通竅活血湯對腦外傷大鼠認(rèn)知功能障礙的影響①

孫新亭，遲茜茜，孫曉靜

通竅活血湯對腦外傷大鼠認(rèn)知功能障礙的影響①

孫新亭1,2，遲茜茜1,2，孫曉靜2

目的觀察通竅活血湯對腦外傷大鼠認(rèn)知功能的影響并探索其作用機制。方法70只雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機分為正常組(n=10)、假手術(shù)組(n=20)、自然恢復(fù)組(n=20)和治療組(n=20)。采用控制性皮質(zhì)撞擊的方法制作大鼠腦外傷模型。治療組大鼠在造模后每只鼠平均每天飲通竅活血湯5m l，其他組每天飲用蒸餾水，持續(xù)4周。術(shù)后1、2、3、4周對大鼠進行Morris水迷宮測試，免疫組化檢測海馬區(qū)腦源性營養(yǎng)因子(BDNF)和突觸素(SynⅠ)的表達。結(jié)果自然恢復(fù)組各時間點逃避潛伏期較正常組增加(P＜0.05)，治療組1、2周較正常組增加(P＜0.05)，3、4周無顯著性差異(P＞0.05)；治療組3、4周小于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。自然恢復(fù)組各時間點游泳時間百分比較正常組降低(P＜0.05)；治療組1、2、3周較正常組降低(P＜0.05)，4周時無顯著性差異(P＞ 0.05)；治療組4周時游泳時間百分比高于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。自然恢復(fù)組1、2周時海馬區(qū)BDNF表達低于正常組(P＜0.05)，3、4周時無顯著性差異(P＞0.05)，治療組1、2、3周與正常組無顯著性差異(P＞0.05)，4周時明顯高于正常組(P＜0.01)；治療組在2、3、4周海馬區(qū)BDNF表達高于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。自然恢復(fù)組各時間點SynⅠ表達顯著低于正常組(P＜0.001)，治療組1、2、3周明顯低于正常組(P＜0.01)，4周時無顯著性差異(P＞0.05)；治療組3、4周明顯高于自然恢復(fù)組(P＜0.01)。結(jié)論通竅活血湯能夠改善腦外傷大鼠的認(rèn)知功能，其機制可能是通過影響海馬區(qū)的神經(jīng)重塑。

腦外傷；認(rèn)知障礙；通竅活血湯；大鼠

[本文著錄格式]孫新亭，遲茜茜，孫曉靜.通竅活血湯對腦外傷大鼠認(rèn)知功能障礙的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21 (12):1379-1384.

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級健康雄性Sprague-Daw ley大鼠70只，12周齡，體質(zhì)量(180±20)g，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物單籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。飼養(yǎng)溫度24～25℃，相對濕度7%左右，光照明暗比為13∶11。

1.2造模與分組

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組(n=10)、假手術(shù)組(n=20)、自然恢復(fù)組(n=20)和治療組(n=20)。后三組再分為1周、2周、3周、4周4個亞組，沒個亞組5只。

自然恢復(fù)組和治療組采用控制性皮質(zhì)撞擊(controlled cortical impact,CCI)造模，打擊速度3.5 m/s，打擊深度1.5mm，停留400ms。正常組不予任何干預(yù)，假手術(shù)組僅暴露硬腦膜。

治療組大鼠在造模后每只鼠平均每天飲5m l通竅活血湯制劑，其他組每天僅飲用蒸餾水，持續(xù)4周。

1.3通竅活血湯制備

方劑組成：赤芍3 g，川芎3 g，桃仁9 g，紅棗7 個(去核)，紅花9 g，老蔥3根，鮮姜9 g，麝香0.15 g。用黃酒250m l將前七味藥煎至150m l，去渣，將麝香入酒內(nèi)，再煎二沸，4℃冰箱內(nèi)保存。

1.4行為學(xué)評價

水迷宮是一個直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，分為4個象限，水池中水溫控制在20～22℃。將直徑為12 cm的圓形平臺固定在某一象限，平臺面低于水面1 cm。試驗前先將大鼠放入水中適應(yīng)環(huán)境。

