AMPA受體參與大鼠胸髓前角發(fā)育早期突觸傳遞的生理學(xué)特點①

張雯秀，段紅梅，謝雅彬，李曼麗，楊朝陽，李曉光

·基礎(chǔ)研究·

AMPA受體參與大鼠胸髓前角發(fā)育早期突觸傳遞的生理學(xué)特點①

張雯秀1，段紅梅2，謝雅彬1，李曼麗2，楊朝陽1，李曉光1

目的探討α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體參與大鼠脊髓發(fā)育早期突觸傳遞的生理學(xué)特點。方法選取胎齡17 d(E17,n=12)和20 d(E20,n=12)的Wistar大鼠以及新生7 d(P7,n=12)的Wistar大鼠共計36只。胸髓鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)免疫熒光染色觀察AMPA受體的分布，電生理平面微電極陣列記錄技術(shù)(MED-64系統(tǒng))檢測AMPA受體參與突觸傳遞的場興奮性突觸后電位(fEPSP)的變化。結(jié)果E17大鼠脊髓灰質(zhì)開始出現(xiàn)少量CaMKⅡ陽性神經(jīng)元，E20、P7大鼠脊髓周圍CaMKⅡ陽性神經(jīng)元逐漸向內(nèi)遷移，神經(jīng)元的數(shù)量不斷增多。電生理結(jié)果顯示，E17、E20、P7大鼠誘發(fā)的fEPSP數(shù)量依次增多，并能夠被6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)阻斷，脊髓灰質(zhì)內(nèi)突觸聯(lián)系的空間網(wǎng)絡(luò)范圍顯著減小(P＜0.001)。結(jié)論AMPA受體參與大鼠脊髓早期發(fā)育，并作為脊髓前角神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中功能性突觸聯(lián)系的主要興奮型受體。

α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體；脊髓發(fā)育；場興奮性突觸后電位；突觸聯(lián)系；大鼠

[本文著錄格式] 張雯秀，段紅梅，謝雅彬，等.AMPA受體參與大鼠胸髓前角發(fā)育早期突觸傳遞的生理學(xué)特點[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(12):1385-1390.

CITED AS:ZhangWX,Duan HM,Xie YB,etal.Physiological characteristics of synaptic transm ission of anteriorhorn early development in thoracic spinal cordmediated by AMPA receptors in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1385-1390.

脊髓在發(fā)育過程中，中央管的室管膜細(xì)胞逐漸增殖、遷移，并分化形成不同類型的神經(jīng)元。神經(jīng)元按照釋放遞質(zhì)的不同分為膽堿能神經(jīng)元、氨基酸能神經(jīng)元、肽能神經(jīng)元及胺能神經(jīng)元。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-am ino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性突觸后谷氨酸能神經(jīng)元受體，與N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體同屬離子型谷氨酸受體家族，由4個亞基(GluA1～GluA4)組成，具有功能性配體門控離子型通道[1-3]。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組

Wistar健康雌性大鼠18只，SPF級，體質(zhì)量220～250 g；雄性大鼠9只，體質(zhì)量300～350 g。均由首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

在動物部(溫度24～26℃，濕度50%)飼養(yǎng)1周后，按照雌∶雄=2∶1的比例進(jìn)行合籠，動物自由取食、飲水，于合籠第2天開始觀察，若觀察到有陰栓視為懷孕(E0)，將懷孕后的雌鼠單籠飼養(yǎng)并標(biāo)記分組，仔鼠出生當(dāng)日視為P0。依次分為E17組(n=12)、E20組(n= 12)、P7組(n=12)。

1.1.2主要試劑和儀器

小鼠抗微管相關(guān)蛋白2(m icrotubule associated protein 2,MAP2)單克隆抗體、兔抗CaMKⅡ多克隆抗體、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione,CNQX)：SIGMA公司。A lexa 594山羊抗兔和Alexa 488山羊抗小鼠熒光二抗：INVITROGEN公司。Hoechst33342：SIGMA公司。

