桿狀病毒的DNA聚合酶

方 洋，楊洪桂，李俊凱，馮國忠

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州434025;2.中國水稻研究所，水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006)

1 桿狀病毒

桿狀病毒 (Baculovirus)是一類感染無脊椎動(dòng)物的病原微生物，其基因組為閉合雙鏈環(huán)狀DNA，病毒粒子呈桿狀，其基因組大小一般為80－180 kb，編碼90－180個(gè)基因。桿狀病毒分為4個(gè)屬:α桿狀病毒屬、β桿狀病毒屬、γ桿狀病毒屬與δ桿狀病毒屬 (King et al.，2012)。桿狀病毒在一個(gè)病毒復(fù)制周期內(nèi)產(chǎn)生兩種不同形態(tài)、不同功能的病毒，即芽生型病毒 (budded virus，BVs)和包埋型病毒 (occlusion derived virus，ODV)。芽生型病毒產(chǎn)生在病毒感染早期，它主要負(fù)責(zé)細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播;而在感染晚期產(chǎn)生包埋型病毒，主要在昆蟲之間進(jìn)行傳播。目前桿狀病毒廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)藥、蛋白質(zhì)表達(dá)和疫苗生產(chǎn)(Moscardi，1999;Szewczyk et al.，2006;Vicente et al.，2011;Cox，2012;Barford et al.，2013;Contreras－Gomez et al.，2014)。

2 桿狀病毒DNA的復(fù)制

桿狀病毒基因組是環(huán)狀的DNA分子，它攜帶病毒所有的遺傳信息。病毒一旦感染昆蟲細(xì)胞，病毒粒子便釋放DNA進(jìn)入細(xì)胞核基質(zhì)，病毒DNA在基質(zhì)內(nèi)開始復(fù)制。DNA復(fù)制是病毒生命周期中最重要的一環(huán)，也是病毒增殖周期中最重要的事件。桿狀病毒DNA的復(fù)制是通過順式作用元件和反式作用因子及其宿主細(xì)胞提供的復(fù)制因子相互作用來進(jìn)行的。順式作用元件指病毒DNA的復(fù)制原點(diǎn)，它包括同源重復(fù)序列 (homologous region)和非同源重復(fù)序列 (non－h(huán)omologous region)兩大類。反式作用因子即病毒DNA復(fù)制所需要的病毒表達(dá)產(chǎn)物。參與病毒復(fù)制的宿主成分目前還不清楚。對于反式作用因子，瞬時(shí)表達(dá)表明，桿狀病毒的6類基因在病毒DNA復(fù)制過程中是必需的，包括轉(zhuǎn)錄激活因子 ie－1，DNA聚合酶 (DNA polymerase，dnapol)，解旋酶基因p143，引物酶lef－1，引物酶輔助因子lef－2和DNA單鏈結(jié)合蛋白lef－3。這些基因都直接參與病毒DNA的復(fù)制，其中l(wèi)ef－1，lef－2和 lef－3為晚期表達(dá)因子 (Kool et al.，1994;Lu＆ Miller，1995;Huang＆ Levin，2001a;Sahdev et al.，2010)，在桿狀病毒的細(xì)菌人工染色體缺失實(shí)驗(yàn)中也證明dnapol、p143、ie－1和lef－3是病毒復(fù)制必需的 (Bideshi＆Federici，2000;Stewart et al.，2005;Yu ＆ Carstens，2010，2012;Feng et al.，2012)。其它基因如p35、ie－2、p38等基因能夠刺激DNA的復(fù)制。ie－1作為一個(gè)早期蛋白，是病毒復(fù)制時(shí)主要的反式作用因子，在病毒感染的早期和晚期表達(dá) (Stewart et al．，2005)。