定位航行試驗：分別以4個象限的某一固定點為起點，平臺為終點，將大鼠面向池壁放入水池中，記錄大鼠由起點游至終點的時間，即逃避潛伏期，試驗允許最大逃避潛伏期為60 s。各組大鼠于造模后1、2、3、4周進行試驗，每次均在固定時間進行，并保持實驗環(huán)境不變。

空間探索試驗：撤去平臺，將大鼠于水池中任意一點放入水中游泳，記錄120 s內(nèi)大鼠在原平臺所處象限的游泳時間，并計算原平臺象限游泳時間占總時間的百分比。

1.5免疫組化

1.5.1取材

以10%水合氯醛400 mg/kg麻醉大鼠，暴露心臟，以12號穿刺針刺入左心室，眼科剪刀剪開右心房，首先灌注溫生理鹽水約200m l，待從右心房流出液體時，換用含4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS(pH=7.4)緩沖液200m l進行灌注固定，斷頭取腦。取以視交叉為中心相當(dāng)于前聯(lián)合連續(xù)腦片繼續(xù)固定4～6 h，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片。

1.5.2實驗步驟

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。②30%H2O2與蒸餾水1∶10混合，室溫5～10m in以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗10m in，共3次。③滴加復(fù)合消化液10min，蒸餾水洗3次。④滴加正常山羊血清封閉液20m in，不洗，甩去多余液體。⑤滴加兔抗鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、突觸素(synaptophysin,Syn)Ⅰ(1∶2000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫下(25℃)孵育2 h，4℃過夜，PBS洗2m in，共3次。⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫下20m in。PBS洗2m in，共3次。⑦滴加試劑SABC復(fù)合物，室溫20m in，PBS洗5m in，共4次。⑧DAB顯色：取1m l蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間10m in左右。蒸餾水多次洗滌。⑨蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察。⑩免疫組織化學(xué)染色對照：用正常山羊血清和PBS代替BDNF、SynⅠ一抗作孵育，其余步驟同上，用以檢查各個指標(biāo)免疫反應(yīng)的特異性。

1.6圖像分析方法

全部測量均在相同光學(xué)條件下完成。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對免疫組化切片進行圖像分析，測定染色灰度。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)表現(xiàn)

2.1.1逃避潛伏期

與正常組比較，假手術(shù)組各時間點逃避潛伏期無顯著性差異(P＞0.05）；自然恢復(fù)組各時間點增加(P＜ 0.05)；治療組1、2周增加(P＜0.05)，3、4周時無顯著性差異(P＞0.05)。治療組3、4周逃避潛伏期小于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。見表1。

表1　各組大鼠逃避潛伏期(s)

2.1.2游泳時間百分比

與正常組比較，假手術(shù)組各時間點游泳時間百分比無顯著性差異(P＞0.05)；自然恢復(fù)組各時間點降低(P＜0.05)；治療組1、2、3周降低(P＜0.05)，4周時無顯著性差異(P＞0.05)；治療組4周時游泳時間百分比高于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。見表2。

表2　各組大鼠的游泳時間百分比(%)

2.2免疫組化

2.2.1BDNF

與正常組比較，假手術(shù)組各個時間點海馬區(qū)BDNF表達無顯著性差異(P＞0.05)；自然恢復(fù)組在1、2周海馬區(qū)BDNF表達降低(P＜0.05)，3、4周時無顯著性差異(P＞0.05)；治療組1、2、3周無顯著性差異(P＞ 0.05)，4周時明顯增加(P＜0.01)。治療組在2、3、4周海馬區(qū)BDNF表達高于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。見表3、圖1。

表3　各組海馬區(qū)BDNF表達情況(OD)

2.2.2SynⅠ表達

與正常組比較，假手術(shù)組各時間點SynⅠ表達無顯著性差異(P＞0.05)；自然恢復(fù)組各時間點SynⅠ表達顯著降低(P＜0.001)；治療組1、2、3周明顯低于正常組(P＜0.01)，4周時無顯著性差異(P＞0.05)。治療組

3、4周高于自然恢復(fù)組(P＜0.05)。見表4、圖2。

表4　各組海馬區(qū)SynⅠ表達情況(OD)

圖1　各組海馬區(qū)BDNF表達(免疫組化染色，400×)

