模擬失重下大鼠下頜牙槽骨形態(tài)改變的初步探討

申晉斌, 郭慧慧, 呂 強, 馮 娟, 石瑩瑩, 張 蓉

(陜西 西安 710032: 1.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科; 2.第四軍醫(yī)大學航天航空醫(yī)學院)

模擬失重下大鼠下頜牙槽骨形態(tài)改變的初步探討

申晉斌1, 郭慧慧1, 呂 強2, 馮 娟1, 石瑩瑩1, 張 蓉1

(陜西 西安 710032: 1.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科; 2.第四軍醫(yī)大學航天航空醫(yī)學院)

目的: 初步探討模擬失重下大鼠牙槽骨骨質是否存在骨喪失。方法：將12只SD雄性大鼠，隨機分為2組(n=6)， 對照組不做任何干預，懸尾組大鼠連續(xù)懸吊4周后處死各組大鼠，并取其下頜骨磨牙區(qū)標本，分別通過Micro CT掃描重建分析比較兩組大鼠牙槽骨的骨體積分數(BV/TV,%)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)、骨小梁數量(Tb.N，mm-1)和平均密度MD值(CT)；SEM觀察比較兩組大鼠牙槽骨骨細胞和骨膠原纖維情況；能譜分析測定各大鼠感興趣區(qū)域的鈣、磷含量。結果：Micro CT掃描結果可見，懸尾組大鼠下頜磨牙根分叉下的牙槽骨骨質存在一定程度的骨喪失； 下頜牙槽骨的BV/TV、Tb.N和MD值均較對照組明顯下降(P<0.05), Tb.Th與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。SEM可見，懸尾組大鼠牙槽骨骨細胞皺縮,且排列紊亂；骨膠原纖維結構雜亂，失去正常條索狀形態(tài)。能譜分析結果顯示，懸尾組大鼠的鈣、磷含量曲線波動幅度明顯減少。結論：模擬失重下大鼠牙槽骨骨質也可存在一定程度的骨喪失。

模擬失重; 牙槽骨; 骨喪失; 骨細胞; 骨膠原纖維

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.005

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 723]

在航天飛行中，宇航員由于受失重、噪聲、晝夜節(jié)律變化等不良因素的影響，其機體骨骼肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等均會發(fā)生一系列生理適應性反應[1]。在所發(fā)生的一系列適應性改變中，大部分系統(tǒng)的變化具有一定的自限性，可在航天飛行中達到新的平衡狀態(tài)而不再繼續(xù)發(fā)展，但骨骼系統(tǒng)的變化無自限性，且呈現(xiàn)出進行性的過程[2]。隨著航天次數和時間的不斷增加，航天員在太空失重環(huán)境中的生活時間也不斷延長,失重性骨丟失對航天員的影響和危害將非常嚴重。目前，對于失重性骨丟失的研究主要集中于承重骨，包括脊柱、骨盆和下肢骨，而對于全身骨骼中代謝最活躍的骨組織—牙槽骨的研究則相對較少。牙槽骨具有高度可塑性，是重要的牙周支持組織，其對牙體的發(fā)生、發(fā)育和萌出以及維持正常的咀嚼功能均起著不可替代的作用。牙周病和生理性退縮等原因都會造成牙槽骨高度的降低、密度的改變和牙周膜附著高度的喪失，從而使牙周支持組織在咬合力作用下的改建過程發(fā)生變化。牙槽骨內存在的一些感受器能通過感受外部施加的機械刺激而活化相關骨細胞，并進而引起骨的吸收或形成。有研究表明[3-4],骨質疏松癥對牙槽骨的骨礦含量和剩余牙槽骨體積都會產生明顯影響。另有研究發(fā)現(xiàn)[5]， 模擬失重下人口腔咬合力及咬合速率明顯下降。那么，失重環(huán)境下牙槽骨是否也會像長骨一樣出現(xiàn)骨質喪失呢？其骨改建后的形態(tài)如何？本研究擬采用大鼠尾部懸吊法這一成熟的模擬失重的方法[6-7]，進行分組對照實驗研究，并通過Micro CT和掃描電鏡(SEM)分別觀察實驗組和對照組大鼠的牙槽骨改建情況；以期為進一步完善失重性骨喪失發(fā)生的可能機制、尋找其對抗或改善措施提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物模型的建立及標本的獲取

取清潔級雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)12只(體質量230～250 g)，置于動物飼養(yǎng)房室內[溫度(23±2)℃，相對濕度50%，12 h光照/黑暗交替循環(huán)]，適應性飼養(yǎng)(保證足量清潔飲水和鼠糧)1周后，將其隨機分為對照組(control group,CON組)和懸尾組(tail suspension group,TS組)(n=6)。其中懸尾組各大鼠的尾吊方法參照Morey-Holton等[8]報道的大鼠后肢去負荷建模法進行操作,即大鼠始終保持30°頭低位，且后肢呈自由懸垂不荷重狀態(tài)，連續(xù)4周；對照組大鼠不采取任何干預措施，并置于懸尾組相同環(huán)境下進行飼養(yǎng)。4周實驗期滿時分別取兩組大鼠，用10 g/L戊巴比妥鈉注射液腹腔注射(50 mg/Kg)麻醉后，迅速取出其雙側下頜骨；然后分別制備包括下頜磨牙及其牙槽骨的下頜骨段，置于40 g/L多聚甲醛(PFA)液中固定保存。該實驗經第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院動物管理倫理委員會批準(批準號：2015倫審字061號)。