3 DNA聚合酶基因的表達(dá)與調(diào)控

桿狀病毒的表達(dá)具有時(shí)序性，在不同的時(shí)間內(nèi)，所表達(dá)的基因不同。按照時(shí)間的先后，將桿狀病毒的基因分為兩大類，即早期基因和晚期基因，早期基因是指那些表達(dá)發(fā)生在病毒DNA復(fù)制之前的基因，它又可細(xì)分為極早期基因和滯早期基因;晚期基因是指發(fā)生在病毒DNA復(fù)制后表達(dá)的基因。實(shí)驗(yàn)表明，桿狀病毒的時(shí)序表達(dá)是通過時(shí)序之前的一組病毒基因產(chǎn)物，直接或間接的反式激活其時(shí)序之后的一組病毒基因轉(zhuǎn)錄 (Friesen，1997)。

苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒 (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)感染昆蟲細(xì)胞2 h后，DNA聚合酶的mRNA開始轉(zhuǎn)錄，在感染4－6 h后表達(dá)量達(dá)到最高，感染10 h后mRNA量急劇下降 (Tomalski et al.，1988)。AcMNPV極早期基因ie－1的表達(dá)，能夠反式激活A(yù)cMNPV DNA聚合酶的啟動(dòng)子，顯著地增強(qiáng)了DNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。由于AcMNPV的DNA聚合酶在IE－1后轉(zhuǎn)錄，又在DNA復(fù)制之前表達(dá)，因此屬于桿狀病毒的滯早期基因。AcMNPV DNA聚合酶沒有傳統(tǒng)的桿狀病毒早期基因啟動(dòng)子元件TATA盒以及起始位點(diǎn)。對AcMNPV DNA聚合酶ORF上游連續(xù)截?cái)喾治?，發(fā)現(xiàn)在起始密碼子ATG上游的210至240 bp之間為DNA聚合酶的啟動(dòng)子區(qū)域(Ohresser et al.，1994)。在DNA聚合酶的5'末端非編碼區(qū)鑒定了至少兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，一個(gè)位于ATG起始密碼子上游－120核苷酸處，另一個(gè)位于－212核苷酸處，而DNA聚合酶基因的3'端多腺苷化位點(diǎn)AATAAA與終止密碼 (+2952)重疊 (Tomalski et al.，1988)。?；页嵋苟旰硕嘟求w病毒(Spodopteras littoralis multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus，SpliNPV)DNA聚合酶也是在感染細(xì)胞2 h后轉(zhuǎn)錄，但是這個(gè)轉(zhuǎn)錄可持續(xù)到感染后的48 h，且只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本 (Huang＆Levin，2001)。家蠶核多角體病毒 (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)的DNA聚合酶也沒有TATA啟動(dòng)子元件，但是包含一個(gè)富含GC的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域。在家蠶感染細(xì)胞2 h后，能檢測到DNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄本，到感染后10 h轉(zhuǎn)錄本達(dá)到最大量，BmNPV DNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄一直持續(xù)到病毒感染后的18 h。與AcMNPV和SpliNPV的DNA聚合酶不同，BmNPV至少有7個(gè)轉(zhuǎn)錄本，且這些轉(zhuǎn)錄本在病毒感染的不同時(shí)間表達(dá) (Chaeychomsri et al.，1995)。

4 桿狀病毒DNA聚合酶的生化特征

DNA聚合酶作為病毒復(fù)制過程中的關(guān)鍵酶，忠實(shí)地復(fù)制病毒基因組的信息。在DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶通過識(shí)別RNA引物的3'－OH，以單鏈DNA為模板沿5'－3'方向不斷延伸，催化DNA的合成，在復(fù)制的過程中起聚合作用;而3'－5'核酸外切酶活性主要是校驗(yàn)和糾正DNA合成時(shí)發(fā)生的錯(cuò)誤，刪除相反方向合成的DNA，保證DNA準(zhǔn)確的復(fù)制和先導(dǎo)鏈的持續(xù)合成。

