轉(zhuǎn)錄因子KLF6對大鼠趨化因子CCL5基因啟動(dòng)子活性的影響及其可能的結(jié)合部位

劉 玉，虞天一，張 婧，何風(fēng)霞，盧燕來，周夢雅，王璐璐，趙 聃，邱 文，王迎偉

（南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，江蘇南京210029）

轉(zhuǎn)錄因子KLF6對大鼠趨化因子CCL5基因啟動(dòng)子活性的影響及其可能的結(jié)合部位

劉 玉，虞天一，張 婧，何風(fēng)霞，盧燕來，周夢雅，王璐璐，趙 聃，邱 文，王迎偉

（南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，江蘇南京210029）

目的：構(gòu)建大鼠趨化因子CCL5基因啟動(dòng)子（全長和截短）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，檢測大鼠腎小球系膜細(xì)胞（g1omeru1ar mesangia1 ce11，GMC）中過表達(dá)Kruppe1樣轉(zhuǎn)錄因子6（Kruppe1-1ike factor 6，KLF6）對CCL5基因啟動(dòng)子活性的影響。同時(shí)，篩選KLF6與CCL5基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。方法：采用PCR技術(shù)，將擴(kuò)增出的大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長序列（-1744nt～-14nt）插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，獲得CCL5基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-CCL5-FL）。然后，將pGL3-CCL5-FL與大鼠野生型KLF6表達(dá)質(zhì)粒（pIRES2/KLF6）共轉(zhuǎn)染GMC，測定其熒光素酶活性。另用生物信息學(xué)軟件預(yù)測CCL5基因啟動(dòng)子上KLF6潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并據(jù)此構(gòu)建出4個(gè)CCL5基因啟動(dòng)子截短的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（即pGL3-CCL5-1～4）。將上述CCL5基因啟動(dòng)子全長和各截短的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別與KLF6過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GMC，再行熒光素酶活性的測定，初篩KLF6可能的結(jié)合部位。結(jié)果：菌液PCR以及核酸測序結(jié)果證實(shí)，上述所有啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒均構(gòu)建成功。pGL3-CCL5-FL和pIRES2/KLF6共轉(zhuǎn)染GMC結(jié)果顯示，CCL5基因啟動(dòng)子的活性顯著增強(qiáng)。pGL3-CCL5-FL、pGL3-CCL5-1～4分別與pIRES2/KLF6共轉(zhuǎn)染GMC后發(fā)現(xiàn)，pGL3-CCL5-4的啟動(dòng)活性顯著降低。提示KLF6可能結(jié)合在CCL5基因啟動(dòng)子的-343nt～-191nt區(qū)域。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長及截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并初步篩查出KLF6在CCL5基因啟動(dòng)子上可能的結(jié)合部位在-343nt～-191nt區(qū)域。

Kruppe1樣轉(zhuǎn)錄因子6；CCL5；腎小球系膜細(xì)胞；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒；啟動(dòng)子活性

大鼠Thy-1腎炎（Thy-1 nephritis）是人類系膜增生性腎小球腎炎（mesangina1 pro1iferative g1omeru1onephritis，MsPGN）的動(dòng)物模型［1］，其病理變化與人類MsPGN的病變十分相似。大鼠Thy-1腎炎病變的腎組織中多種炎癥和趨化因子（如TNF-α、CCL2）產(chǎn)生增多［2-4］，并且腎小球內(nèi)也有巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的浸潤［5-6］，提示Thy-1腎炎腎組織的炎癥因子與組織的炎癥反應(yīng)和損傷密切相關(guān)。