圖2　各組海馬區(qū)SynⅠ表達(免疫組化染色，400×)

3　討論

認(rèn)知障礙在腦外傷患者中普遍存在，輕則影響患者的生活質(zhì)量，重則損害患者的生活自理能力。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，腦為 “神明之府”，負(fù)責(zé)人體精神和認(rèn)知方面的功能，頭部外傷會導(dǎo)致大腦氣血逆亂，甚至絡(luò)破血溢，導(dǎo)致腦絡(luò)瘀阻，影響大腦正常功能的發(fā)揮。通竅活血湯為清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，專門治療腦部瘀血的方劑，因此理論上可治療腦外傷。但是以往的臨床或者實驗研究都是集中在腦外傷后綜合征[13]、頭痛[14]和癲癇[15]等，很少有針對腦外傷后認(rèn)知障礙的研究。根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論以及現(xiàn)代相關(guān)研究結(jié)果分析[16-18]，腦外傷后認(rèn)知障礙可能同腦部瘀血有關(guān)。

在本實驗中，我們觀察到通竅活血湯能夠改善腦外傷大鼠認(rèn)知功能，其作用在服用2周后更為明顯，表現(xiàn)在腦外傷大鼠3、4周時逃避潛伏期的改善以及4周時游泳百分比的增加。

BDNF是一類分泌性蛋白，它對神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的影響與突觸活動密切相關(guān)[19]。向老年大鼠的伏核注射BDNF可改善突觸重塑并提高大鼠的認(rèn)知功能[20]。海馬區(qū)BDNF的數(shù)量對突觸重塑的調(diào)節(jié)和認(rèn)知功能有顯著影響[21]。其對神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)作用主要是通過酪氨酸激酶B(TrkB)信號通路實現(xiàn)[22-23]。

SynⅠ是突觸囊泡蛋白的一種，存在于神經(jīng)突觸內(nèi)，SynⅠ能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，且在突觸可塑性(尤其是短時程突觸可塑性)的發(fā)生過程中具有不容忽視的作用[24]。另外SynⅠ的數(shù)量直接反映突觸的數(shù)量，很多實驗中通過SynⅠ的定量研究來間接反映突觸的數(shù)量以及功能[25-26]。

實驗中自然恢復(fù)組大鼠在頭部遭受打擊后其海馬區(qū)BDNF的表達水平顯著下降，直至3周時才得以恢復(fù)；SynⅠ表達水平傷后下降更為顯著，直至4周時仍未恢復(fù)到正常水平。這也與4周時自然恢復(fù)組腦外傷大鼠行為學(xué)測試表現(xiàn)顯著低于正常組的實驗結(jié)果相符。通竅活血湯治療后，大鼠海馬區(qū)BDNF的表達水平逐漸上升，在4周時BDNF的水平突然出現(xiàn)提升，高于正常組大鼠；海馬區(qū)SynⅠ表達水平也在下降后逐漸上升，在4周時接近正常水平。這種變化趨勢同行為學(xué)測試表現(xiàn)變化一致。

總之，本研究初步證實通竅活血湯能夠改善腦外傷大鼠的認(rèn)知功能，可能的作用機制之一為改善海馬區(qū)神經(jīng)可塑性，促進突觸分化，并增強突觸功能。

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Effectof Tongqiaohuoxue Decoction on Cognitive Impairment in Ratswith Traumatic Brain Injury

SUNXin-ting1,2,CHIQian-qian1,2,SUNXiao-jing2
1.Beijing Bo'aiHospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;2.CapitalMedical University Schoolof Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China

Objective To observe the effect of Tongqiaohuoxue decoction on cognitive impairment in ratswith traumatic brain injury and explore themechanisms.Methods 70 Sprague-Daw ley ratswere randomized into normal group(n=10),sham operated group(n=20), untreated group(n=20)and treatmentgroup(n=20).Controlled cortical impactdevicewasutilized to establish traumatic brain injurymodel. The treatment group

