磁性瓊脂糖微球活化條件的研究

吳明慧 譚 堅 梁 晨

（廣西梧州市環(huán)境監(jiān)察支隊，廣西 梧州 543000）

磁性瓊脂糖微球活化條件的研究

吳明慧 譚 堅 梁 晨

（廣西梧州市環(huán)境監(jiān)察支隊，廣西 梧州 543000）

對環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖磁性微球的活化條件進行了研究。以微球表面的環(huán)氧基密度為指標(biāo)，考察了活化時間、NaOH濃度、環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)、NaBH4濃度和活化溫度等因素對瓊脂糖磁性微球活性的影響。實驗結(jié)果表明，環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖磁性微球的最優(yōu)條件為活化時間為4 h ，NaOH濃度為0.9 mol/L，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為40%，NaBH4的濃度為0.5 g/L，活化溫度為40℃。

磁性瓊脂糖；活化；影響因素；最優(yōu)條件

磁性瓊脂糖微球是一種用于蛋白質(zhì)層析分離和細(xì)胞/酶固定化的載體，具有易分離回收、操作簡便和成本較低等優(yōu)點。磁性瓊脂糖微球的活化度越高，能嫁接的親和配基越多，懸浮吸附分離純化蛋白質(zhì)的效率就越高，更有利于擴大蛋白質(zhì)生產(chǎn)規(guī)模[2]，因此提高磁性瓊脂糖微球的活化度已經(jīng)成為了研究的熱點。目前，常用于載體活化的活化劑主要有環(huán)氧氯丙烷、1,4-二羥基正丁烷、雙縮水甘油醚、羰基二亞胺、二乙烯基亞砜等[1]，其作用在于向載體表面引入高密度、穩(wěn)定的活化基團，如氨基、環(huán)氧基、羥基、氯甲基、酰肼基等[2]。其中，環(huán)氧基是一種常用的活性基團，與其他基團相比，環(huán)氧基修飾的載體在直接固定化酶時不需要預(yù)活化，反應(yīng)條件溫和（溫度 25℃，pH≥7.0），酶的活性在固定化過程中不易被破壞，適合固定化酶的工業(yè)化生產(chǎn)。此外，環(huán)氧基可與酶分子中的多種活性基團，如氨基、巰基及酚羥基、咪唑基等反應(yīng)，在適合的條件下，酶與載體可發(fā)生多點鍵合，使得制備的固定化酶穩(wěn)定性好，不易從載體上脫落。在磁性載體材料上引入環(huán)氧基不僅發(fā)揮環(huán)氧基固定化酶的優(yōu)點，還易于回收使用，同時可應(yīng)用磁性流動床技術(shù)使用固定化酶，具有更廣泛的應(yīng)用前景，因此在磁性載體表面引入環(huán)氧基具有重要的意義。在固定化載體表面引入環(huán)氧基的方法主要有溴化氰活化法、對甲苯磺酸氯活化法、環(huán)氧氯丙烷活化法。溴化氰活化法操作步驟簡單，重現(xiàn)性好，偶聯(lián)條件溫和，適用于偶聯(lián)敏感性生物大分子。但是溴化氰活化法形成的異脲鍵易產(chǎn)生特異性吸附，且偶聯(lián)時共價鍵不穩(wěn)定，偶聯(lián)配基容易脫落，此外，溴化氰活化法操作危險性大，反應(yīng)后的殘余液需經(jīng)處理才可排放。對甲苯磺酸氯活化法配基偶聯(lián)過程中不產(chǎn)生新的電荷，主要用于活化含羥基基質(zhì)，但活化反應(yīng)需在無水丙酮中進行?？s水甘油醚活化法化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，配基很少脫落，分離效果好，對瓊脂糖凝膠有交聯(lián)作用，凝膠的剛性好，但是活化的凝膠其偶聯(lián)配基密度只有溴化氰活化的 75%。環(huán)氧氯丙烷活化法是目前應(yīng)用最廣泛的活化方法，環(huán)氧氯丙烷試劑易得、偶聯(lián)配基比較牢固，且價格低廉，操作簡單易行，危險性較小。

