養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響①

董靜，李晶，劉斌，毛文靜，張晉霞，李世英

養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響①

董靜1a，李晶1b，劉斌1b，毛文靜1b，張晉霞1b，李世英1b

目的觀察養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響。方法144只Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=48)、血管性癡呆模型組(模型組，n=48)和養(yǎng)血清腦顆粒治療組(治療組，n=48)。采用改良Pulsinelli四血管阻斷法制作血管性癡呆大鼠模型。假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水10m l/(kg·d)；治療組灌胃養(yǎng)血清腦顆粒3.2 g/(kg·d)。分別在術(shù)后1周、2周、4周和8周采用免疫組化法和Western blotting法檢測海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)水平。結(jié)果與對照組比較，模型組各時間點大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)明顯增高(P＜0.01)；與模型組比較，治療組各時間點GFAP表達(dá)明顯下降(P＜ 0.01)。結(jié)論養(yǎng)血清腦顆?？梢种蒲苄园V呆大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化。

血管性癡呆；星形膠質(zhì)細(xì)胞；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；養(yǎng)血清腦顆粒；大鼠

[本文著錄格式] 董靜，李晶，劉斌，等.養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(12):1375-1378.

CITED AS:Dong J,Li J,Liu B,etal.Effectof Yangxue Qingnao granule on expression of glial fibrillary acidic protein in CA1 area of hippocampus in ratswith vasculardementia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1375-1378.

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是發(fā)生在腦血管疾病基礎(chǔ)上的以記憶、認(rèn)知功能缺損為主，或伴有語言、視覺空間技能及情感或人格障礙的獲得性智力持續(xù)性損害[1]。血管性癡呆的發(fā)病機制尚未完全明確，但研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes)在血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義[2-3]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)記物[4]，其表達(dá)可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生與活化情況。

養(yǎng)血清腦顆粒是根據(jù)中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論，以中醫(yī)傳統(tǒng)名方四物湯為基礎(chǔ)改良而成的中藥復(fù)方制劑，具有滋陰養(yǎng)血、平肝潛陽、活血通絡(luò)的功效，臨床上應(yīng)用養(yǎng)血清腦顆粒能明顯改善血管性癡呆患者認(rèn)知功能和日常生活能力[5]，但其具體作用機制尚不明確。因此，本研究通過觀察養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)的影響，探討?zhàn)B血清腦顆粒治療血管性癡呆的可能機理。

1　材料與方法

1.1動物

健康雄性Sprague-Daw ley大鼠144只，體質(zhì)量250～280 g，3月齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司供給，合格證號SCXK(京)2013-0013。在華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫控制在(23±2)℃，相對濕度45%～55%，早上7點到晚上7點開燈，12 h明暗交替光照，實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

1.2試劑和儀器

養(yǎng)血清腦顆粒，國藥準(zhǔn)字Z10960082，批號130366，規(guī)格4 g/袋：天津天士力制藥股份有限公司。兔抗大鼠GFAP抗體，貨號bs-4989R，批號150419：北京博奧森生物公司。DAB顯色液，貨號ZLI-9018，批號K143313B：北京中杉生物有限公司。

L-420型低速離心機：美國SIGMA公司。FGD-8AB型電凝儀：張家港航天醫(yī)療電器有限公司。KD-2800型切片機：上海億欣生物科技有限公司。H-7650型透射電子顯微鏡：日本HITACHI公司。

1.3方法

1.3.1動物分組

將大鼠編號，用隨機數(shù)生成器隨機抽取不同數(shù)字，將大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=48)、血管性癡呆模型組(模型組，n=48)和養(yǎng)血清腦顆粒治療組(治療組，n=48)，在模型制備成功后又隨機分為造模術(shù)后1周、2周、4周和8周4個亞組，每個亞組12只。

1.3.2模型制備

采用改良Pulsinelli四血管阻斷法制作血管性癡呆大鼠模型[6]。術(shù)前12 h禁食，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，背側(cè)行頸正中切口以暴露雙側(cè)第一頸椎橫突小孔，接著將直徑0.5mm的電凝針插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動脈，造成雙側(cè)永久性閉塞。然后將大鼠仰臥位固定，行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，以4號絲線穿線。于24 h后用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5m in，共夾閉3次，每次間隔1 h。術(shù)后手術(shù)部位噴灑慶大霉素抗感染，然后縫合切口，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)觀察。

