健康和感染黃龍病沙糖桔嫩梢揮發(fā)性成分的分析

楊玉枝，徐 迪，岑伊靜

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣州510642)

柑桔黃龍病 (huanglongbing，HLB)是柑桔屬的一種毀滅性病害 (Aubert，1987;Teixeira et al.，2005;Bové，2006)，感病植株表現(xiàn)出葉片斑駁型、均勻黃化型、缺素型黃化和紅鼻子果等癥狀，最終失去結(jié)果能力。黃龍病給全世界柑桔生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。亞洲柑桔木虱Diaphorina citri Kuwayama也稱柑桔木虱，是黃龍病亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus和美洲種 Candidatus Liberibacter americus主要的媒介昆蟲，在我國主要分布于廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、浙江、云南、四川、江西、海南、湖南、貴州等長江流域以南的11個(gè)省區(qū) (杜丹超等，2011)，寄主植物為柑桔、橙、柚、檸檬、酸橙、九里香、黃皮等蕓香科植物，是柑桔類新梢期的主要害蟲，以成、若蟲吸食汁液為害為主，引起嫩梢干枯、萎縮、新葉扭曲畸形，若蟲排泄出白色分泌物蜜露能引起柑桔煤煙病，影響光合作用 (黃邦侃，1953;Tsai et al.，2000)。

植物次生物質(zhì)在植食性昆蟲寄主植物選擇過程中起著化學(xué)信號(hào)作用，可能影響昆蟲的取食、發(fā)育和產(chǎn)卵等行為 (戴建青等，2010)。Nadarasah等 (2011)研究表明，在長期的進(jìn)化過程中，植物的病原菌通過媒介昆蟲傳播，病原菌－媒介昆蟲－寄主植物三者間的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，植物病原菌的特異性致病因子能夠在特定的寄主植物上寄生并造成危害，也有可能使昆蟲成為它們的選擇性寄主。柑桔黃龍病的田間傳播和流行與柑桔木虱的帶菌及其活動(dòng)有十分密切的關(guān)系，柑桔木虱若蟲在感染黃龍病及健康寄主上的水平位置轉(zhuǎn)移過程中若蟲更趨向黃龍病植株(吳豐年等，2013)。可以推測，與健康柑桔相比，黃龍病柑桔揮發(fā)物含有對(duì)柑桔木虱具有吸引作用的關(guān)鍵物質(zhì)或關(guān)鍵物質(zhì)含量的變化，為此本文采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用 (GC/MS)分析了健康沙糖桔和黃龍病沙糖桔嫩梢揮發(fā)物的成分，為更有效地綜合利用信息化合物進(jìn)行預(yù)測預(yù)報(bào)和調(diào)控柑桔木虱行為提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

健康沙糖桔 Citrus reticulate Blanco.cv.Shatangju:廣東省博羅縣柑桔研究所苗圃培育的3年生無病苗，在防蟲網(wǎng)室內(nèi)隔離種植，通過Nested－PCR檢測確定不攜帶黃龍病亞洲種病原菌。

黃龍病沙糖桔:從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃龍病研究室繁育的沙糖桔黃龍病盆栽苗上采集病芽，嫁接到健康沙糖桔上使其感染黃龍病。一年后病苗表現(xiàn)典型黃龍病癥狀并通過Nested－PCR檢測呈黃龍病亞洲種陽性。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

QCD－1500型大氣采樣儀，中國鹽城銀河科技有限公司;DVB/CAR/PDMS 50/30 um萃取頭，美國 Supelco公司;GCMS－QP2010氣相色譜－氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本 Shimadzu公司;Teflon采樣袋(30 cm×26 cm)，大連海得科技有限公司。

1.3 頂空固相微萃取健康和黃龍病沙糖桔嫩梢揮發(fā)物

用Teflon(30 cm×26 cm)采樣袋套住供試沙糖桔樹苗樹冠，用橡皮筋將袋口捆扎在樹干上，密封至不漏氣。用大氣采樣儀把采樣袋里的氣體抽干 (約15 min)，然后向采樣袋里充入通過活性炭和蒸餾水過濾的空氣待充氣量達(dá)到約采樣袋容量的2/3時(shí) (約12 min)，關(guān)停大氣采樣儀用并止水夾掐住采樣袋的硅膠管以密封。靜置平衡24 h后，把固相微萃取裝置的針頭插入采樣袋內(nèi)萃取氣味，頂空萃取45 min。

