轉(zhuǎn)移抑制因子1與血管內(nèi)皮生長因子在結(jié)直腸癌中的表達及意義

楊 潔，韓 瑋，王永強，曹 方，丁厚中

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院1.肛腸外科，2.綜合外科，江蘇昆山215300）

轉(zhuǎn)移抑制因子1與血管內(nèi)皮生長因子在結(jié)直腸癌中的表達及意義

楊 潔1，韓 瑋2，王永強1，曹 方2，丁厚中2

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院1.肛腸外科，2.綜合外科，江蘇昆山215300）

目的：檢測轉(zhuǎn)移抑制因子1（metastasis suppressor 1，MTSS1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）在結(jié)直腸癌中的表達變化及臨床意義。方法：在含有240例結(jié)直腸癌標本的組織芯片上，利用免疫組織化學(xué)法及qRT-PCR法檢測MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌、癌旁組織中的表達，并分析與結(jié)直腸癌臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織中MTSS1陰性表達率和VEGF陽性表達率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。MTSS1陰性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke′s分期相關(guān)（P＜0.05）；VEGF陽性表達與患者年齡（≥60歲）、腫瘤分化程度（低分化）相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸癌中MTSS1低表達和VEGF高表達可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

結(jié)直腸癌；轉(zhuǎn)移抑制因子1；血管內(nèi)皮生長因子

轉(zhuǎn)移抑制因子1（metastasis suppressor 1，MTSS1），是由Lee等［1］應(yīng)用mRNA差異展示技術(shù)研究膀胱癌轉(zhuǎn)移機制時發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在正常膀胱組織中呈陽性表達而在轉(zhuǎn)移性癌組織中表達缺失。對乳腺癌、前列腺癌、腎癌等組織模型的研究進一步證實，MTSS1也是一種多功能的骨架蛋白［2-7］，但MTSS1抑制惡性腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的機制尚不完全清楚。血管內(nèi)皮生長因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）在成人和動物的正常組織中合成很少，但在腫瘤、胎盤、黃體等存在新生血管的組織中呈高表達。在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中，腫瘤細胞分泌大量VEGF，刺激腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細胞促進其增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的必需條件，在此過程中細胞骨架蛋白和血管因子起著重要作用。本研究探索MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌中的表達變化及其臨床病理的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集自2004年1月至2010年12月于江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院及吳江市人民醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)術(shù)后癌組織標本共240例，所有病理診斷結(jié)果經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確認，以距原發(fā)灶邊緣＞2 cm的癌旁黏膜組織作為對照。病理分型均為腺癌。Dukes分期：A期13例、B期132例、C期72例、D期23例。所有患者均無結(jié)直腸癌家族遺傳史，術(shù)前均未接受過放療和化療?；颊吲R床資料完整，包括年齡、性別、分化程度、浸潤深度、Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。另選取江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院于2014年12月至2015年5月間4例結(jié)腸癌病例，患者均行結(jié)腸癌根治術(shù)，術(shù)前未行放療和化療，取術(shù)中切除的結(jié)腸癌及癌旁配對組織標本共4對，均為知情同意。

1.2 試劑

MTSS1（英國Ca1tag-Medsystems），VEGF（美國Lab Vision），S-P免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新公司，基因組RNA抽提試劑盒（BioTeKe公司），Ex TaqTMPCR及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.3 免疫組化檢測及結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)技術(shù)采用S-P法，切片脫蠟至水，PBS洗；高溫高壓修復(fù)抗原；按照S-P免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固；MTSS1鼠抗人單克隆抗體稀釋度為1∶50，VEGF鼠抗人多克隆抗體稀釋度為1∶200，PBS替代一抗作陰性對照。

MTSS1及VEGF陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞質(zhì)或胞膜。陽性細胞計數(shù)：根據(jù)陽性細胞所占5個以上高倍鏡視野比例計數(shù)分為4類：＜5％為1分，5％～25％為2分，26％～50％為3分，＞50％為4分。染色強度分類：淡黃色為1分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。兩者計分乘積大于2為陽性。

1.4 qRT-PCR檢測4對配對組織中MTSS1 mRNA的表達

MTSS1基因引物序列參見文獻［1］；內(nèi)參照β-肌動蛋白引物序列：上游，5′-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，下游，5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′，引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，再行94℃30 s、60℃30 s、72℃90 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠用Quantity-One圖像處理軟件行灰度分析。以上實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件作統(tǒng)計處理。MTSS1和VEGF與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達

成功構(gòu)建含有240例結(jié)直腸癌的組織芯片。免疫組化結(jié)果顯示（圖1），MTSS1的表達主要定位于細胞質(zhì)，在癌旁組織中呈淡黃色至棕黃、棕褐色，彌漫分布，癌組織中染色較弱，呈弱陽性或不著色，MTSS1在癌旁組織中的表達率為194/240（80.8％）。VEGF主要定位于細胞質(zhì)或胞膜，癌旁組織中染色較弱，呈弱陽性或陰性，癌組織中彌漫分布，染色較強，呈強陽性，在癌組織中的表達率為184/240（76.7％）。