DNA聚合酶作為保守基因之一，存在于所有的桿狀病毒之中。AcMNPV DNA聚合酶的復(fù)制是在單鏈結(jié)合蛋白 (single－stranded DNA binding protein，SSB)LEF－3的共同作用下，催化鏈的置換來保持DNA的持續(xù)合成能力的 (Hang et al.，1995)。AcMNPV DNA聚合酶擁有3 kb大小的開放閱讀框，編碼984個(gè)氨基酸，分子量大小為114.31 kDa(Tomalski et al.，1988;Lu ＆Carstens，1991)。早期的生化分析研究表明，AcMNPV DNA聚合酶除了具有重要的聚合活性外，還具有3'－5'外切酶活性，但不具有5'－3'外切酶活性 (Hang＆Guarino，1999)。AcMNPV DNA聚合酶與宿主細(xì)胞的DNA聚合酶對熱的敏感性以及鹽的濃度等方面存在較大的差異，AcMNPV DNA聚合酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)抑制了宿主DNA聚合酶的活性 (Miller et al.，1981)。SpliNPV的DNA聚合酶編碼998個(gè)氨基酸的閱讀框，分子量大小為114.93 kDa。生化分析顯示純化的SpliNPV DNA聚合酶具有聚合酶活性和3'－5'外切酶活性，離體測定證實(shí)SpliNPV的DNA聚合酶能夠刺激病毒DNA的復(fù)制原點(diǎn) (Huang＆Levin，2001)。BmNPV的DNA聚合酶編碼988個(gè)氨基酸的閱讀框，分子量大小為114.65 kDa。純化的BmNPV DNA聚合酶具有3'－5'外切酶活性，但不具有5'－3'外切酶活性 (Mikhailov et al.，1986)。BmNPV的DNA復(fù)制不依賴增殖細(xì)胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)(Liu et al.，2013)。

5 桿狀病毒DNA聚合酶基因的結(jié)構(gòu)

DNA聚合酶通過兩種不同方式調(diào)節(jié)DNA復(fù)制及其保真性:(1)聚合酶結(jié)構(gòu)域選擇正確的核苷酸并將其插入到合成的引物端;(2)核酸外切酶結(jié)構(gòu)域?qū)σ雅鋵Φ膲A基進(jìn)行校正，并刪除錯(cuò)配的堿基。桿狀病毒DNA聚合酶的功能與氨基酸的結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)，對桿狀病毒氨基酸序列比對以及功能預(yù)測顯示，桿狀病毒的DNA聚合酶分為四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是:(1)N末端;(2)外切酶結(jié)構(gòu)域;(3)聚合酶結(jié)構(gòu)域;(4)C末端。其基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。目前已有一些病毒的DNA聚合酶晶體結(jié)構(gòu)被解析，如單純性皰疹病毒 (herpes simplex virus，HSV)、噬菌體 RB69的 DNA聚合酶(Franklin et al.，2001;Liu et al.，2006)，這些DNA聚合酶與桿狀病毒的DNA聚合酶均為family B的DNA聚合酶，這類蛋白在進(jìn)化上保守，暗示其在功能上具有相似性 (Blanco et al.，1991;Braithwaite＆ Ito，1993;Huang＆ Levin，2001b;Matthew et al.，2001;Gilbert，2002;Liu et al.，2006)。這些DNA聚合酶晶體結(jié)構(gòu)的解析為桿狀病毒DNA聚合酶的研究提供了便利。

圖1 DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)域Fig.1 The structural domains of DNA polymerase

