瘤、不同病理類型中作用也大有不同。在惡性膠質(zhì)瘤患者中，CD55蛋白的表達(dá)與逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的攻擊能力呈正相關(guān)，而神經(jīng)膠質(zhì)瘤CD46滅活之后，CDC并無太大變化［12］。對(duì)利妥昔單抗（rituximab）治療反應(yīng)較差的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者外周血分離的淋巴細(xì)胞，體外中和CD55、CD59后對(duì)于補(bǔ)體活化、裂解更為敏感［13］。另外，抑制CD59活性，腎癌細(xì)胞對(duì)于CDC的敏感性明顯增強(qiáng)，而CD46、CD55則無此效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)CD46在結(jié)腸癌中高表達(dá)，但與組織分化、病理分期無關(guān)，可能提示在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中，該蛋白發(fā)揮著主要功能。CD55和CD59表達(dá)強(qiáng)度在低分化組和Ⅲ、Ⅳ期患者中明顯升高，可認(rèn)為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)模式在預(yù)測(cè)生物免疫治療中患者的免疫應(yīng)答率方面意義重大，并且可能與結(jié)腸癌的臨床預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)136例結(jié)直腸癌的有關(guān)研究顯示，CD55高表達(dá)患者相對(duì)生存時(shí)間減少了7年，并且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高［14］。

已有的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，抑制mCRPs的功能可增強(qiáng)CDC，促進(jìn)腫瘤免疫治療的效果。尤其是雙特異性抗體的使用能有效靶向腫瘤細(xì)胞的mCRPs，給免疫治療帶來了新的希望［15-17］。有文獻(xiàn)報(bào)道，mCRPs在結(jié)腸癌中的表達(dá)受腫瘤壞死因子α、1β、γ調(diào)控，使用細(xì)胞活素類藥物下調(diào)mCRPs的表達(dá)可能也是以后腫瘤治療的一個(gè)選擇［18］。另外本研究通過評(píng)估m(xù)CRPs的表達(dá)情況可判斷患者是否適合免疫治療并預(yù)測(cè)免疫應(yīng)答率?？傊?，在結(jié)腸癌中監(jiān)測(cè)mCRPs的表達(dá)對(duì)于了解疾病的進(jìn)展和預(yù)后有重要價(jià)值，并為我們下一步探討與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的mCRPs及作用機(jī)制、尋求新的治療策略開辟了新的思路。

1Pescovitz MD.Rituximab，an anti ed20 monoclonal antibody：history and mechanism of action［J］.Am J Transpl，2006，6（5 P 1）：859-866.

2Ross GD.Regulation of the adhesion versus cytotoxic functions of the Mac-1/CR3/aMb2-integrin glycoprotein［J］.Crit Rev Immunol，2000，20（3）：197-222.

3Fishelson Z，Donin N，Zell S，et al.Obstacles to cancer immunotherapy：expression of membrane complement regulatory proteins（mCRPs）in tumors［J］.Mol Immunol，2003，40（2-4）：109-123.

4Gorter A，Meri S.Immune evasion of tumor cells using membrane-bound complement regulatory proteins［J］.Immunol Today，1999，20（12）：576-582.

5Zhang F，Ren G，Lu Y，et al.Identification of TRAK1（Trafficking protein，kinesin-binding 1）as MGb2-Ag：a novel cancer biomarker［J］.Cancer Lett，2009，274（2）：250-258.

6Han SL，Xu C，Wu XL，et al.The impact of expressions of CD97 and its ligand CD55 at the invasion front on prognosis of rectal adenocarcinoma［J］.Int J Colorectal Dis，2010，25（6）：695-702.

7Trikha M，Yan L，Nakada MT.Monoclonal antibodies as therapeutics in oncology［J］.Curr Opin Biotechnol，2002，13（6）：609-614.

8Koretz K，Brüderlein S，Henne C，et al.Decay-accelerating factor（DAF，CD55）in normal colorectal mucosa，adenomas and carcinomas［J］.Br J Cancer，1992，66（5）：810-814.

9Koretz K，Brüderlein S，Henne C，et al.Expression of CD59，a complement regulator protein and a second ligand of the CD2 molecule，and CD46 in normal and neoplastic colorectal epithelium.［J］.Br J Cancer，1993，68（5）：926-931.

10 Loberg RD，Wojno KJ，Day LL，et al.Analysis of membranebound complement regulatory proteins in prostate cancer［J］.Urology，2005，66（6）：1321-1326.