以往的研究表明，亞溶解型C5b-9復(fù)合物與Thy-1腎炎病變過程有一定的聯(lián)系［7］。已知亞溶解型C5b-9能刺激靶細(xì)胞，觸發(fā)一系列生化反應(yīng)，在胞內(nèi)激活多條信號通路，產(chǎn)生不同的應(yīng)激效應(yīng)，如分泌細(xì)胞炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子、刺激增生以及誘導(dǎo)或抑制凋亡等［8-9］。有研究報(bào)道亞溶解型C5b-9刺激腎小球系膜細(xì)胞（g1omeru1ar mesangia1 ce11，GMC）之后，可激活某些信號通路，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子的大量釋放。GMC受亞溶解型C5b-9刺激后，產(chǎn)生的炎癥或趨化因子和介質(zhì)除涉及某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，也可通過某些核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而啟動(dòng)炎性相關(guān)基因的表達(dá)。在多種上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中，Kruppe1樣轉(zhuǎn)錄因子6（Kruppe1-1ike factor 6，KLF6）在Thy-1腎炎大鼠腎組織內(nèi)和體外用亞溶解型C5b-9刺激的GMC中均見上調(diào)，并且KLF6可以調(diào)控某些炎癥反應(yīng)［10-11］。故本實(shí)驗(yàn)擬以KLF6為切入點(diǎn)，探討其與Thy-1腎炎大鼠腎組織趨化因子上調(diào)間可能的關(guān)系。

我們的前期研究已證實(shí)，Thy-1腎炎大鼠早期腎組織中KLF6、趨化因子CCL5的表達(dá)均顯著增加，且CCL5動(dòng)態(tài)變化的趨勢與KLF6的變化趨勢基本一致，但是，兩者之間的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)首先觀察KLF6過表達(dá)對大鼠GMC分泌CCL5的影響，然后在大鼠的GMC中共轉(zhuǎn)染大鼠CCL5基因啟動(dòng)子（全長和截短）的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與KLF6過表達(dá)質(zhì)粒，研究KLF6能否影響CCL5基因啟動(dòng)子的活性，并篩選CCL5基因啟動(dòng)子上KLF6可能結(jié)合的區(qū)域。這將為我們后期深入研究Thy-1腎炎大鼠腎組織炎性病變中CCL5基因的功能與作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠GMC HBZY-1細(xì)胞株購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-basic與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-SV40為美國Promega公司產(chǎn)品。組織基因組DNA提取試劑盒和PrimeSTAR?GXL DNA聚合酶均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶MiuⅠ，XhoⅠ和T4DNA連接酶（美國NEB公司）。ELISA試劑盒為上海朝瑞生物有限公司產(chǎn)品。Neon細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀（MPK5000，美國Invitrogen公司）。本課題組前期已構(gòu)建KLF6過表達(dá)質(zhì)粒（pIRES2/KLF6），并在GMC中能成功表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)大鼠CCL5基因啟動(dòng)子引物序列并擴(kuò)增 在基因庫數(shù)據(jù)庫中，搜索大鼠CCL5 DNA序列，尋找該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG，由此向上游確定一段序列。同時(shí)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0輔助設(shè)計(jì)CCL5基因啟動(dòng)子區(qū)（-1744nt～-14nt）的引物。應(yīng)用預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)軟件Jaspar預(yù)測KLF6在CCL5基因啟動(dòng)子區(qū)域可能的結(jié)合位點(diǎn)。再根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)CCL5基因啟動(dòng)子各截短的引物，以大鼠基因組DNA為模板，擴(kuò)增大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長和截短的序列。引物序列見表1（上游劃線處為MiuⅠ酶切位點(diǎn)，下游劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)，CG、CC分別為上游和下游酶切位點(diǎn)的保護(hù)性堿基）。

1.2.2 提取及鑒定大鼠腎組織總DNA 大鼠腎組織基因組DNA根據(jù)組織基因組DNA提取試劑盒的說明書中詳細(xì)步驟進(jìn)行提取。DNA的含量和純度采用紫外/可見分光光度儀測定，D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0之間。DNA的完整性用瓊脂糖電泳鑒定。

