常山酮防治放射性肺損傷及其機(jī)制的研究*

王鵬 鞏琳琳 王帥 劉寧波 龐青松 趙路軍 王平

·基礎(chǔ)研究·

常山酮防治放射性肺損傷及其機(jī)制的研究*

王鵬 鞏琳琳 王帥 劉寧波 龐青松 趙路軍 王平

目的：研究常山酮對放射性肺損傷的防治作用，并探索其可能機(jī)制。方法：健康雌性C57BL/6J小鼠72只，隨機(jī)分為對照組、照射組、常山酮組及照射聯(lián)合常山酮組，每組18只。對照組不做處理；常山酮組每只小鼠予常山酮灌胃1次/d，連續(xù)1個(gè)月或至處死；聯(lián)合組灌胃方法同常山酮組，并于灌胃至15 d時(shí)予全肺6MV-X線單次照射12 Gy；照射組予全肺照射，照射時(shí)間及劑量同聯(lián)合組；照射后24 h、1、2、4、12、20周各組隨機(jī)處死3只，留取肺組織，H&E染色觀察肺組織形態(tài)、羥脯氨酸堿水解法測定羥脯氨酸含量、免疫組織化學(xué)法及RT-PCR法測定TGF-β1的表達(dá)水平。結(jié)果：H&E染色結(jié)果示聯(lián)合組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肺泡炎癥及（或）肺纖維化程度較照射組均明顯減輕。聯(lián)合組肺組織羥脯氨酸含量低于照射組，至照射后20周達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.037）。免疫組織化學(xué)及RT-PCR結(jié)果示照射后各時(shí)間點(diǎn)照射組及聯(lián)合組肺組織中TGF-β1表達(dá)水平均高于對照組及常山酮組（均P＜0.05）；聯(lián)合組TGF-β1蛋白表達(dá)水平于照射后2、4、12、20周顯著低于照射組（均P＜0.05），TGF-β1 mRNA水平于照射后4、12周顯著低于照射組（均P＜0.05）。結(jié)論：常山酮可抑制胸部照射后小鼠肺組織炎性及纖維化改變，這可能是通過抑制放射導(dǎo)致的肺組織中TGF-β1表達(dá)升高引起的，有望將常山酮開發(fā)為防治放射性肺損傷的新型藥物。

常山酮 轉(zhuǎn)化生長因子-β1 放射性肺損傷 羥脯氨酸

放射性肺損傷是影響胸部腫瘤放射治療療效的重要因素之一，近年來關(guān)于放射性肺損傷細(xì)胞及分子水平的研究越來越多，但放射性肺損傷的防治仍然是當(dāng)前放療學(xué)界研究的難點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）是一個(gè)具有多種功能的多肽類生長因子超家族，在組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［1］，多項(xiàng)研究表明TGF-β信號(hào)通路的激活是放射性肺損傷發(fā)生的重要機(jī)制，阻斷TGF-β的信號(hào)通路可抑制放射性肺損傷的發(fā)生［2-5］，但目前的研究多是通過TGF-β中和抗體或TGF-β受體拮抗劑來阻斷這一通路，臨床可操作性差。常山酮（halofuginone）是一種從植物常山中獲得的喹唑酮類藥物，20世紀(jì)90年代，人們發(fā)現(xiàn)常山酮可以特異性地抑制成纖維細(xì)胞合成I型膠原纖維，是一種新型的I型膠原合成抑制劑［6］。之后多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明常山酮可以阻斷TGF-β信號(hào)通路從而具有抗纖維化作用［7］，然而目前尚無常山酮防治放射性肺損傷研究的報(bào)道。