P515A探針MED64 Probe：日本ALPHA MED SCIENTIFIC。SHA-22L蓋網(wǎng)及錨：HARVARD， USA。CM 1850恒冷切片機(jī)：德國LEICA。DTK-1000振動切片機(jī)：日本DSK。DP73 CCD顯微照相機(jī)：OLYMPUS。BX51熒光顯微鏡：OLYMPUS。

1.2方法

1.2.1灌流切片

孕鼠6%水合氯醛0.6m l/100 g腹腔麻醉，0.9%氯化鈉300m l快速心臟灌注10m in后再慢速灌注約30 m in，換4%多聚甲醛500m l心臟慢速灌注約40m in，剖腹取出E17、E20胎鼠，并將脊髓完整取出，置于4%多聚甲醛(pH 7.2)中固定8 d后換30%蔗糖脫水，直到脊髓完全沉底；P7仔鼠同樣用6%水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)心臟灌注后取出脊髓，固定過夜換30%蔗糖脫水直至完全沉底，取胸髓節(jié)段。-25℃恒冷切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，厚20μm，貼片并于-20℃冰箱保存。

1.2.2免疫熒光染色

切片從-20℃冰箱取出晾干并復(fù)溫至室溫。分別用蒸餾水及PBST各漂洗5m in，3次，用10%正常山羊血清NGS室溫封閉30m in，加入小鼠抗MAP2和兔抗CaMKⅡ一抗混合液(均為1∶200)，4℃冰箱孵育60 h。PBST漂洗5m in，3次，加入A lexa 594標(biāo)記山羊抗兔和A lexa 488標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗混合液(均為1∶100)，室溫孵育8 h。PBST漂洗5 m in，3次，Hoechst33342(1∶2000)復(fù)染核，室溫5 min，PBST漂洗5m in，蒸餾水漂洗5m in，2次，防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡鏡檢并拍照保存。

1.2.3電生理記錄

1.2.3.1脊髓薄片制備

孕鼠用6%水合氯醛0.6m l/100 g腹腔麻醉，分別取出胎鼠。出生后大鼠用6%水合氯醛0.6m l/100 g腹腔麻醉。依次分離皮膚、肌肉及椎板并將脊髓完全暴露，將完全剝離的脊髓置于冰水混合的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中靜置30 s后，光學(xué)顯微鏡下分離出胸段脊髓并剝?nèi)ビ布鼓ぁ⑿拚玫募顾韫潭ㄔ谡駝忧衅瑱C(jī)浴槽的底板上，切取厚350～400μm的冠狀胸段脊髓片，將脊髓片置于通有95% O2和5%CO2混合氣的孵育液中，孵育1.5～2 h。

1.2.3.2MED-64平面微電極陣列記錄

探針MED64 Probe使用前用0.1%聚氮丙啶(polyethylenim ine,PEI)硫化物硼酸鹽過夜處理，并在實驗前用蒸餾水反復(fù)沖洗5次。脊髓經(jīng)過1.5～2 h孵育后，選取一張結(jié)構(gòu)清晰完整的脊髓片移入到MED64 Probe中，在倒置顯微鏡(Olympus,SZ51)下找到脊髓前角區(qū)域，調(diào)整位置直到64個電極點全部覆蓋在脊髓前角區(qū)域，用蓋網(wǎng)及錨固定脊髓片，使用蠕動泵(M inipuls3,Gilson)持續(xù)灌流通有混合氣(95%O2和5%CO2)的ACSF，流速為2～5m l/m in。持續(xù)灌流20m in并檢測灌流噪聲，待灌流噪聲穩(wěn)定在±5μV時開始記錄。刺激強(qiáng)度依次從30～199μA進(jìn)行選取，選擇能夠引起40%～60%最大反應(yīng)強(qiáng)度的電流強(qiáng)度進(jìn)行記錄，刺激頻率為0.1 Hz。開始記錄20m in后以AMPA受體阻斷劑6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione,CNQX)10μmol/L灌流，待興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)振幅明顯下降后進(jìn)行洗脫。用CCD顯微照相機(jī)采集脊髓片MED-64 Probe圖像。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potentials,fEPSP)數(shù)量根據(jù)MED-64通道中能夠記錄到fEPSP的通道數(shù)量計算。fEPSP振幅選取10ms為時間窗，以基線0 μV為起始到fEPSP波谷的距離記為反應(yīng)振幅。電生理統(tǒng)計的下降率按(基線－給藥)/基線×100%計算。所有計量資料采用(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1免疫熒光染色

