肺癌中NR4A3和CD133表達的臨床意義及相關(guān)性

郭善嫻 黃先明 蔡 勇 簡 艷 劉志良 蔡 云 詹勤元 鈄方芳

肺癌是全世界腫瘤致死率最高的惡性腫瘤，在所有的肺癌中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)［1］。盡管在早期檢測和治療方面的進步，患者預后仍然較差，其 5年生存率低于15%［2］。因此，尋找新的抑癌基因，并探討它們的臨床意義是非小細胞肺癌研究的一個重要組成部分。

NR4A3也稱作Nor-1，屬于孤兒核受體家族成員之一。該家族成員之所以被稱作“孤兒”受體是因為目前尚未發(fā)現(xiàn)它們的內(nèi)源性配體，而主要依賴生理信號所產(chǎn)生，包括:脂肪酸、前列腺素、生長因子、鈣、炎癥因子、肽激素及神經(jīng)遞質(zhì)等。它們被激活后作用于靶基因參與細胞周期、凋亡、炎癥、代謝、DNA修復及腫瘤生成等調(diào)節(jié)。文獻報道NR4A3為髓系白血病發(fā)生的腫瘤抑制基因［3］。減少NR4A1和NR4A3和基因的表達量會導致小鼠發(fā)生骨髓增殖性腫瘤［4］。對實體瘤的研究表明甲狀腺濾泡狀癌組織中Nor-1的表達水平明顯低于濾泡狀甲狀腺瘤［5］。國內(nèi)薛騫等還發(fā)現(xiàn)中藥復方益胃飲通過上調(diào)Nor-1表達水平抑制胃癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡［6］，目前Nor-1在肺癌中的表達及作用還不清楚。

CD133+肺癌細胞具有較強的成瘤及自我更新能力，故被認為是肺癌干細胞［7］。CD133高表達的NSCLC患者具有耐藥表型，且預后較差［8-10］。揭示肺癌干細胞中CD133表達的調(diào)控機制，針對CD133+細胞的治療對于探索肺癌治療的新方法具有重要意義［11］。

本研究采用免疫組織化學法檢測非小細胞肺癌組織中Nor-1的表達情況，以探討其與NSCLC發(fā)生、發(fā)展及腫瘤干細胞相關(guān)抗原CD133表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

隨機選取江西省腫瘤醫(yī)院胸外科2012年8月-2014年8月收治的NSCLC病例84例，其中男性58例，女性26例;年齡47～75歲，平均59.8歲，均經(jīng)術(shù)后病理檢測證實。術(shù)前均未接受放療和化療，臨床資料完整。另選擇相應距腫瘤邊緣5 cm以外的正常肺組織作為對照。

1.2 免疫組織化學法

所有蠟塊做3 μm厚連續(xù)切片，每個蠟塊均切7張，1張行HE染色組織學診斷，其余6張做免疫組化染色，排除染色不佳及飛片等情況，2名病理學專家對HE染色的病理切片進行篩選，找出腫瘤組織中有代表性的區(qū)域，并在相應石蠟塊上作標記。應用免疫組化SP法檢測標本中的NR4A3與CD133蛋白。嚴格按試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照，光鏡觀察。

1.3 結(jié)果判定

由2名病理科醫(yī)生在對臨床資料均不知情的背景下獨立完成結(jié)果判定。根據(jù)腫瘤細胞顯色的比例及染色強度對NR4A3表達做半定量判定，按陽性細胞率評分:陽性細胞數(shù)≤10%為1分，10%～50%為2分;＞50%為3分;按顯色程度評分:染色弱為1分;中等染色為2分;強染色為3分。將2種評分結(jié)合起來分為9級，大于3級可以認為是陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，采用卡方檢驗評估各臨床病理參數(shù)CD133，NR4A3表達的關(guān)系，n＜5時采用Fisher精確概率檢驗，CD133與NR4A3蛋白表達的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NR4A3與CD133蛋白的表達定位