本研究擬建立小鼠放射性肺損傷模型，觀察不同處理組小鼠放射性肺損傷情況，檢測小鼠肺組織TGF-β表達(dá)情況，探討常山酮在放射性肺損傷防治中的作用及可能機(jī)制，以期為研究常山酮防治放射性肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑常山酮購自武漢馳飛化工有限公司，用PBS緩沖液稀釋至125 μg/mL備用。小鼠TGF-β1單克隆抗體一抗?jié)饪s液購自美國Abcam公司。免疫組織化學(xué)染色試劑及DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。羥脯氨酸堿水解法試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實(shí)時(shí)定量RTPCR試劑盒購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J雌性小鼠72只，雌性，6周齡，體重20～30 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于天津市腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理健康雌性C57BL/6J小鼠72只，隨機(jī)分為對照組、胸部照射組（照射組）、常山酮組及照射聯(lián)合常山酮組，每組18只。對照組不做處理；常山酮組予常山酮灌胃，每只小鼠25 μg/0.2 mL·d連續(xù)1個(gè)月或至處死；聯(lián)合組灌胃同常山酮組，并于灌胃至15 d時(shí)予全肺6MV-X線單次照射12 Gy；照射組予全肺照射，照射時(shí)間及劑量同聯(lián)合組。

1.2.2觀察指標(biāo)胸部照射后24 h、1周、2周、4周、12周、20周各組分別隨機(jī)處死3只小鼠（對照組也同時(shí)處死3只小鼠），留取新鮮肺組織，左肺浸于10%福爾馬林溶液中固定，制作石蠟切片行H&E染色觀察肺組織形態(tài)、免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β1水平；右肺液氮速凍后，裝入標(biāo)好的凍存管，-80℃冰箱保存，行羥脯氨酸堿水解法測定肺組織中羥脯氨酸的含量，并行實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測定TGF-β1的相對表達(dá)水平。所應(yīng)用的TGF-β1 cDNA引物序列上游：5'-CTGCTGACCCCCACTGATAC-3'，下游：5'-GAAAG CCCTGTATTCCGTCTC-3'，內(nèi)參GAPDH cDNA引物序列上游：5'-CGGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游：5'-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。

1.2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判定光學(xué)顯微鏡下觀察各組切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果并拍攝數(shù)碼影像。根據(jù)文獻(xiàn)［8］采用AB值定量記分法：A表示顯色深淺：0為無顯色，1為淺黃色，2為棕黃色，3為粽褐色；B為每個(gè)視野染色細(xì)胞比例：1為陽性細(xì)胞≤10%，2為11%～50%，3為51%～75%，4為＞75%。每張切片觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)算AB值平均值作為該切片的最后評分。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠各組間差異比較采用方差分析，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺組織H&E染色結(jié)果

對照組及常山酮組小鼠肺組織各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔無增寬及充血，無炎性細(xì)胞浸潤及出血現(xiàn)象。單純胸部照射組小鼠照射后24 h肺泡水腫、出血，部分肺泡腔充滿粉染均質(zhì)水腫液，肺泡內(nèi)大量游離的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；照射后1周仍可見明顯肺泡出血與水腫，肺泡塌陷，可見到成纖維細(xì)胞；照射后2周肺泡炎癥表現(xiàn)較前有所減輕，成纖維細(xì)胞增生，肺泡間隔略增寬，偶見斑片狀的纖維化改變；照射后4周肺泡腔縮小，部分肺泡腔內(nèi)可見紅細(xì)胞及透明膜形成，肺泡間隔明顯增寬，可見大量成纖維細(xì)胞；照射后12周肺泡腔明顯縮小，

可見膠原纖維沉積及大量的成纖維細(xì)胞增生，肺纖維化明顯形成；照射后20周肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，可見肺實(shí)變；放療聯(lián)合常山酮組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肺泡炎癥及肺纖維化均較單純胸部照射組明顯減輕（圖1）。

2.2各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量測定結(jié)果

對照組及常山酮組肺組織羥脯氨酸含量隨時(shí)間變化不明顯，且在各時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異（均P＞0.3）；胸部照射組及聯(lián)合組羥脯氨酸含量均隨時(shí)間延長升高，照射后24 h、1周、2周、4周、12周、20周照射組肺組織羥脯氨酸含量明顯高于對照組（P值分別為0.018、0.005、0.002、＜0.001、＜0.001、0.016）；聯(lián)合組羥脯氨酸含量在照射后24 h、1周、2周、4周、12周有低于胸部照射組的趨勢（P值分別為0.248、0.343、0.408、0.365、0.076），在照射后20周顯著低于胸部照射組（P=0.037，表1及圖2）。