Tongqiaohuoxue decoction 5m l/d,and other groups

distilled water.The cognitive function of rats wasevaluatedwith Morriswatermaze1,2,3,4weekspostoperation.And the ratswere sampled to test the expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and synaptophysin(Syn)Iin hippocampus through immunohistochemistry.Results The escape latency was longer in the untreated group than in the normal group in all the time points(P＜0.05),and was longer in the treatment group than in the normal group 1 and 2weeksafter injury(P＜0.05),with no significantdifference3 and 4weeksafter injury(P＞0.05).And itwasshorter in the treatment group than in the untreated group 3 and 4 weeks after injury(P＜0.05).The percentage of swimming timewas lower in the untreated group than in the normal group in all the time points(P＜0.05),and was lower in the treatmentgroup than in the normal group 1,2,and 3 weeks after injury(P＜0.05),with no significant difference 4 weeks after injury(P＞0.05).And itwas higher in the treatmentgroup than in the untreated group weeks after injury(P＜0.05).The BDNF expression was lower in the untreated group than in the normal group 1 and 2 weeksafter injury(P＜0.05),with no significantdifference 3 and 4weeks after injury(P＞0.05).Itwas higher in the treatmentgroup than in the normalgroup 4weeksafter injury(P＜0.01),and washigher in the treatmentgroup than in the untreated group 2,3 and 4weeksafter injury(P＜0.05).The Syn Iexpressionwas lower in theuntreated group than in thenormalgroup in all the time points(P＜0.001),andwas lower in the treatmentgroup than in the normalgroup 1,2 and 3 weeksafter treatment(P＜0.01).And itwashigher in the treatmentgroup than in the untreated group 3 and 4weeks after injury(P＜0.01).Conclusion Tongqiaohuoxue decoction could improve the cognitive function in ratswith traumatic brain injury.The change in expression of BDNFand Syn Imightbeassociated with the improvements.

traumatic brain injury;cognitive impairment;Tongqiaohuoxue decoction;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.004

R651.1

A

1006-9771(2015)12-1379-06

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(No.2013CZ-35)。

1.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市100068；2.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068。作者簡介：孫新亭(1975-)，男，漢族，吉林吉林市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)。

CITED AS:Sun XT,ChiQQ,Sun XJ.Effectof tongqiaohuoxue decoction on cognitive impairment in ratswith traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1379-1384.

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)發(fā)生率、致殘率高，給患者及家庭造成極大的痛苦和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，也給社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。在發(fā)達國家，每年每10萬人中有262人因腦外傷住院[1]，我國尚缺乏大規(guī)模的腦外傷流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，但其發(fā)病率和致殘率可能不亞于發(fā)達國家。認(rèn)知障礙是腦外傷常見的后遺癥，其發(fā)生不僅僅局限于重度腦外傷患者，也見于輕到中度的腦外傷患者[2-3]。這些障礙往往長期存在，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)治療和生活[4-5]，并妨礙回歸社會[6-7]。

目前腦外傷后認(rèn)知障礙的恢復(fù)除了進行系統(tǒng)的康復(fù)訓(xùn)練[8]外還配合使用改善認(rèn)知功能的藥物，主要針對記憶[9]、交流[10]以及執(zhí)行功能[11]。腦外傷所致認(rèn)知障礙所用藥物與阿爾茨海默病、血管性癡呆以及其神經(jīng)系統(tǒng)疾病所致的認(rèn)知功能障礙所用藥物無明顯區(qū)別，但是由于腦外傷的特殊病理變化不同于上述疾病[12]，認(rèn)知障礙的治療藥物應(yīng)該更具有針對性。

中醫(yī)對認(rèn)知障礙的病理認(rèn)識很早，《黃帝內(nèi)經(jīng)》曾記載 “血在上善忘，血在下如狂”?！夺t(yī)林改錯》也提出 “凡有瘀血也令人善忘”。腦外傷會導(dǎo)致顱內(nèi)出血和瘀血，患者多數(shù)存在認(rèn)知功能障礙，這種病理變化和中醫(yī)提出的瘀血導(dǎo)致記憶力下降的理論相符，因此利用具有活血化瘀作用的中藥有可能改善腦外傷后認(rèn)知功能障礙。基于以上設(shè)想，我們選用經(jīng)典的活血化瘀方劑通竅活血湯，利用動物實驗對其療效進行驗證，并從神經(jīng)重塑角度初步探討其可能的作用機制。

2015-06-30

2015-09-01)