5.1 外切酶結(jié)構(gòu)域

桿狀病毒DNA聚合酶外切酶結(jié)構(gòu)域具有3'－5'外切酶功能，在DNA復(fù)制過程中起校正、編輯和刪除錯(cuò)配堿基的作用。對AcMNPV DNA聚合酶氨基酸序列分析顯示，具有外切酶活性的結(jié)構(gòu)域靠近DNA聚合酶的N末端，該結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)極為保守的模序:EXOⅠ(氨基酸189－202)、EXOⅡ (氨基酸271－289)和 EXOⅢ (氨基酸387－401)(Huang＆ Levin，2001b;Feng＆ Krell，2014)，這三個(gè)模序的氨基酸為桿狀病毒DNA聚合酶的保守序列，這些保守序列與其它病毒DNA聚合酶的外切酶結(jié)構(gòu)域序列極為相似，如HSV－1、EB病毒 (Epstein－Barr Virus，EBV)等DNA病毒的DNA聚合酶。HSV－1 DNA聚合酶模序ExoIII的位點(diǎn)突變 (Y577H和D581A)導(dǎo)致DNA聚合酶失去了外切酶活性，帶有突變的重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在細(xì)胞中檢測不到病毒基因組的復(fù)制。模序ExoI(D368A和E370A)和ExoIII(Y577F和D581A)的點(diǎn)突變也導(dǎo)致了外切酶活性的喪失，證實(shí)這些保守的區(qū)域與外切酶活性有關(guān) (Kuhn＆Knopf，1996;Hwang et al.，1998;Tian et al.，2009)。另外，HSV－1 DNA聚合酶的外切酶結(jié)構(gòu)域ExoⅢ的突變不僅造成外切酶功能的缺陷，導(dǎo)致了更高的突變率，而且還改變了對藥劑的敏感性(Hwang，1997;Hwang et al.，1998)。HSV －1 DNA聚合酶ExoII(D471A)的點(diǎn)突變導(dǎo)致外切酶活性減弱，從而消弱了這些突變重組病毒的復(fù)制和感染能力，這些點(diǎn)的突變都發(fā)生在外切酶結(jié)構(gòu)域中 (Joyce＆ Steitz，1994;Hall et al.，1995;Liu et al.，2006)。桿狀病毒的外切酶結(jié)構(gòu)域模序與這些病毒DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域相似，暗示外切酶結(jié)構(gòu)域中三個(gè)保守模序也具有同樣的功能。

5.2 聚合酶結(jié)構(gòu)域

聚合酶結(jié)構(gòu)域的功能是選擇正確的核苷酸并將其插入到正在合成的引物端。氨基酸序列分析以及功能預(yù)測顯示桿狀病毒的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域由七個(gè)保守模序 (motif)組成，其結(jié)構(gòu)順序依次為:Ⅳ－Ⅱ －Ⅵ －Ⅲ －Ⅰ －Ⅶ －Ⅴ (Hall et al.，1989;Chaeychomsri，1995;Hwang et al.，2003)。在DNA聚合酶中，RegionⅣ并沒有與聚合酶結(jié)構(gòu)域連接在一起，而是在外切酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。因?yàn)榫酆厦附Y(jié)構(gòu)域的模序Ⅱ－Ⅵ－Ⅲ－Ⅰ－Ⅶ－Ⅴ晶體幾何圖形類似于人的手，因此又把它分為palm、fingers和thumb三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。其中 RegionⅢ和Ⅵ屬于 fingers亞結(jié)構(gòu)域，RegionⅠ、Ⅱ和Ⅶ在palm亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)，thumb亞結(jié)構(gòu)域包括RegionⅤ (Franklin et al.，2001;Liu et al.，2006)。RegionⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅶ的保守區(qū)域在底物識(shí)別中起著直接或間接作用，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表HSV－1和噬菌體RB69 DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)，這些保守區(qū)域參與了dNTPs、引物與模板DNA間的相互作用 (Franklin et al.，2001;Liu et al.，2006)。兩個(gè)抗病毒藥劑 aphidicolin和abacavir誘導(dǎo)了AcMNPV DNA聚合酶在RegionⅡ和RegionⅢ的點(diǎn)突變 (C543R和S611T)，而這兩個(gè)點(diǎn)的突變減少了DNA的復(fù)制，也降低了病毒的滴度 (Feng et al.，2012)，證實(shí)這兩個(gè)區(qū)域直接參與了病毒DNA的復(fù)制。HSV－1的DNA聚合酶在RegionⅦ中的點(diǎn)突變 (Y937H)增加了對藥劑acyclovir和foscarnet的抗藥性，推測regionⅦ可能與核苷酸的識(shí)別和結(jié)合有關(guān) (Hwang et al.1992)，水痘 －帶狀皰疹病毒 (varicella－zoster virus，VZV)DNA聚合酶在regionⅢ的位點(diǎn)突變 (N779S和G805C)以及在Region I的位點(diǎn)突變 (V855M)增加了對acyclovir(ACV)和phosphonoacetic acid(PAA)的抗藥性，暗示這些位點(diǎn)的變化導(dǎo)致了蛋白質(zhì)構(gòu)像的變化，同時(shí)也預(yù)示這些位點(diǎn)參與了核苷酸的識(shí)別 (Kamiyama et al.，2001)。HSV－1 RegionⅥ的位點(diǎn)突變 (L774F)增加了DNA復(fù)制的效率與精確性 (Tian et al.，2009)。在RegionⅠ和RegionⅥ突變的HSV－1重組病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后與野生型病毒比較，結(jié)果顯示突變后的重組病毒對藥劑敏感性有所改變，同時(shí)也提高了DNA復(fù)制的保真性 (Marcy et al.，1990)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，聚合酶結(jié)構(gòu)域的各個(gè)模序在dNTP的結(jié)合、鏈的延伸上具有重要的功能。