2.3各組小鼠肺組織TGF-β1免疫組織化學(xué)測定

對照組及常山酮組肺組織TGF-β1呈弱陽性表達(dá)，主要分布于肺上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞中，各時(shí)間點(diǎn)兩組之間比較無顯著性差異（均P＞0.5）。單純胸部照射組和聯(lián)合組肺組織均可見大量黃色染色區(qū)域，照射后24 h至20周各時(shí)間點(diǎn)胸部照射組肺組織TGF-β1表達(dá)水平均明顯高于對照組（均P＜0.001），而聯(lián)合組肺組織TGF-β1的表達(dá)水平于照射后2周、4周、12周、20周顯著低于照射組（P值分別為0.001、＜0.001、0.001、0.007），照射后24 h、1周有低于照射組趨勢（P值分別為0.093、0.129）（表2及圖3）。

2.4各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平RTPCR檢測

對照組與常山酮組肺組織中TGF-β1mRNA各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平無明顯差異（均P＞0.7）；照射后24 h至20周各時(shí)間點(diǎn)胸部照射組肺組織TGF-β1mRNA水平均明顯高于對照組（P值分別為0.04、0.20、0.141、0.021、0.016、0.055）。照射后4周、12周常山酮聯(lián)合胸部照射組肺組織TGF-β1的相對表達(dá)水平明顯低于胸部照射組（P值分別為0.048、0.02），照射后24 h、1周、2周、20周有低于胸部照射組的趨勢（P= 0.667、0.383、0.21、0.234）（表3及圖4）。

?圖2各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織羥脯氨酸含量變化Figure 2Comparison of levels of hydroxyproline in each group at different time points

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平免疫組織化學(xué)評分Table 2Comparison of TGF-β1 expression scores in each group at different time points

圖3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)情況（S-P×400）Figure 3TGF-β1 expression in lung tissue（S-P×400）

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織TGF-β1 mRNA相對表達(dá)水平Table 3Comparison of TGF-β1 mRNA levels in each group at various time points

圖4 照射后12周各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA水平Figure 4Comparison of TGF-β1 mRNA levels of each group at 12 weeks after irradiation

3 討論

放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，據(jù)報(bào)道30%接受肺癌根治性放療的患者會(huì)發(fā)生放射性肺炎［9］。放射性肺炎的發(fā)生不僅限制了腫瘤根治放療劑量的提高，降低療效，也影響了患者的生存質(zhì)量，甚至可導(dǎo)致治療相關(guān)性死亡，因此對于放射性肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治方法的研究探討具有重要的臨床意義。常山酮可特異性地抑制成纖維細(xì)胞合成I型膠原纖維，抑制纖維化的形成。多項(xiàng)研究表明常山酮對肝臟、胰腺纖維化、系統(tǒng)性硬化癥、膠原病、術(shù)后瘢痕形成等也都有明顯防治效果［9-11］。同時(shí)常山酮可以減輕放射線引起的纖維化，如Dabak等［12］的研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用常山酮后可顯著減輕放療引起的小鼠食管和下咽的纖維化，Xavier等［7］的研究則證實(shí)常山酮可明顯抑制放射引起的小鼠下肢的纖維化，且該作用主要是通過抑制TGF-β通路實(shí)現(xiàn)的。而早在1996年，Nagler等［13］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)常山酮可明顯降低博來霉素引起的肺纖維化。對于放射線引起的肺纖維化，常山酮是否有防治作用？目前鮮有報(bào)道。