免疫組化顯示NR4A3蛋白陽性表達主要定位于胞核，部分位于細胞漿，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。在正常肺組織標本中可見NR4A3蛋白強陽性表達，而NR4A3在NSCLC組織中表達或缺失，或弱至中等強度陽性。NR4A3在NSCLC中的陽性表達率為23.8%，與正常肺組織(92.7%)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CD133的免疫組化陽性定位于胞膜和胞質(zhì)中，在鏡下呈散在，小簇狀分布，在癌周正常肺組織及癌組織中表達陽性率分別為 11.9%(10/84)和73.8%(62/84)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 NR4A3陽性表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

NR4A3在NSCLC組織中的表達與患者腫瘤細胞分化程度有關(guān)，隨著腫瘤細胞分化減低，NR4A3表達呈現(xiàn)遞減趨勢(P＜0.05);與不吸煙的患者相比，吸煙患者中NR4A3表達明顯減低;而NR4A3表達與患者的性別、年齡、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等均無關(guān)(P ＞0.05)(表1)。

2.3 NR4A3與CD133表達的關(guān)系

NR4A3和 CD133共同表達陽性者為18例(21.43%)，共同表達陰性者為 20例(23.81%);NR4A3表達陽性，CD133表達陰性者2例(2.38%)，NR4A3表達陰性，CD133表達陽性者 44例(52.38%)，兩者的表達呈負相關(guān)(γ =-0.219，P＜0.05)(圖1)。

圖1 肺癌組織中NR4A3與CD133表達呈負相關(guān)(P＜0.05)

3 討論

肺癌是全世界致死率最高的腫瘤，盡管診斷和治療方法不斷改進，NSCLC的5年生存率仍然較低。而如此低的生存率主要與腫瘤耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)是腫瘤組織中一小部分具有自我更新，無限增殖和多向分化能力的腫瘤細胞 ，是腫瘤發(fā)生發(fā)展，轉(zhuǎn)移與復發(fā)的根源。有關(guān)的臨床研究表明，肺癌組織中CD133表達量高的NSCLC 患者具有耐藥表型［12］，且預后較差［8-10］。因此，揭示肺癌干細胞中CD133表達的調(diào)控機制，對于探索這種肺癌治療方法具有重要意義。

表1 NR4A3和CD133陽性表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

NR4A受體在維持細胞穩(wěn)態(tài)和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，近年來引發(fā)了不同研究領(lǐng)域的興趣。Wenzl等的研究表明NR4A1(NUR77)和NR4A3(NOR-1)受體在造血系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［13］。近期研究中發(fā)現(xiàn)核受體NR4A1是TGF-α信號一個強有力的激活因子［14］，并參與乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)機制。NR4A1在腎腺癌細胞系中表現(xiàn)出親癌活性［15］，并認為其可作為腎細胞癌靶向治療的靶點，與其高度同源的家族成員NR4A3在肺癌中的分布及其與CD133的相關(guān)意義目前暫未有類似研究。本研究通過免疫組織化學結(jié)果表明肺癌組織中NR4A3(Nor-1)表達陽性率(14.6%)明顯低于相應的遠癌正常肺組織(92.7%);因此我們推測NR4A3(Nor-1)作為核受體超家族孤兒受體的一員，與肺癌的發(fā)生和發(fā)展存在著密切的聯(lián)系。在我們的進一步研究中發(fā)現(xiàn)其表達與肺癌患者腫瘤細胞分化程度有關(guān)，隨著腫瘤細胞分化程度減低，表達呈現(xiàn)遞減趨勢;其表達水平與患者吸煙與否相關(guān)，吸煙組NR4A3蛋白表達減弱或缺失較非吸煙組高;而與年齡、性別、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等均無關(guān)。

本研究表明NR4A3和CD133在NSCLC組織中的表達呈負相關(guān)(P＜0.05)，提示二者可能在功能上存在一定相關(guān)性，有研究表明，NR4A3的生物學功能主要是通過對其靶基因表達的調(diào)控而實現(xiàn)的，其過表達后能抑制其靶基因Smad3的表達［16-17］，而Smad3參與CD133啟動子去甲基化而影響 CD133基因轉(zhuǎn)錄［18］，提示NR4A3和CD133可能協(xié)同參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展。結(jié)合已有的報道及我們的發(fā)現(xiàn)為進一步探討NSCLC中NR4A3、CD133基因表達關(guān)系及作用機制提供了線索，值得進一步深入的研究。

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