假手術(shù)組大鼠操作步驟同上，但不燒灼和夾閉血管。

術(shù)后各組大鼠均給予慶大霉素1×104U/kg腹腔注射，連續(xù)3 d。

1.3.3給藥

三組均灌胃給藥，每天1次。假手術(shù)組：大鼠雙側(cè)頸總動脈分離后，不做缺血處理，給予生理鹽水10m l/(kg·d)灌胃。模型組：模型制備成功后，給予生理鹽水10m l/(kg·d)灌胃。治療組：模型制備成功后，參照陶濤等[7]的方法，將養(yǎng)血清腦顆粒用蒸餾水配置成混懸液，濃度為0.32 g/m l，灌胃養(yǎng)血清腦顆粒10m l/(kg·d)。

1.3.4免疫組化檢測

大鼠喂養(yǎng)至各個時相點后，每個亞組取6只，用10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注鹽水100m l，持續(xù)灌注4%多聚甲醛-PBS 100m l，斷頭取腦，4%多聚甲醛-PBS固定過夜，冠狀面切斷包含海馬的腦組織(視交叉后)，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟至水，加入正常羊血清封閉液中，先后滴加一抗4℃過夜、滴加二抗和適量辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，進(jìn)行DAB顯色。免疫組化方法具體操作步驟按試劑說明書操作要求進(jìn)行。

GFAP免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞胞漿和胞核均呈棕黃色。組織切片采用OLYMPUS攝像顯微鏡(400×)攝像，選擇各組大鼠海馬CA1區(qū)不重疊的6個視野，應(yīng)用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別進(jìn)行GFAP陽性細(xì)胞計數(shù)。

1.3.5Western blotting檢測

大鼠喂養(yǎng)至各個時相點后，每個亞組取6只，以脊髓脫臼法處死大鼠后立即斷頭于冰上取腦，將取出的海馬組織置于15m l離心管中，加入組織裂解液，作用30m in后用組織勻漿機12000 r/m in勻漿，并將細(xì)胞懸液放入4℃低溫離心機中12000 r/m in離心10 m in，留取上清液-80℃保存。將蛋白定量后分裝，用PBS調(diào)蛋白濃度到一致(800μg/m l)，加入等體積的上樣緩沖液，沸水中煮至少5m in。冷卻至室溫，放入4℃冰箱備用。各組取組織20μg，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入封閉液中封閉，然后分別加入稀釋好的兔抗大鼠GFAP一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入相應(yīng)稀釋好的二抗(羊抗兔，1∶2000)，37℃反應(yīng)1 h，洗膜，以ECL顯色，膠片曝光顯影，使用Image J軟件進(jìn)行平均灰度值測定。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1免疫組化

假手術(shù)組各時間點大鼠海馬CA1區(qū)可見少量GFAP表達(dá)；模型組各時間點GFAP表達(dá)明顯增多，1周時即有多量表達(dá)，2周時大量表達(dá)，4周時達(dá)高峰，8周時開始下降但仍較高。與假手術(shù)組相比，模型組各時間點GFAP表達(dá)明顯增多(P＜0.01)。與模型組比較，治療組各時間點GFAP表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。見表1和圖1。

表1　各組不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)(個/高倍視野)

圖1　各組不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)(免疫組化染色，400×)

2.2Western blotting檢測

假手術(shù)組各時間點大鼠海馬CA1區(qū)可見少量GFAP表達(dá)，模型組各時間點GFAP表達(dá)明顯增多，1周時即有多量表達(dá)，2周時大量表達(dá)，4周時達(dá)高峰，8周時開始下降但仍較高。與假手術(shù)組相比，模型組各時間點GFAP表達(dá)明顯增多(P＜0.01)。與模型組比較，治療組各時間點GFAP表達(dá)明顯(P＜0.01)。見表2和圖2。

表2　各組不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)GFAPWestern blotting結(jié)果

圖2　各組不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)GFAPWestern blotting結(jié)果

3　討論

血管性癡呆的發(fā)病機制至今尚未完全明確，研究提示炎性反應(yīng)及免疫活性因子參與血管性癡呆的發(fā)病過程[8]。膠質(zhì)細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。在生理情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞具有支持、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的作用，但在腦缺血的病理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后產(chǎn)生大量的一氧化氮、白細(xì)胞介素-6等細(xì)胞毒性因子，而引起神經(jīng)元的損傷[9]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)記物，其大量表達(dá)是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的一個重要特征[10]。