1.4 健康和黃龍病沙糖桔嫩葉揮發(fā)物的GC-MS分析

將萃取頭插入GC/MS進(jìn)樣口，250℃熱脫附樣品5 min進(jìn)色譜柱分析。條件參照 (萬珊等，2010)并稍作修改，GC:色譜柱為HP－5毛細(xì)管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 um)，載氣為高純氦氣，載氣流速為1 mL/min，無分流進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度:250℃，起始色譜溫度 45℃保持 3 min，3℃/min梯度上升至135℃，并保持2 min，然后8℃/min升到250℃，再保持5 min。MS:EI檢測器，接口溫度280℃，離子源溫度230℃，離子能70 ev，掃描質(zhì)量范圍40－500 amu/s，對(duì)采集得到的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行核對(duì)并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康和黃龍病沙糖桔揮發(fā)性化合物分析

采集的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)GC－MS的總離子流色譜檢測分析鑒定，健康沙糖桔和黃龍病沙糖桔嫩梢揮發(fā)性成分均含有烯烴類、醇類、醛類、酯類等物質(zhì) (表1)。其中健康沙糖桔的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)主要含有14種，含量從高到低依次為β－欖香烯(17.0%)、β－羅 勒 烯 (15.22%)、β－水 芹 烯(14.29%)、芳樟醇 (10.3%)、Z－石竹烯 (7.07%)、甘香烯 (5.63%)、α－萜品烯 (5.26%)、大根香葉烯(3.82%)、α－石竹烯 (3.53%)、月桂烯 (3.52%)、α－法尼烯 (3.3%)、α－松油醇 (1.81%)、α－甜橙醛(1.19%)、D－檸檬烯 (1.02%);感病沙糖桔中揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)主要有13種，含量從高到低依次為β－水芹烯 (59.98%)、β－欖香烯 (9.04%)、α－蒎烯(6.23%)、3－側(cè)柏烯 (3.21%)、檸檬烯 (3.07%)、芳樟醇 (2.39%)、γ－欖香烯 (2.11%)、Z－石竹烯(1.70%)、2－蒈烯 (1.61%)、γ－萜品烯 (1.57%)、月桂烯 (1.13%)、β－松油醇 (1.12%)、β－羅勒烯(0.94%)。

2.2 健康沙糖桔和黃龍病沙糖桔揮發(fā)物相同組分化合物的含量變化

健康沙糖桔和感染黃龍病沙糖桔都釋放的相同化合物中，有些成分的含量差異比較明顯，在感染黃龍病沙糖中，月桂烯、β－羅勒烯、芳樟醇、α－松油醇、β－欖香烯、2－石竹烯、α－石竹烯、大根香葉烯、α－法尼烯、D－蓽澄茄烯、β－桉葉醇等物質(zhì)含量明顯低于健康的，而3－側(cè)柏烯、a－蒎烯、β－水芹烯、a－水芹烯、γ－萜品烯、β－松油醇、4－萜烯醇、2－蒈烯等物質(zhì)的含量則明顯高于健康的。

2.3 健康沙糖桔和黃龍病沙糖桔嫩梢揮發(fā)物化學(xué)組分的差異

健康沙糖桔和感染黃龍病沙糖桔釋放揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)組分差異較大，其中α－萜品烯、D－檸檬烯、(3E)－羅勒烯、甘香烯、(－)－馬兜鈴烯 、雅欖藍(lán)烯、α－欖香醇、大根香葉烯B、D－4－大香葉烯醇、石竹烯氧化物、表藍(lán)桉醇、匙葉桉油烯醇、α－甜橙醛僅存在于健康沙糖桔嫩梢中，而檸檬烯、反式－α－香檸檬烯、γ－欖香烯、香橙烯、(+)－表－雙環(huán)倍半水芹烯、β－芹子烯僅存在于感染黃龍病沙糖桔嫩梢中。