1.2.3 構(gòu)建與鑒定大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長和截短質(zhì)粒 用限制性內(nèi)切酶MiuⅠ和XhoⅠ雙酶切pGL3-basic以及上述不同的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，并純化線性化的pGL3-basic和酶切后的PCR產(chǎn)物。之后，將酶切后的pGL3-basic與PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接反應(yīng)過夜。連接完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，均勻涂布于含氨芐西林抗性的LB平板上，置于恒溫箱37℃培養(yǎng)10～12 h。從LB平板上挑取3個(gè)單克隆菌落分別接種于5 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，220 r/min 37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)10～12 h。取1 μL上述培養(yǎng)液，用上述引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR結(jié)果篩選出陽性克隆質(zhì)粒再送南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。鑒定正確后，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGL3-CCL5-FL（全長）、pGL3-CCL5-1（1號截短）、pGL3-CCL5-2（2號截短）、pGL3-CCL5-3（3號截短）和pGL3-CCL5-4（4號截短）。

表1 擴(kuò)增大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長和截短的引物序列

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠GMC 大鼠GMC傳代培養(yǎng)36 h后，消化細(xì)胞并用Neon細(xì)胞電轉(zhuǎn)系統(tǒng)將上述CCL5基因啟動(dòng)子全長和各截短質(zhì)粒與pIRES2/KLF6共轉(zhuǎn)染到GMC中。以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，其中各組均轉(zhuǎn)染內(nèi)參照質(zhì)粒pRLSV40，并且設(shè)pGL3-basic與未轉(zhuǎn)染組為對照組。

1.2.5 測定熒光素酶的活性 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GMC后48 h，1×PBS輕柔洗滌1次，加入裂解液裂解，置于振蕩器震蕩15min，收集裂解物于管中。用熒光檢測儀對上述CCL5基因啟動(dòng)子的熒光素酶活性進(jìn)行測定。在測量管中加入20 μL細(xì)胞裂解液，再加入50 μL LARⅡ試劑測定目的基因的螢火蟲熒光素酶活性（標(biāo)記為M1），而后加入50 μL Stop&G1o試劑測定內(nèi)參pGL-SV40質(zhì)粒的海腎熒光素酶活性（標(biāo)記為M2），被測質(zhì)粒的相對熒光素酶活性（簡稱RLU）即M1/M2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonfferoni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠CCL5基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的鑒定

根據(jù)大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長引物序列，以大鼠基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增出CCL5基因啟動(dòng)子全長（-1744nt～-14nt）。經(jīng)雙酶切，連接過夜，轉(zhuǎn)化涂板以及挑單克隆搖菌后，進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，篩選出陽性克?。▓D1），隨后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。結(jié)果表明，大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功（命名為pGL3-CCL5-FL）。

2.2 KLF6過表達(dá)對大鼠GMC分泌CCL5的影響

將對照空質(zhì)粒pIRES2及pIRES2/KLF6分別轉(zhuǎn)染GMC，48 h后收集上清，ELISA檢測CCL5的蛋白分泌情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)KLF6后的GMC中CCL5分泌量顯著高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（圖2）。這一結(jié)果表明KLF6能夠促進(jìn)CCL5蛋白的表達(dá)。

1：未轉(zhuǎn)染組；2：pIRES2組；3：pIRES2/KLF6組a：P＜0.01，與未轉(zhuǎn)染組和pIRES2組比較圖2 KLF6過表達(dá)對大鼠GMC分泌CCL5的影響

2.3 KLF6過表達(dá)對大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長活性的影響

實(shí)驗(yàn)分組如下：①pGL3-basic+pIRES2/KLF6和pRL-SV40共轉(zhuǎn)染；②pGL3-CCL5-FL+pIRES2/ KLF6和pRL-SV40共轉(zhuǎn)染；③pGL3-CCL5-FL+ pIRES2和pRL-SV40共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h裂解細(xì)胞，檢測各組的熒光素酶活性。結(jié)果顯示，pGL3-CCL5-FL+pIRES2/KLF6組的RLU值明顯高于其他兩組（圖3）。結(jié)果提示在GMC中，KLF6過表達(dá)能夠啟動(dòng)CCL5基因的轉(zhuǎn)錄。