有研究表明，在血管性癡呆模型大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體肥大腫脹，突起增粗延長，分支減少等現(xiàn)象，其標(biāo)志性蛋白GFAP表達(dá)明顯增強，并伴有學(xué)習(xí)記憶能力的減退[11]。本研究的結(jié)果表明，血管性癡呆模型組各時間點大鼠海馬CA1區(qū)GFAP蛋白表達(dá)明顯增多，1周時即有多量表達(dá)，2周時大量表達(dá)，4周時達(dá)高峰，8周時開始下降但仍較高。說明血管性癡呆模型大鼠海馬CA1區(qū)有明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈激活狀態(tài)。

近年來，中藥在血管性癡呆治療中的作用越來越得到重視[12-15]。養(yǎng)血清腦顆粒主要有由川芎、當(dāng)歸、白芍、鉤藤、熟地黃、雞血藤、決明子、夏枯草、細(xì)辛、延胡索、珍珠母組成，在改善腦皮層微循環(huán)、增加腦血管量、減輕腦損傷等方面具有顯著效果[16-17]。養(yǎng)血清腦顆粒具有養(yǎng)血活血、平肝潛陽的作用，標(biāo)本兼治，符合中醫(yī)治療血管性癡呆的要求。

作為現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，養(yǎng)血清腦顆粒具有多靶點、多環(huán)節(jié)、整體性調(diào)節(jié)機體的特點。文獻(xiàn)報道，養(yǎng)血清腦顆粒具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元缺血性損害[18]。我們的系列研究已證實養(yǎng)血清腦顆粒能改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這已在先前的研究中報道[19-20]。本研究的結(jié)果顯示，治療組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP表達(dá)明顯降低，說明養(yǎng)血清腦顆?？梢种蒲苄园V呆大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化，對血管性癡呆有治療作用，且隨著用藥時間的延長，其作用更明顯。由上述研究結(jié)果推測，血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞呈明顯增生和活化狀態(tài)，養(yǎng)血清腦顆粒能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化，發(fā)揮對血管性癡呆的治療作用。

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Effect of Yangxue Qingnao Granule on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein in CA1 Area of Hippocampus in Ratswith Vascular Dementia

DONG Jing1a,LIJin g1b,LIU Bin1b,MAOWen-jing1b,ZHANG Jin-xia1b,LIShi-ying1b
1.a.Physiatry Department;b.FirstDepartmentof Neurology,HospitalAffiliated to North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei063000,China

Objective To investigate the effectof Yangxue Qingnao granule on the expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP)in CA1 area of hippocampus in ratswith vascular dementia(VD).Methods 144 Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham operation group(n=48),VD group(model group,n=48)and Yangxue Qingnao granule treatmentgroup(treatmentgroup,n=48).The VD model was prepared bymodified Pulsineli's four-vesselocclusion.The sham operation group and themodelgroup were given normal saline 10m l/ (kg·d)by gavage,and the treatmentgroup wasgiven Yangxue Qingnao granule 3.2 g/(kg·d)by gavage.The expression of GFAP in CA1 area of hippocampuswas detected with immunohistochem ical analysis and Western blottingmethod 1,2,4 and 8 weeks aftermodeling.Results The expression ofGFAP in CA1 area of hippocampuswas significantly higher in themodelgroup than in the sham operation group(P＜ 0.01),and was lower in the treatment group than in themodel group(P＜0.05)at every time point.Conclusion Yanxue Qingnao granule could inhibit the activation and proliferation of astrocytes in rats.

vascular dementia;astrocytes;glial fibrillary acidic protein;Yangxue Qingnao granule;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.003

R749.1

A

1006-9771(2015)12-1375-04

1.河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目(No.ZH2012046)；2.河北省級重大醫(yī)學(xué)科研課題(No.zd2013087)。

1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，a.康復(fù)科；b.神經(jīng)內(nèi)一科，河北唐山市063000。作者簡介：董靜(1980-)，女，漢族，河北唐山市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦血管病康復(fù)。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：腦血管病及認(rèn)知障礙。E-mail:liubintsh@126.com。

2015-09-14

2015-10-28)