圖2 AcMNPV DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域的模序Fig.2 The modifs of AcMNPV DNA polymerase structural domains

5.3 DNA聚合酶的C末端和N末端

Family B的類αDNA聚合酶的外切酶結(jié)構(gòu)域和聚合酶結(jié)構(gòu)域序列高度保守，因此在功能上也具有相似性，迄今為止已有大量關(guān)于聚合酶結(jié)構(gòu)域和外切酶結(jié)構(gòu)域的研究，但是對DNA聚合酶C末端的報(bào)道不多。目前對DNA聚合酶C末端的報(bào)道也僅限于 AcMNPV和 HSV－1的 DNA聚合酶(Monahan et al.，1993;Feng et al.，2012)。對AcMNPV DNA聚合酶的研究證實(shí)，在其C末端包含一個(gè)單分型的核定位信號(hào)和一個(gè)經(jīng)典的多分型核定位信號(hào)，這兩個(gè)核定位信號(hào)對于DNA聚合酶的入核是至關(guān)重要的，缺失掉其中的任何一個(gè)，DNA聚合酶都不能進(jìn)入核內(nèi)。另外，在AcMNPV DNA聚合酶C末端的972－981位點(diǎn)還包含一個(gè)典型的模序 (NNTYKFCLYK)，這個(gè)模序存在于所有α桿狀病毒，對這個(gè)區(qū)域的位點(diǎn)突變導(dǎo)致病毒無法傳播，同時(shí)也影響了病毒的復(fù)制，暗示這個(gè)區(qū)域具有重要的功能，對其功能的鑒定有待深入的研究 (Feng et al.，2014)。與AcMNPV DNA聚合酶相似的HSV－1 DNA聚合酶C末端也具有重要的功能，它與能夠增加DNA延伸作用的附屬蛋白UL42相互作用，從而激活了UL42的活性，證實(shí)HSV－1 DNA聚合酶C末端同樣也具有重要的功能 (Monahan et al.，1993;Digard et al.，1993)。

目前，除HSV－1 DNA聚合酶N末端外，其他病毒尚未見報(bào)道 (Terrell＆Coen，2012)。Liu等(2006)根據(jù)HSV－1 DNA聚合酶的N末端氨基酸序列比對結(jié)果，結(jié)合已發(fā)表的HSV－1 DNA聚合酶晶體結(jié)構(gòu)，推測N末端第1－140保守序列在病毒的復(fù)制過程中或許具有重要功能。通過缺失聚合酶N末端氨基酸1－51位點(diǎn)以及位點(diǎn)突變氨基酸序列44－49并構(gòu)建重組病毒，發(fā)現(xiàn)這些重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，這兩個(gè)缺失體的病毒DNA在細(xì)胞中不能正常合成，證實(shí)DNA聚合酶N末端與5'－3'聚合酶活性有關(guān) (Terrell＆Coen，2012)。