放射性肺損傷的過程大體可分為三個(gè)階段：潛在期、急性肺炎期、慢性肺纖維化期。潛在期常發(fā)生在放療后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)，患者無任何臨床表現(xiàn)，電鏡下可看到Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及表皮細(xì)胞的損傷，主要表現(xiàn)為線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨脹及漿膜的破裂；急性肺炎期大約發(fā)生在放療后2周至數(shù)月內(nèi)，此期以肺泡損傷為主，表現(xiàn)為間質(zhì)水腫、滲出、炎性細(xì)胞浸潤、肺泡腔的改變、肺泡間隔增寬；晚期則以肺泡間隔進(jìn)行性的纖維化為特點(diǎn)最終將導(dǎo)致廣泛的肺泡閉塞甚至肺組織實(shí)變，往往為不可逆的改變［14］。本研究建立小鼠放射性損傷模型，通過組織病理學(xué)H&E染色方法觀察到放療后各時(shí)間點(diǎn)小鼠放射性肺損傷的典型演變過程，并證實(shí)常山酮可以在一定程度減輕放療后小鼠肺組織急性炎癥反應(yīng)及慢性纖維化改變。羥脯氨酸是膠原蛋白所特有的氨基酸，其含量可以反映總體膠原纖維的水平，因此測定羥脯氨酸含量可以用來評價(jià)纖維化的程度。本研究中，放療后24 h、1周、2周、4周、12周，尤其是放療后12周，聯(lián)合組小鼠肺組織羥脯氨酸含量有小于胸部照射組趨勢；放療后20周聯(lián)合組羥脯氨酸含量與胸部照射組相比明顯降低。這一結(jié)果提示常山酮可以抑制放療引起的肺組織纖維化的形成。然而，常山酮并沒有明顯降低放療后24 h、1周、2周、4周肺組織羥脯氨酸含量，分析原因可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量過少有關(guān)，也可能是因?yàn)榉派湫苑卫w維化是放療后中晚期的慢性過程，早期難以觀察到明顯的差別。

TGF-β是一個(gè)具有多種功能的多肽類生長因子超家族，在組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)TGF-β與放射肺損性傷的發(fā)生也密切相關(guān)。國內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)放療前后血漿中TGF-β1水平的變化可以預(yù)測放射性肺損傷［15］，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院的一項(xiàng)數(shù)據(jù)表明TGF-β的基因多態(tài)性與放射性肺炎也有一定的相關(guān)性［16］。而基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路的激活是放射性肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵過程，小鼠肺組織受到照射后發(fā)生肺纖維化的同時(shí)伴有TGF-β1水平升高，應(yīng)用抗TGF-β1抗體或TGF-β受體的拮抗劑阻斷TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)可以明顯減輕放射性肺損傷的發(fā)生［2-3，5，17］。Rube等［4］的研究顯示小鼠肺組織中TGF-β1水平在照射后最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即釋放（照射后1、3、6 h），12 h后顯著增加，照射后2周和4周達(dá)高峰，照射后8周、16周、24周逐漸下降，且TGF-β1主要表達(dá)于肺組織中炎性細(xì)胞的浸潤區(qū)域及成纖維細(xì)胞中。本研究中通過免疫組化法及RTPCR法檢測照射后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中TGF-β1變化水平，均觀察到照射后24 h TGF-β1即開始升高，且大致于照射后2周至4周達(dá)高峰，這與Rube等［4］的結(jié)果比較一致，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用常山酮后，小鼠放射性肺損傷減輕的同時(shí)也伴隨著TGF-β1水平的下降，免疫組織化學(xué)法示照射后2～20周各時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合組小鼠肺組織TGF-β1水平顯著低于照射組，而RT-PCR結(jié)果示照射后4～12周各時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA水平顯著低于照射組。這一結(jié)果提示常山酮抑制放射性肺損傷發(fā)生的機(jī)制可能和降低TGF-β的表達(dá)水平有關(guān)。然而本研究中TGF-β1蛋白及mRNA水平在各時(shí)間點(diǎn)并非完全一致，一方面可能是由于本研究采用的免疫組織化學(xué)評分及RT-RCR法均為半定量方法，可能會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的誤差；另一方面，蛋白表達(dá)本身為多步