E17大鼠MAP2與CaMKⅡ雙陽性細(xì)胞數(shù)較少，神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，沒有明顯的樹突及軸突形態(tài)(圖1A、圖1a)。E20和P7大鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，灰質(zhì)所占比例減小，神經(jīng)元形態(tài)逐漸發(fā)育完善，形成具有樹突及軸突的多角形神經(jīng)元(圖1B、圖1b和圖1C、圖1c)。

圖1　三組大鼠脊髓前角MAP2(綠)與CaMKⅡ(紅)免疫熒光染色

2.2fEPSP

E17、E20和P7大鼠給予最佳刺激，在刺激點周圍可以觀察到兩種波形不同的電位反應(yīng)(圖2)。fEPSP數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果顯示，從E17到P7，誘發(fā)的fEPSP數(shù)量逐漸增多(P＜0.001)。見圖3。fEPSP振幅顯著減小(P＜ 0.001)。見圖4。

CNQX灌流脊髓切片后，可以觀察到fEPSP的振幅顯著降低，洗脫后基本恢復(fù)。見圖5。

對比給藥前，三組給藥后fEPSP的振幅分別顯著減小(68.04±3.34)%、(88.72±2.90)%、(81.93±3.86)% (P＜0.001)。見圖6。

圖2　MED-64系統(tǒng)記錄大鼠脊髓前角fEPSP放電分布情況

圖3　三組大鼠脊髓前角fEPSP放電數(shù)量(n=6)

圖4　三組大鼠脊髓前角fEPSP振幅變化(n=6)

圖5　應(yīng)用AMPA受體競爭性拮抗劑CNQX阻斷大鼠脊髓前角fEPSP振幅變化情況(CCD顯微照相機(jī)攝)

圖6　應(yīng)用AMPA受體競爭性拮抗劑CNQX阻斷大鼠脊髓前角fEPSP振幅變化情況

3　討論

CNS損傷一直被認(rèn)為是中樞神經(jīng)修復(fù)的一個重大難題，其中研究CNS發(fā)育是現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域了解CNS再生后神經(jīng)元變化的主要方式。AMPA受體作為哺乳動物CNS中重要的興奮性谷氨酸非NMDA離子型受體，介導(dǎo)CNS中快興奮性突觸傳遞，主要參與CNS神經(jīng)發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近期研究發(fā)現(xiàn)，AMPA受體主要分布在大腦海馬[9]及小腦[10-11]的一些腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的突觸后膜上，并參與學(xué)習(xí)和記憶活動[12]。但是對于AMPA受體在脊髓中的作用及功能卻鮮有報道。

MED-64通道系統(tǒng)作為近年來研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的一種新型技術(shù)，已經(jīng)被作為研究各突觸間神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的一種重要手段[13-15]，它可以選擇一個點作為刺激位點并觀察和持續(xù)記錄周圍63個位點的電位變化，并可以通過藥理學(xué)手段來觀察其藥理學(xué)變化。

在哺乳動物胚胎發(fā)育階段，中央管中的神經(jīng)上皮細(xì)胞逐漸發(fā)育形成室管膜細(xì)胞，在脊髓發(fā)育神經(jīng)板時期，腹側(cè)的底板細(xì)胞發(fā)育形成脊髓灰質(zhì)前角，運動神經(jīng)元主要分布于此[16]。樹突是神經(jīng)元中接收、整合及傳遞信息的重要因素，樹突的發(fā)育情況直接影響神經(jīng)電活動情況以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成[17]。