6 DNA聚合酶的核定位信號(hào)

真核細(xì)胞的細(xì)胞核有核膜包被，核膜上的核孔復(fù)合體 (nuclear pore complex，NPC)是細(xì)胞核內(nèi)外進(jìn)行物質(zhì)交換的主要通道，蛋白質(zhì)或多肽自由通過NPC的能力取決于他們的大小:一般分子量小于5 kD的小分子蛋白或多肽可以自由的通過NPC;分子量在5－50 kD的蛋白，通過被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入細(xì)胞核;分子量大于50 kD的蛋白只能通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞核。通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞核的蛋白質(zhì)必須在其序列上擁有特殊的信號(hào)，即核定位信號(hào) (nuclear localization signal，NLS)。NLS被相應(yīng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識(shí)別，并與核孔蛋白相互作用，幫助攜帶NLS信號(hào)的蛋白通過核孔到達(dá)細(xì)胞核 (Quimby＆Dasso，2003)。

目前已鑒定的NLS主要有以下類型:(I)單分型NLS(monopartite NLS)。單分型NLS是一段由4－8個(gè)氨基酸組成的富含堿性氨基酸的短肽，在其中部一般包含4個(gè)或4個(gè)以上精氨酸和/或賴氨酸，兩端是酸性氨基酸或脯氨酸或甘氨酸(Shields＆Yang，1997)。單分型的核定位信號(hào)分為5種類型:①KR(K/R)R或K(K/R)RK;② (P/R)XXKR(^DE)(K/R);③KRX(W/F/Y)XXAF;④ (R/P)XXKR(K/R)(^DE);⑤LGKR(K/R)(W/F/Y)，其中X代表任何一種氨基酸，^DE為除酸性氨基酸 (天冬氨酸和谷氨酸)之外的氨基酸。(Ⅱ)雙分型NLS(bipartite NLS)。雙分型NLS中間間隔10－12個(gè)氨基酸殘基，這類核定位信號(hào)的特征是由兩簇堿性氨基酸組成，兩簇堿性序列之間被10－12個(gè)非保守的氨基酸殘基間隔，其序列通式可表示為 R/K(X)10－12RRKK，X代表任何一種氨基酸 (Lange et al.，2007;Kosugi et al.，2009)。 (Ⅲ)其它類型的NLS。除了上述單分型和雙分型的NLS外，還有一些無一定序列特征的NLS，他們主要存在于能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭的蛋白質(zhì)中，M9、Rev等均具有這種特征 (Bohnlein et al.，1991，Wu et al.，1999)。

核定位信號(hào)在桿狀病毒蛋白中的存在十分廣泛，尤其是與病毒復(fù)制和裝配相關(guān)的桿狀病毒蛋白。這些蛋白包含單分型或多分型的NLS，暗示這些蛋白的入核與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān) (Olson et al.，2002;Chen＆ Carstens，2005;Wang et al.，2008;Guo et al.，2010)。AcMNPV的DNA聚合酶C末端包含兩個(gè)核定位信號(hào)模序，其中一個(gè)在DNA聚合酶的氨基酸位點(diǎn)939－948，其氨基酸序列為CSVKRKRDDD，具有典型的KRKR信號(hào)，為單分型①型核定位信號(hào);另一個(gè)在DNA聚合酶的氨基酸位點(diǎn) 804－827，其氨基酸序列為DNPGKKRKSTDDNEGPSPKRRVIT，為典型的雙分型核定位信號(hào)，這兩個(gè)核定位信號(hào)共同介導(dǎo)了DNA聚合酶的入核 (Feng＆Krell，2014)。我們也對已發(fā)表的63個(gè)桿狀病毒DNA聚合酶進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示α桿狀病毒的groupⅠ多個(gè)DNA聚合酶的C末端包含至少兩個(gè)核定位信號(hào)，其中一個(gè)為雙分型的核定位信號(hào)，另一個(gè)為單分型的核定位信號(hào)，且這些單分型的核定位信號(hào)多為①型或④型。但是對于桿狀病毒α屬的groupⅡ，β，δ和γ的DNA聚合酶，只有7個(gè)能夠預(yù)測到核定位信號(hào)，且這些核定位信號(hào)多為單分型①型，僅有斜紋夜蛾核多角體病毒 (Spodoptera litura NPV，SpliNPV)的DNA聚合酶核定位信號(hào)為單分②型。其余的37個(gè)桿狀病毒DNA聚合酶不能預(yù)測到核定位信號(hào)，暗示這些DNA聚合酶包含新的核定位信號(hào) (Feng＆ Krell，2014)。