首先采用反相懸浮包埋法制備磁性瓊脂糖微球，再利用環(huán)氧氯丙烷對其進行活化。以微球表面環(huán)氧基密度為指標(biāo)，考察活化時間、NaOH濃度、環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)和活化溫度對瓊脂糖磁性微球活化程度的影響，確定最優(yōu)活化條件，為進一步在微球上結(jié)合各種不同官能團或直接吸附生物分子提供了可能，為瓊脂糖磁性微球在生化分離中的應(yīng)用提供了實驗載體和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1主要試劑與儀器

試劑：瓊脂糖，分析純，阿拉丁試劑有限公司；Span80，分析純，成都市科龍化工試劑廠；液體石蠟，分析純，成都市科龍化工試劑廠；石油醚分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司；異丙醇，分析純，成都市科龍化工試劑廠；NaOH，分析純，成都市科龍化工試劑廠；NaBH4，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；環(huán)氧氯丙烷，分析純，廣東汕頭市西隴化工廠；硫代硫酸鈉，分析純，成都市科龍化工試劑廠；硫酸鈉，分析純，成都市科龍化工試劑廠；酚酞，分析純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：DV214C電子天平、HH-S2恒溫水浴鍋、ZHWY-2102恒溫振蕩器、S212數(shù)顯電子恒速攪拌器。

1.2實驗方法

1.2.1磁性瓊脂糖微球的制備

采用反相懸浮包埋法制備磁性瓊脂糖微球[3]，具體制備過程如下：稱取0. 125 g瓊脂糖溶于4 mL去離子水，加熱煮沸使其完全溶解，然后加入1 mL自制的Fe3O4磁流體[2]，混合均勻，作為水相；稱取1.0 gSpan80加入到25 mL的液體石蠟中，恒溫（80 ℃）振蕩均勻后作為油相；將水相緩慢加入油相中，持續(xù)攪拌（850 rpm）10 min后冷卻至室溫后，再持續(xù)攪拌（250 rpm）5 min使微球成形；制得的微球用10 mL石油醚和1mL異丙醇洗滌，再分別用石油醚和去離子水清洗2次，即得到磁性瓊脂糖微球。

1.2.2磁性瓊脂糖微球的活化實驗

稱取0. 5 g磁性瓊脂糖微球放入磨口錐形瓶內(nèi)，依次加入一定量的NaOH溶液、一定量的NaBH4和一定體積分?jǐn)?shù)（環(huán)氧氯丙烷體積與反應(yīng)混合物總體積的百分比）的環(huán)氧氯丙烷，并置于恒溫振蕩器中，設(shè)定溫度開始振蕩活化?；罨欢〞r間后，用去離子水充分洗至中性，清洗液中加入硫代硫酸鈉和酚酞無顯色，即得到活化的磁性瓊脂糖微球。

1.2.3磁性瓊脂糖微球表面環(huán)氧基密度的測定

以微球表面環(huán)氧基團的密度作為評價瓊脂糖磁性微球活化程度的指標(biāo)。采用硫代硫酸鈉滴定法測定微球表面環(huán)氧基密度[4]，計算公式為：

其中，S為環(huán)氧基修飾密度（μmol/g），CHCl為HCl濃度（mol/L），V0和V1分別為滴定前和滴定后HCl的體積（mL），m為活化微球質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與討論

2.1活化時間對環(huán)氧基密度的影響

在NaOH溶液濃度為0.9 mol/L，NaBH4濃度為0.5 g/L，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為20%，活化溫度為40 ℃時，研究活化時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對環(huán)氧基密度的影響。實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1　活化時間對微球表面環(huán)氧基密度的影響

由圖 1可知，隨著活化時間的增加，微球表面環(huán)氧基密度增加，在4 h時環(huán)氧基密度達(dá)到最大，其值為111.5 μmol/L。當(dāng)活化時間大于4 h時，環(huán)氧自由基密度逐漸減小?？赡艿脑虍?dāng)反應(yīng)時間過長時，活化反應(yīng)經(jīng)已基本完成，但微球表面的環(huán)氧基和環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下的水解反應(yīng)仍在繼續(xù)，部分已經(jīng)修飾于微球表面的環(huán)氧基由于發(fā)生水解而開環(huán)失活。因此，最佳的活化時間為4 h。