11 Jurianz K，Ziegler S，Garcia-Schuler H，et al.Complement resistance of tumor cells：basal and induced mechanisms［J］.Mol Immunol，1999，36（13-14）：929-939.

12 Maenpaa A，Junnikkala S，Hakulinen J，et a1.Expression of complement membrane regulators membrane cofactor protein（CD46），decay accelerating factor（CD55），and protectin（CD59）in human malignant gliomas［J］.Am J Pathol，1996，148（4）：1139-1152.

13 Golay J，Lazzari M，F(xiàn)acchinetti V，et al.CD20 levels determine the in vitro susceptibility to rituximab and complement of B-cell chronic lymphocytic leukemia：further regulation by CD55 and CD59［J］. Blood，2001，98（12）：3383-3389.

14 Durrant LG，Chapman MA，Buckley DJ，et al.Enhanced expression of the complement regulatory protein CD55 predicts a poor prognosis in colorectal cancer patients［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52（10）：638-642.

15 Gelderman KA，Blok VT，F(xiàn)leuren GJ，et al.The inhibitory effect of CD46，CD55，and CD59 on complement activation after immuno-

therapeutic treatment of cervical carcinoma cells with monoclonal antibodies or bispecific monoclonal antibodies［J］.Lab Invest，2002，82（4）：483-493.

16 Gelderman KA，Kuppen PJ，Okada N，et al.Tumor-specific inhibition of membrane-bound complement regulatory protein Crry with bispecific monoclonal antibodies prevents tumor outgrowth in a rat colorectal cancer lung metastases model［J］.Cancer Res，2004，64（12）：4366-4372.

17 Gelderman KA，Lam S，Gorter A.Inhibiting complement regulators in cancer immunotherapy with bispecific mAbs［J］.Expert Opin Biol Ther，2005，5（12）：1593-1601.

18 Spiller OB，Criado-García O，Rodríguez De Cordoba S，et al.Cytokine-mediated up-regulation of CD55 and CD59 protects human hepatoma cells from complement attack［J］.Clin Exp Immunol，2000，121（2）：234-241.

（2015-01-23收稿）

（2015-03-12修回）

（編輯：鄭莉）

Expression of CD46,CD55,and CD59 in colon cancer

Yong GU1,Yan YANG2,Yulong SHANG2,Hongtao MENG1

Hongtao MENG;E-mail:mhtmyt@163.com

Objective:To determine whether CD46,CD55,and CD59 are differentially expressed in neoplastic and adjacent normal colon tissues and to investigate their influence on clinicopathologic variables.Methods:Immunohistochemistry(a modified twostep method)was used to detect the expression of CD46,CD55,and CD59 in a tissue microarray of 121 cases of colon cancer and corresponding adjacent non-tumor tissues with detailed clinical information,including gender,age,differentiation,TNM classification,tumor location,and tumor histotype.The colon carcinoma microarray was constructed from patients'samples obtained from the Department of Gastrointestinal Surgery of Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University between October 2004 and June 2006. The correlation between expression and clinicopathologic features was analyzed.Results:The expression levels of CD46,CD55,and CD59 were significantly higher in colon cancer tissues compared with those in normal adjacent colon tissues(P<0.001).CD46 expression was not related to any specific patient characteristics,such as age,gender,grade of tumor differentiation,or TNM classification(P> 0.05).The expression levels of CD55 and CD59 were correlated with the grade of colon cancer differentiation.Low levels of CD55 and CD59 were detected in cancer cells of highly differentiated cancer,whereas stronger staining for CD55 and CD59 was mainly observed in cancer cells of moderately and poorly differentiated colon cancer(P<0.05).In addition,the expression levels of CD55 and CD59 were higher in stages III and IV colon cancer than those in stages I and II according to TNM classification(P<0.05).Conclusion: CD46,CD55,and CD59 are up-regulated in colon cancer.Specifically,CD55 and CD59 are of clinical relevance to differentiation and TNM staging of colon cancer,and their expression might be closely related to clinical biological behaviors.

CD46,CD55,CD59,colon cancer,immunohistochemsitry

10.3969/j.issn.1000-8179.20150130

①陜西武警總隊(duì)醫(yī)院消化內(nèi)科（西安市710054）；②第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院

孟宏濤mhtmyt@163.com

1Digestive System Department,Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People's Armed Police Force,Xi'an 710054,China;

2Xijing Hospital of Digestive Diseases,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

顧勇專業(yè)方向?yàn)橄瘍?nèi)科臨床、內(nèi)鏡診療及分子腫瘤學(xué)的研究工作。

E-mail：wjyygy@126.com