本研究結(jié)果顯示，E17胎鼠胸段脊髓前角的MAP2陽性細(xì)胞較少。隨著發(fā)育的進(jìn)行，神經(jīng)元逐漸向中央遷移，前角中MAP2陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。神經(jīng)元逐漸由橢圓形變成多角形，神經(jīng)絲結(jié)構(gòu)逐漸清晰，樹突結(jié)構(gòu)明顯，脊髓灰質(zhì)逐漸呈現(xiàn) “蝴蝶”型。說明胚胎期脊髓灰質(zhì)中的祖細(xì)胞經(jīng)過分化和遷移，逐漸形成成熟的神經(jīng)元。

谷氨酸是CNS中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，CaMKⅡ磷酸化谷氨酸AMPA受體，增加其電導(dǎo)性[18]，并且在大腦中能夠誘導(dǎo)激活A(yù)MPA受體的轉(zhuǎn)運和學(xué)習(xí)功能[19]。在本實驗中，MAP2與CaMKⅡ陽性細(xì)胞E17即共定位表達(dá)，說明從E17開始，脊髓前角的成熟神經(jīng)元中已經(jīng)存在AMPA受體。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育可以分為兩個時期：①機(jī)體自身驅(qū)動的活動，由此建立一個網(wǎng)絡(luò)框架；②活動依賴性的可塑性，在已經(jīng)建立的突觸上加工和修飾[20]。在哺乳動物胚胎發(fā)育階段和出生后早期，自發(fā)突觸活動主要驅(qū)動其所需的循環(huán)機(jī)制；隨后根據(jù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化，誘發(fā)出一系列的突觸活動，并在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟中起重要作用[20]。

fEPSP是由刺激脊髓前角神經(jīng)元并在周圍神經(jīng)元內(nèi)記錄到的電活動，當(dāng)分別給予E17、E20、P7大鼠胸段脊髓前角相同刺激強(qiáng)度時，記錄電極所記錄到的fEPSP數(shù)量隨著發(fā)育的進(jìn)行而增多，并且形成不同類型的放電波形，包括正向波和負(fù)向波；隨著發(fā)育的進(jìn)行，fEPSP的振幅逐漸減小。以上結(jié)果說明大鼠脊髓在發(fā)育過程中由于神經(jīng)元逐漸發(fā)育完善，突觸間的聯(lián)系增多，并逐漸形成功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這與免疫熒光染色結(jié)果相一致。

有研究表明，AMPA受體過量表達(dá)會引起肌萎縮側(cè)索硬化癥、腦卒中和脊髓損傷[21-22]。而同樣有研究表明，CNQX作為AMPA受體拮抗劑能夠抑制AMPA受體介導(dǎo)的電活動，可以作為神經(jīng)保護(hù)劑治療神經(jīng)退行性疾病和外傷[23]。另外，在大腦[24]與小腦[25]中，CNQX通過抑制中間神經(jīng)元的興奮性反應(yīng)，使細(xì)胞間突觸傳遞減少，進(jìn)一步提高下一級神經(jīng)元的興奮性。本實驗顯示，CNQX可以抑制AMPA受體介導(dǎo)的負(fù)向fEPSP振幅，采用ACSF進(jìn)行灌流洗脫后fEPSP恢復(fù)。這說明在大鼠胸髓前角發(fā)育早期存在AMPA受體，并作為興奮性功能突觸受體傳遞神經(jīng)電活動，這也與發(fā)育期AMPA受體的變化規(guī)律相吻合。

綜上所述，AMPA受體可能作為脊髓發(fā)育早期主要的興奮性功能突觸發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用，在早期神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動中起重要的調(diào)控作用。谷氨酸能AMPA受體如何在參與脊髓發(fā)育早期突觸傳遞的過程中受到多種其他受體的影響，如何調(diào)控與其他受體間的相互作用，將可能成為研究AMPA受體突觸傳遞調(diào)節(jié)機(jī)制新的熱點。