驟調(diào)控過程，真核生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔［18］，可能也是造成TGF-β1轉(zhuǎn)錄和翻譯水平于各時(shí)間點(diǎn)不完全一致的原因。

本研究建立C57小鼠放射性肺損傷模型，通過對放療后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)常山酮在一定程度上抑制了放射性肺損傷的發(fā)生，且這一抑制作用可能和降低TGF-β1的表達(dá)水平有關(guān)；同時(shí)常山酮和TGF-β中和抗體或TGF-β受體拮抗劑相比成本低，臨床可操作性較強(qiáng)，有望成為其防治放射性肺損傷的新型藥物。然而由于本研究動(dòng)物數(shù)量較少，且放射性纖維化的形成是多個(gè)通路相互影響的復(fù)雜的過程，尚需要大樣本的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索常山酮防治肺纖維化的作用并探討其具體機(jī)制。

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（2014-11-22收稿）

（2015-01-15修回）

（編輯：楊紅欣）

Study of halofuginone in ameliorating radiation injury of lung

Peng WANG,Linlin GONG,Shuai WANG,Ningbo LIU,Qingsong PANG,Lujun ZHAO,Ping WANG

Lujun ZHAO;E-mail:tjdoctorzhao@126.com

Objective:To investigate the inhibitory effects of halofuginone on radiation-induced pulmonary injury and to explore the therapeutic mechanism of this drug.Methods:A total of 72 healthy female C57BL/6 mice were randomized into 4 groups,namely, control,irradiation,halofuginone,and irradiation plus halofuginone groups,with 18 mice in each group.No treatment was performed in the control group.In the halofuginone group,the halofuginone lavage was conducted once a day,with a continuous course treatment for a month or until sacrifice of the mice.In the therapeutic alliance group,the treatment mode was the same as that in the halofuginone group.Then,a 6MV-X ray single fraction irradiation was performed after the completion of a 15-day intragastric administration.At 24 h,1 week,2 weeks,4 weeks,12 weeks,and 20 weeks after the irradiation,3 mice from each group were randomly sacrificed,and total lung tissues were harvested.The lung was dissected to prepare pathological sections.The sections were stained with hematoxylin and eosin staining(H&E)to explore morphologic changes.The protein and mRNA expression levels of TGF-β1 were analyzed by a combination of immunohistochemistry and polymerase chain reaction.The level of hydroxyproline was also measured.Results:The outcomes of H&E staining showed that halofuginone markedly ameliorated the acute pulmonary inflammation and fibrosis induced by irradiation.The combination group had a lower level of hydroxyproline than the irradiation group,with statistically significant differences at 20 weeks after irradiation(P=0.037).The protein and mRNA expression levels of TGF-β1 were higher in the irradiation and combination groups than in the control group and(or)halofuginone group at different time points(P<0.05).The combination group had lower TGF-β1 protein expression than the irradiation group at different time points,with statistically significant differences at 2,4,12,and 20 weeks after the irradiation(P<0.05).Meanwhile,TGF-β1 mRNA level was lower in the combination group than in the irradiation group only at 4 and 12 weeks after the irradiation(P<0.05).Conclusion:Halofuginone can ameliorate the irradiation-induced lung inflamma-

halofuginone,transforming growth factor-β1,radiation injury of lung,hydroxyproline

10.3969/j.issn.1000-8179.20141969

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院放療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：30970864），天津市抗癌重大專項(xiàng)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：12ZCDZSY15900）資助

趙路軍tjdoctorzhao@126.com

Department of Radiation Therapy,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30970864)and Tianjin Municipal Project of Tackling Key Problem for Cancer Therapy(No.12ZCDZSY15900)

tion and fibrosis probably by inhibiting the radiation-induced TGF-β1 expression.Therefore,halofugione is expected to be a therapeutic drug for preventing irradiation injury of the lung.

王鵬專業(yè)方向?yàn)樾夭磕[瘤的放射治療與生物轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。

E-mail：wangpeng_orange@163.com