1：pGL3-basic+pIRES2/KLF6和pRL-SV40組；2：pGL3-CCL5-FL+pIRES2/KLF6和pRL-SV40組；3：pGL3-CCL5-FL +pIRES2和pRL-SV40組a：P＜0.01，與pGL3-basic+pIRES2/KLF6組比較；b：P＜0.01，與pGL3-CCL5-FL+pIRES2組比較圖3 KLF6對大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長活性的影響

2.4 大鼠CCL5基因啟動(dòng)子各截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的鑒定

同CCL5基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建方法相同，如圖4所示，菌液PCR篩選出陽性結(jié)果，以下各截短與其目的片段大小均相吻合。將測序的結(jié)果與NCBI上報(bào)告序列進(jìn)行比對，顯示兩者序列與插入方向正確。表明大鼠CCL5基因啟動(dòng)子各截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：pGL3-CCL5-1；2：pGL3-CCL5-2；3：pGL3-CCL5-3；4：pGL3-CCL5-4圖4 CCL5各截短熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒菌液PCR鑒定

2.5 KLF6過表達(dá)對大鼠CCL5基因啟動(dòng)子各截短活性的影響

將CCL5基因啟動(dòng)子全長pGL3-CCL5-FL和各截短pGL3-CCL5-1、pGL3-CCL5-2、pGL3-CCL5-3和 pGL3-CCL5-4熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及pGL3-basic分別與pIRES2/KLF6和pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到GMC，檢測各組熒光素酶活性。結(jié)果顯示，pGL3-CCL5-FL、pGL3-CCL5-1、pGL3-CCL5-2和pGL3-CCL5-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的RLU值均明顯高于pGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，而pGL3-CCL5-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的RLU值與pGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)pGL3-CCL5-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的RLU值較pGL3-CCL5-FL、pGL3-CCL5-1、pGL3-CCL5-2和pGL3-CCL5-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著降低（圖5）。結(jié)果表明，在CCL5基因啟動(dòng)子-343nt～-191nt區(qū)域可能存在KLF6的結(jié)合位點(diǎn)。

1：pGL3-CCL5-FL；2：pGL3-CCL5-1；3：pGL3-CCL5-2；4：pGL3-CCL5-3；5：pGL3-CCL5-4；6：pGL3-basica：P＜0.01，與pGL3-basic比較；b：P＜0.01與pGL3-CCL5-4比較圖5 KLF6過表達(dá)對大鼠CCL5基因啟動(dòng)子各截短活性的影響

3 討論

Thy-1腎炎的腎組織損傷具有補(bǔ)體C5b-9，尤其是亞溶解型C5b-9復(fù)合物的依賴性。C5b-9是補(bǔ)體激活后的效應(yīng)產(chǎn)物，也是Thy-1腎炎GMC損傷的主要因素［12］。亞溶解型C5b-9插入有核細(xì)胞膜后，雖不直接造成細(xì)胞溶破，卻能激活細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞發(fā)生多種生物學(xué)行為的改變。

我們之前的實(shí)驗(yàn)已觀察到，在早期發(fā)病的大鼠Thy-1腎炎腎組織內(nèi)以及體外用亞溶解型C5b-9刺激的GMC中，轉(zhuǎn)錄因子KLF6和趨化因子CCL5的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加，且CCL5的表達(dá)趨勢基本與KLF6同步。文獻(xiàn)報(bào)道［10，13］，KLF6可參與巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答；Fischer等［14］研究發(fā)現(xiàn)，KLF6表達(dá)可見于輸尿管胚芽及其分支和集合管上，這些結(jié)果提示KLF6在腎臟發(fā)育和炎癥反應(yīng)中可能起關(guān)鍵的作用。目前已知KLF6作為一種轉(zhuǎn)錄因子，其羧基端DNA結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)可特異性與GC盒和CACCC盒結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因（胎盤糖蛋白、TGF-β受體）的轉(zhuǎn)錄［15］。