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Physiological Characteristics of Synap tic Transm ission of Anterior Horn Early Developm ent in Thoracic Spinal Cord Mediated by AMPAReceptors in Rats

ZHANGWen-xiu1,DUANHong-mei2,XIEYa-bin1,LIMan-li2,YANG Zhao-yang1,LIXiao-guang1
1.Department of Neurobiology,CapitalMedical University,Beijing 100069,China;2.Departmentof Biomedical Engineering,Schoolof BiologicalScienceand Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China

Objective To explore the physiological characteristicsof synaptic transmission of anteriorhorn early development in thoracic spinal cordmediated byα-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid(AMPA)receptors in rats.Methods 36Wistar ratswere divided into embryonic 17 days group(E17,n=12),embryonic 20 days group(E20,n=12)and postnatal7 days group(P7,n=12).Immunofluorescentstaining of calmodulin-dependentprotein kinaseⅡ(CaMKⅡ)was used to test the distribution of AMPA receptors.Multi-electrode array technique(MED-64 system)wasused to test the changesof field excitatory post-synaptic potential(fEPSP)of synaptic transm issionmediated by AMPA receptor.Results Therewas small amount of CaMKⅡ-positive neurons existing in graymatter of spinal cord at E17,CaMKⅡ-positive neurons migrated to the center,and the number of neurons becamemore andmore in E20 and P7 rats.The number of evoked fEPSPgradually increased in rats from E17 to P7,and could be blocked by 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione(CNQX).The range of synaptic connection in spinal cord graymatter significantly reduced(P＜0.001).Conclusion AMPA receptors participate in the early developmentof spinal cord in ratsand actas themain excitatory receptorof functionalsynaptic connection in neuralnetwork of ventricornu.

α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor;spinal cord development;field excitatory postsynaptic potential;synaptic connection;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.005

R651.2

A

1006-9771(2015)12-1385-06

1.國家 “863”計劃項目(No.2012AA020206)；2.國家自然科學(xué)基金面上項目(No.31271037)；3.國家自然科學(xué)基金國際合作與交流項目(No.31320103903)；4.“十二五”國家科技支撐計劃項目(No.2012BAI17B04)；5.高等學(xué)校全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項資金資助項目(No.201356)；6.國家國際科技合作專項項目(No.2014DFA30640)；7.國家自然科學(xué)基金委員會資助項目(No.31130022)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京市100069；2.北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191。作者簡介：張雯秀(1989-)，女，新疆克拉瑪依市人，碩士研究生，主要研究方向：AMPA受體在發(fā)育及脊髓損傷大鼠胸段脊髓中的表達(dá)情況及分布規(guī)律。通訊作者：李曉光(1959-)，男，吉林長春市人，博士，教授，主要研究方向：應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。E-mail:lxgwelcome@263. net。

先前研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育過程中AMPA受體在胚胎期及新生大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中表達(dá)，并隨著年齡的增長而逐步發(fā)育完善[4-5]。早期研究主要集中于探討大腦中AMPA受體的作用機(jī)制及生理生化特征[6-7]，并發(fā)現(xiàn)AMPA受體功能的改變導(dǎo)致大腦學(xué)習(xí)和記憶功能的減弱和喪失[8]。目前對于脊髓中AMPA受體能否參與突觸傳遞，以及AMPA受體在參與形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過程中的作用機(jī)制尚未有明確的報道。

本實驗利用免疫熒光染色觀察脊髓前角中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKⅡ)陽性神經(jīng)元的形態(tài)、分布及變化規(guī)律，采用電生理MED64平面微電極陣列技術(shù)檢測發(fā)育期AMPA受體介導(dǎo)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動變化，結(jié)合藥理學(xué)檢測AMPA受體在不同發(fā)育階段的興奮性特征，以探討AMPA受體參與大鼠脊髓發(fā)育早期突觸傳遞的生理學(xué)特點。

2015-09-18

2015-10-10)