2.2NaOH濃度對環(huán)氧基密度的影響

在NaBH4濃度為0.5 g/L，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為20%，活化溫度為 40 ℃，活化時間為 4 h時，研究 NaOH濃度（0.3mol/L、0.6mol/L、0.9mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L）對環(huán)氧基密度的影響。實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2　NaOH濃度對微球表面環(huán)氧基密度的影響

從圖2可以看出，隨NaOH濃度的增大，微球表面環(huán)氧基密度先呈線性增大，而后線性減小，在NaOH溶液濃度為0.9 mol/L時達(dá)到最大。瓊脂糖磁性微球表面含有大量羥基，羥基接觸NaOH后被激活，為下一步環(huán)氧氯丙烷的親核取代反應(yīng)提供游離基負(fù)離子[5]。NaOH作為環(huán)氧氯丙烷與瓊脂糖上羥基反應(yīng)的催化劑，當(dāng)其濃度過低時，活化反應(yīng)不完全。而且一定濃度的堿液可以保證溶液中的碳負(fù)離子的穩(wěn)定性。但另一方面，環(huán)氧基易水解，而 OH-也是環(huán)氧基開環(huán)水解的催化劑[6]。因此堿液濃度過高時，增大了環(huán)氧基自身的開環(huán)和水解副反應(yīng)，導(dǎo)致活化度反而降低。因此，活化反應(yīng)中 NaOH的最佳濃度為0.9mol/L。

2.3環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)對環(huán)氧基密度的影響

在NaOH溶液濃度為0.9 mol/L，NaBH4濃度為0.5 g/L，活化溫度為40 ℃，活化時間為4 h時，研究環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%、50%）對環(huán)氧基密度的影響。實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3　環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)對微球表面環(huán)氧基密度的影響

從圖 3可以看出，隨環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)的增大，微球表面環(huán)氧基密度先明顯增加，后趨于穩(wěn)定，在環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為40%時達(dá)到最大值。說明40%體積分?jǐn)?shù)的環(huán)氧氯丙烷與瓊脂糖磁性微球上的羥基反應(yīng)已經(jīng)飽和。在環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為 50%時，微球表面環(huán)氧基密度稍有下降。這可能是由于環(huán)氧氯丙烷在水中的溶解度有限(約為6.58%)[1]，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)過高，其強疏水性反而不利于 NaOH 擴散，從而導(dǎo)致在高環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)時，環(huán)氧基修飾密度反而降低[7]。

2.4NaBH4濃度對環(huán)氧基密度的影響

在NaOH溶液濃度為0.9 mol/L，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為20%，活化溫度為40 ℃，活化時間為4 h時，研究NaBH4濃度（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）對環(huán)氧基密度的影響。實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4　NaBH4的濃度對微球表面環(huán)氧基密度的影響

由圖4可知，NaBH4的濃度不斷增大，NaBH4濃度在0.5g/L時，環(huán)氧基密度達(dá)到最大值；繼續(xù)增加NaBH4的濃度，環(huán)氧基密度有下降的趨勢。是因為在瓊脂糖的活化反應(yīng)中，NaBH4作為封閉劑去掩蔽瓊脂糖磁性微球表面的剩余活性基團和電荷，防止或降低瓊脂糖磁性微球偶聯(lián)配基后剩余的活性基團相互之間的結(jié)合或電荷離子交換引起不可逆性吸附，也避免了瓊脂糖微球親和吸附蛋白質(zhì)時與雜離子進行交換。但活化時NaBH4過量，會引起環(huán)氧化合物的開環(huán)反應(yīng)，降低微球的表面環(huán)氧基密度[5,8-10]。因此，最佳 NaBH4濃度是0.5g /L。

2.5活化溫度對環(huán)氧基密度的影響

在NaOH溶液濃度為0.9 mol/L，NaBH4濃度為0.5 g/L，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為20%，活化時間為4 h時，研究活化溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）對環(huán)氧基密度的影響。實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5　活化溫度對微球表面環(huán)氧基密度的影響