在大鼠Thy-1腎炎發(fā)病早期的腎組織中，KLF6與CCL5雖同步上調(diào)，但兩者之間的關(guān)系并不清楚。我們前期在大鼠的GMC中過表達(dá)KLF6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF6能上調(diào)CCL5的表達(dá)，提示KLF6能夠促進(jìn)CCL5蛋白的表達(dá)。在本研究中，我們構(gòu)建了大鼠CCL5基因啟動(dòng)子全長熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-CCL5-FL），與pIRES2/KLF6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到GMC中，結(jié)果顯示，KLF6能明顯上調(diào)熒光素酶活性，表明KLF6作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子確能啟動(dòng)CCL5基因的轉(zhuǎn)錄。

本研究設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了CCL5基因啟動(dòng)子不同截短熒光素酶報(bào)告基因（pGL3-CCL5-1～4），并分別將其與KLF6共表達(dá)。結(jié)果顯示，pGL3-CCL5-4組的活性明顯低于其他各組。表明KLF6在CCL5啟動(dòng)子上的結(jié)合區(qū)域可能位于-343nt～-191nt。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)只能初篩轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位，因此，仍需通過染色質(zhì)免疫共沉淀以及啟動(dòng)子突變等實(shí)驗(yàn)對兩者具體的結(jié)合區(qū)域加以準(zhǔn)確定位。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了KLF6能與趨化因子CCL5基因的啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后研究亞溶解型C5b-9刺激GMC誘導(dǎo)CCL5轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控機(jī)制提供了必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Construction of chemokine CCL5 promoter plasmid and identification of its binding sequence with KLF6

LIU Yu，YU Tian-yi，ZHANG Jing，HE Feng-xia，LU Yan-iai，ZH0U Meng-ya，WANG Lu-iu，ZHA0 Dan，QIU Wen，WANG Ying-wei
（Department of Immuno1ogy，Nanjing Medica1 University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

Objective：Construction of 1uciferase reporter with the fu11-1ength and truncated promoters of rat CCL5 gene to detect their interaction with Kruppe1-1ike factor 6（KLF6）in rat g1omeru1ar mesangia1 ce11 and identity the possib1e binding sites for KLF6.Methods：The potentia1 binding sites of KLF6 in CCL5 promoter were predicted with bioinformatics software.Rat fu11-1ength（-1744nt～-14nt）and different truncated CCL5 promoter were amp1ified by PCR and inserted into the 1uciferase reporter pGL3-basic p1asmid and named after pGL3-CCL5-FL and pGL3-CCL5-1～4 respective1y.The pGL3-CCL5-FL，pGL3-CCL5-1～4 and KLF6 expression p1asmid（pIRES2/KLF6）were co-transfected into GMC.The 1uciferase activity was detected.Results：The 1uciferase reporters of pGL3-CCL5-FL，pGL3-CCL5-1～4 were we11 constructed by PCR ana1ysis and identified with nuc1eotide sequencing.The resu1ts of 1uciferase assay showed that the transcriptiona1 activity of CCL5 gene was increased in response to KLF6 overexpression when co-transfected with pGL3-CCL5-FL or pGL3-CCL5-1～4，but the 1uciferase activity was remarkab1y1ower within pGL3-CCL5-4 transfecion，indicating that the region of rat CCL5 promoter（-343nt～-191nt）might contain KLF6 binding e1ement.Conclusion：KLF6 regu1ates the expression of CCL5 via targeting at its promoter region-343nt～-191nt.

kruppe1-1ike factor 6（KLF6）；CCL5；g1omeru1ar mesangia1 ce11；1uciferase reporter p1asmid；promoter activity

R393

A

1671-7783（2015）06-0461-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150189

2015-08-28 ［編輯］ 何承志

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81471626，31500701）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20140910）

劉玉（1990—），女，碩士研究生；王迎偉（通訊作者），教授，E-mai1：wangyw1508@njmu.edu.cn