表1 健康和感染黃龍病的沙糖桔嫩梢揮發(fā)物主要成分及相對(duì)含量Table 1 Components and contents of the volatiles from young shoots of HLB-infected and non-infected citrus

續(xù)上表

續(xù)上表

3 結(jié)論與討論

本文利用頂空固相微萃取方法提取分析了健康和黃龍病沙糖桔嫩梢揮發(fā)物的成分，結(jié)果顯示健康柑桔嫩梢揮發(fā)物的主要組分為β－欖香烯(17.0%)、β－羅 勒 烯 (15.22%)、β－水 芹 烯(14.29%)，黃龍病柑桔嫩梢揮發(fā)物的主要組分為β－水芹烯 (59.98%)、β－欖香烯 (9.04%)。Westbrook等 (2011)在田間調(diào)查了柑桔木虱對(duì)健康柑桔類寄主植物和蕓香科寄主植物嫩葉的趨性，發(fā)現(xiàn)調(diào)料九里香Bergera koenigii L.最能吸引柑桔木虱成蟲。Robbins等 (2012)用頂空動(dòng)態(tài)收集調(diào)料九里香的揮發(fā)物，發(fā)現(xiàn) β－水芹烯含量最高，達(dá)48.3%，這與本文利用固相微萃取黃龍病沙糖桔揮發(fā)物收集到的最高含量β－水芹烯 (59.98%)的結(jié)果相似。β－水芹烯對(duì)柑桔木虱的吸引作用值得進(jìn)一步研究。

健康和黃龍病沙糖桔嫩梢釋放的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)種類差異較大，相同組分化合物的含量差異比較明顯，這有可能是病原菌與寄主植物接觸后，特別是真菌及細(xì)菌性病原會(huì)釋放出如糖蛋白、多糖類、脂肪酸和勝肽等類物質(zhì)，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生防御機(jī)制，從而改變寄主植物的揮發(fā)性物質(zhì)、次級(jí)代謝產(chǎn)物以及營養(yǎng)組分 (Blua et al.，1992)。病原體可以誘導(dǎo)它們的寄主產(chǎn)生某些物質(zhì)，具有引誘媒介昆蟲的物質(zhì)來增加植物、昆蟲和病原菌間相互作用 (Mayer et al.，2008a，2008b)。植物的保護(hù)機(jī)制可以通過產(chǎn)生信息化學(xué)物質(zhì)或有毒物質(zhì)來抵御再次取食，或間接產(chǎn)生某些化學(xué)物質(zhì)來吸引天敵 (Kessler and Baldwin，2001;Kost and Heil，2006;Stout et al.，2006)。植物感病后，病原菌可以誘導(dǎo)宿主植物釋放某些有利于他們生長、傳播或抑制植物的防御作用的化學(xué)物質(zhì)。Mayer等(2008a)報(bào)道，蘋果感染病原菌“Candidatus phytoplasma mali”后會(huì)引起蘋果釋放更多的β－石竹烯 (β－caryophyllene)，這種化學(xué)物質(zhì)能引誘媒介昆蟲蘋果木虱Cacopsylla picta，從而促進(jìn)病原菌的傳播。Mann等 (2012)研究表明柑桔感染黃龍病菌后能誘導(dǎo)植物釋放一種特殊的化學(xué)物質(zhì)——水楊酸甲酯，吸引柑桔木虱趨向被感染的植株，但是柑桔木虱最終會(huì)回到健康植株并且長期生存，有可能是因?yàn)閹Р≈仓晟系臓I養(yǎng)物質(zhì)無法滿足木虱的生長發(fā)育。寄主感染植物性病原菌對(duì)其媒介昆蟲的行為造成影響，促進(jìn)其種群擴(kuò)散，促進(jìn)了黃龍病病原菌的傳播。揭示寄主植物吸引柑桔木虱的機(jī)制將為有效地綜合利用信息化合物進(jìn)行預(yù)測預(yù)報(bào)和調(diào)控柑桔木虱行為提供依據(jù)。

致謝:在研究過程中得到華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室碩士研究生曾麗霞、烏天宇及本科生羅孝竹等同學(xué)無私的幫助和支持，在此表示衷心的感謝。

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