如圖 5所示，瓊脂糖磁性微球表面環(huán)氧基密度隨活化溫度的升高先增大后減小，40℃下反應(yīng)得到的表面環(huán)氧基密度最大?；罨瘻囟壬?，有利于反應(yīng)的快速進行，但同時微球表面的環(huán)氧基的水解副反應(yīng)、與瓊脂糖微球表面其它羥基的交聯(lián)反應(yīng)速率也會加快，這三個反應(yīng)受溫度的影響程度不同。當(dāng)活化溫度小于40 ℃時，升高活化溫度，活化反應(yīng)增加的速率大于環(huán)氧基水解和交聯(lián)副反應(yīng)的速率；當(dāng)活化溫度大于40℃時，繼續(xù)升高溫度會導(dǎo)致環(huán)氧基的水解和交聯(lián)副反應(yīng)迅速增加，水解和交聯(lián)副反應(yīng)占有更強的優(yōu)勢，因而環(huán)氧基密度反而逐漸下降[11]。因此，最佳活化溫度為 40℃。

3 結(jié)論

采用環(huán)氧氯丙烷對瓊脂糖磁性微球進行了活化，考察了活化時間、NaOH濃度、環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)、NaBH4的量和反應(yīng)溫度對活化的影響，并得出了最優(yōu)的活化條件。實驗結(jié)果表明，環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖磁性微球的最有條件為活化時間為4 h，NaOH濃度為0.9 mol/L，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為40%，NaBH4濃度為0.5 g/L，反應(yīng)溫度為40℃。

[1] 史清洪,彭冠英,孫舒,等.環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠過程強化及性能評價[J].過程工程學(xué)報,2007,7(4):743-746.

[2] 霍書豪,許敬亮,張宇,等.磁性復(fù)合微球固定化酶制備過程及其研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2009, 9(3):548-551.

[3] 蘭雄雕,陳錫鴻,廖丹葵,等.磁性瓊脂糖微球固定化血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的制備及性質(zhì)[J].精細(xì)化工,2014,31(12): 1461-1470.

[4] 徐存華.磁性 SiO2微球制備及其親和分離血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究[D].南寧:廣西大學(xué),2013.

[5] 唐雪珍.微米級親和凝膠載體的制備及其親和吸附蛋白質(zhì)研究[D].上海:華東理工大學(xué),2010.

[6] 張海龍,喬昕,姚紅娟,等.多肽配基親和吸附介質(zhì)的配基密度控制規(guī)律[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝,2007,24(4): 289-295.

[7] 張松平,丁銳.無水體系中環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠制備高載量固定化金屬親和層析介質(zhì)[J].過程工程學(xué)報,2010,10(5): 971-975.

[8] 楊柳.鈷鰲合親和介質(zhì)的制備及其在六聚組氨酸融合蛋白純化中的應(yīng)用[D].西安:西北大學(xué),2008.

[9] 伍學(xué)勤,吳岑,凌曉紅,等.一種安全制備活化瓊脂糖樹脂的方法[J].生物化學(xué)與生物物理進展,2002,29(2): 328-330.

[10] 潘丹卓,陳葵,朱家文,等.瓊脂糖凝膠微球活化度的考察[J].山東化工,2010,39(3): 5-11.

[11] 張海龍,喬昕,姚紅娟,等.多肽配基親和吸附介質(zhì)的配基密度控制規(guī)律[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝,2007,24(4): 289-295.

Study on conditions for activation of agarose magnetic microspheres

This paper investigated optimal conditions for the activation of agarose magnetic microspheres, using epichlorohydrin as activating agent. The effects of activation time, sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction，NaBH4concentration and activation temperature on activation degree were investigated，according to the density of surface epoxy group . Experimental results indicated that the optimal conditions are obtained as followed：activation time, sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction, NaBH4 concentration, activation temperature and is 4 h , 0.9 mol/L, 40%, 0.5 g/L, 40 ℃, respectively.

Garose magnetic microspheres; activation;influence factors;optimum operating condition

O621.2

A

1008-1151(2015)06-0045-03

2015-05-11

吳明慧（1989－），女，供職于廣西梧州市環(huán)境監(jiān)察支隊，從事環(huán)境監(jiān)察工作。