7 DNA聚合酶與病毒結(jié)構(gòu)

桿狀病毒在其復(fù)制周期中產(chǎn)生兩種不同表型的病毒BV和ODV。這兩種不同表型的病毒不僅功能不同，而且在結(jié)構(gòu)的組分上也存在差異。它們都具有衣殼和囊膜，且由多種蛋白組成。對AcMNPV多角體病毒蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，包埋型病毒的核衣殼和囊膜涉及約44個(gè)病毒編碼蛋白，其中DNA聚合酶為包埋型病毒的結(jié)構(gòu)蛋白之一 (Braunagel et al.，2003)。

DNA聚合酶點(diǎn)的突變也影響了病毒粒子的結(jié)構(gòu)和多角體的形成。AcMNPV DNA聚合酶在藥劑的影響下產(chǎn)生了單點(diǎn)突變 (C543R)和雙點(diǎn)突變(C543R/S611T)，這兩種點(diǎn)突變的DNA聚合酶補(bǔ)回到缺失DNA聚合酶的細(xì)菌人工染色體上，產(chǎn)生了APCrep(C543R)和ABCrep(C543R/S611T)兩種補(bǔ)回型病毒。構(gòu)建的重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)ABCrep產(chǎn)生單粒包埋的多角體，APCrep既有單粒包埋的多角體，又有多粒包埋的多角體，而野生補(bǔ)回型 (WTrep)基本上是多粒包埋的病毒多角體。另外，ABCrep產(chǎn)生的多角體直徑約為 2.3μm，APCrep產(chǎn)生的多角體直徑約為1.71μm，這兩種突變補(bǔ)回型病毒的多角體顯著大于WTrep的1.45μm(Feng et al.，2012)。桿狀病毒的DNA聚合酶是怎樣影響病毒粒子和多角體的形成有待深入的研究。

8 結(jié)語

DNA聚合酶既是病毒復(fù)制的重要酶，也是許多抗病毒藥劑的靶標(biāo)。深入地研究病毒DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能，對理解病毒的復(fù)制機(jī)理具有重要意義。桿狀病毒的DNA聚合酶與其它DNA病毒DNA聚合酶同屬Family B的類α家族，因此在許多方面具有相似性 (Braithwaite＆Ito，1993;Franklin et al.，2001)。本文通過總結(jié)桿狀病毒DNA聚合酶的表達(dá)調(diào)控與生化特征、基因組結(jié)構(gòu)及其功能，闡述了桿狀病毒DNA聚合酶與病毒復(fù)制的相互關(guān)系。除此之外，桿狀病毒DNA聚合酶也在病毒的裝配和多角體的形成過程中發(fā)揮了重要作用，且在這些過程中擔(dān)任了不同角色。桿狀病毒作為模式DNA病毒之一，其基因結(jié)構(gòu)和功能的研究將推動(dòng)其它動(dòng)物病毒的研究與發(fā)展。如桿狀病毒DNA聚合酶像其它DNA聚合酶一樣，對許多抗病毒藥劑敏感 (Thumbi et al.，2007)，由于桿狀病毒只感染無脊椎動(dòng)物而對人類安全，因此桿狀病毒也可作為理想的抗病毒藥物篩選體系。

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