圖1 MTSS1和VEGF在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達（SP×400）

2.2 MTSS1和VEGF與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

MISS1的陰性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽性）、Dukes分期（C～D期）相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、浸潤深度及分化程度無關(guān)（P＞0.05）；VEGF的陽性表達與患者年齡（≥60歲）、腫瘤分化程度（低分化）相關(guān)（P＜0.05），而與性別、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 腸癌臨床病理參數(shù)與MTSS1及VEGF陽性表達之間的關(guān)系

2.3 MTSS1 mRNA的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，MTSS1 mRNA在癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低（t=-7.264，P＜0.05）。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌和癌旁組織中MTSS1 mRNA的表達

3 討論

MTSS1包含多個結(jié)構(gòu)域，包括N端的胰島素受體酪氨酸激酶底物p53同源結(jié)構(gòu)域（IMD）、C端的WASP同源結(jié)構(gòu)域2（WH2）及富含谷氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基的中央?yún)^(qū)域［2］。IMD與WH2相似，可與肌動蛋白結(jié)合，參與肌動蛋白細胞骨架信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使細胞膜變形形成絲狀或偽足樣突起及膜多極化［3］。而MTSS1的中央?yún)^(qū)域則主要起腳手架蛋白的作用，與細胞信號通路中的多種受體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及細胞內(nèi)調(diào)控因子等結(jié)合，參與肌動蛋白等相關(guān)蛋白介導(dǎo)的細胞核形成及微絲分支穩(wěn)定性［4］。MTSS1主要定位于細胞間連接，與肌動蛋白關(guān)系密切，在細胞骨架的形成、強化及維持中起重要作用［5］。在腫瘤發(fā)生中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞骨架成分分布不均及E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細胞間黏附力減弱可促進腫瘤細胞的定向轉(zhuǎn)移［6］。MTSS1可通過加強細胞間連接的強度，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［7］。MTSS1缺失可致細胞連接間的肌動蛋白細胞骨架斷裂，細胞解聚能力增加，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移［8］。但MTSS1作為腫瘤抑制基因目前仍存在爭議，研究表明MTSS1在不同惡性腫瘤中呈不同的表達，如肝癌、結(jié)腸癌中呈高表達［9-10］，胰腺癌、肝門部膽管癌等呈低表達［11-13］。

本研究結(jié)果表明，MTSS1在結(jié)直腸癌組織中主要呈陰性表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽性）、Dukes分期（C～D期）等終末期事件相關(guān)，提示MTSS1低表達可能與結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。Wang等［10］應(yīng)用免疫組化檢測135例結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)，MTSS1在結(jié)直腸癌中高表達且與組織浸潤、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，與本研究結(jié)果相反，我們認為可能是由于同種抗體不同的克隆反應(yīng)引起的。VEGF在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達率高，為184/240（76.7％），且與患者年齡（≥60歲）、腫瘤分化程度（低分化）相關(guān)，提示新生血管形成的微環(huán)境與腫瘤細胞低分化及個體差異的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。VEGF表達與性別、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期無相關(guān)性。新近關(guān)于VEGF與結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)［14］，VEGF的高表達與腫瘤分化程度、TNM分期及遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與本研究結(jié)果不盡相同，可能是由于樣本量及個體差異引起的。

綜上，MTSS1和VEGF可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，已證實VEGF為腫瘤的獨立預(yù)后因素，而關(guān)于MTSS1在腫瘤中如何發(fā)揮作用目前仍未完全闡明，其與VEGF的相關(guān)性仍有待多種骨架蛋白與多種VEGF共同驗證。

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Expression and significance of metastasis suppressor 1 and vascular endothelial growth factor in colon cancer

YANG Jie1，HAN Wei2，WANG Yong-qiang1，CA0 Fang2，DING Hou-zhong2
（1.Department of Anorecta1 Surgery，2.Department of Genera1 Surgery，Kunshan Hospita1 Affi1iated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300，China）

Objective：To investigate expression of metastasis suppressor 1（MTSS1）and vascu1ar endothe1ia1 growth factor（VEGF）and their prognostic significance in co1on cancer.Methods：We constructed tissue microarray b1ocks containing co1on cancer specimens from 240 patients.Expression of MTSS1 and VEGF in the specimens were ana1yzed using immunohistochemistry（IHC）technique and qRT-PCR.And their corre1ation with c1inica1 parameters were ana1ysed.Results：The negative expression rate of MTSS1 and the positive expression rate of VEGF was much higher in co1on cancer than in adjacent tissue（P＜0.05）.Negative MTSS1 expression was significant1y associated with presence of 1ymph node metastasis and advanced Duke′s stages（P＜0.05）.The over-expression of VEGF had a significant re1ationship with age（≥60 years）and poor1y differentiation（P＜0.05）.Conclusion：Decreased expression of MTSS1 and overexpression of VEGF may be re1ated to the the deve1opment and metastasis of co1on cancer.

co1on cancer；metastasis suppressor 1；vascu1ar endothe1ia1 growth factor

R735.3

A

1671-7783（2015）06-0520-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150207

2015-09-17 ［編輯］ 劉星星

楊潔（1982—），女，江蘇昆山人，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤方向的研究；丁厚中（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mai1：dinghouzhong@163.com