1.2 Micro CT掃描重建分析

分別取各大鼠的右側下頜骨標本，采用Micro CT以360°旋轉方式對其進行掃描，掃描參數: 分辨率15 μm, 電壓80 kV, 電流500 μA, 掃描時間為45 min, 角度增益0.6°, 曝光時間2 500 ms。掃描結束后，分別對各標本的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)——距下頜第一磨牙(M1)根分叉下0.5 mm處，約2.0 mm×0.8 mm×0.5 mm的長方體骨體(圖1a)進行三維重建；并采用系統(tǒng)自帶的Inveon Research Workplace 2.2軟件對其骨小梁的形態(tài)進行定量分析，分析參數(圖1b)包括骨體積分數(bone volume fraction，BV/TV，%)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb．Th，μm)、骨小梁數量(trabecular number，Tb．N，mm-1)等。以上各指標的圖像分析均參照Pinto M等[9]報道的方法，并通過圖1c所列公式計算各標本感興趣區(qū)域的平均密度CT值(ROI mean density)，以用于組間比較。Micro CT掃描、感興趣區(qū)域的三維重建及參數分析均由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學研究所Micro CT室的技師完成。

1.3 SEM及能譜分析

分別取各大鼠的左側下頜骨標本(不脫鈣)，經梯度脫水后用樹脂(甲基丙烯酸甲酯)進行包埋。待樹脂完全固化后，用硬組織切片機(LEICA1600型，德國)分別沿各標本的矢狀向將其逐層切削至磨牙的正中，使之形成矢狀切面。切好的各樹脂標本表面分別經砂紙打磨拋光刀痕、超聲清洗1 min、細磨光片打磨拋光、370 g/L磷酸酸蝕15 s 去除玷污層、雙蒸水清洗3次(每次3 min)后，用離子濺射儀(型號E-1045)(株式會社，日本)對其表面進行噴金處理；然后用場發(fā)射掃描電鏡(HIACHI S-4800C)(株式會社，日本)分別觀察各標本的牙槽骨骨細胞和骨膠原纖維情況，并用能譜儀(株式會社，日本)分析感興趣區(qū)域牙槽骨中的鈣、磷含量。

a. 下頜第一磨牙牙槽骨感興趣區(qū)域(ROI)三維重建及骨形態(tài)學分析測量; b. 系統(tǒng)自動分析軟件所得參數，包括BV/TV、Tb.Th，Tb.N等; c. 牙槽骨感興趣區(qū)域平均密度計算公式

圖1 Micro-CT掃描重建及分析

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Micro CT掃描重建分析結果

Micro CT掃描重建分析結果顯示，大鼠經懸尾后其第一磨牙和第二磨牙根分叉下的牙槽骨有明顯吸收(圖2)。對所得參數進行統(tǒng)計分析顯示：懸尾組大鼠的骨小梁數目(Tb.N)、平均密度CT值(ROI mean density)及骨體積分數(BV/TV)較對照組明顯減少(P< 0.05)；其骨小梁厚度(Tb.Th)雖較對照組稍有增加，但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

圖2 兩組Micro CT掃描及感興趣區(qū)域三維重建(箭頭示牙槽骨吸收)

圖3 Micro CT掃描重建及分析結果(*P<0.05)

2.2 SEM觀察結果

SEM觀察顯示：懸尾組大鼠下頜磨牙根分叉下的牙槽骨存在明顯的骨質丟失；對照組牙槽骨骨細胞的形態(tài)正常且排列規(guī)則，骨基質均勻致密，而懸尾組的牙槽骨骨細胞則排列紊亂，骨陷窩空隙增大甚至空洞，骨基質相對疏松；對單個骨細胞的形態(tài)特征進行比較可見，對照組的骨細胞飽滿呈梭形，且突起明顯，而懸尾組的骨細胞則形態(tài)各異，表現(xiàn)為骨細胞收縮、陷窩變大、周圍突起斷裂(圖4)。對照組大鼠的牙槽骨骨膠原纖維排列整齊、緊密且有方向性；懸尾組大鼠的骨膠原纖維則結構雜亂,表現(xiàn)為連續(xù)性中斷、完整性較差、無正常條索外形且輪廓不清，同時還可見膠原纖維束排列紊亂、走向不一致,且相互間交聯(lián)雜亂而失去應有的規(guī)律，骨膠原纖維也不能聚集成排列有序、形態(tài)規(guī)整的膠原纖維束(圖5)。

圖4 觀察兩組大鼠下頜第一磨牙根分叉下牙槽骨情況(SEM)

圖5 兩組大鼠下頜第一磨牙根分叉下牙槽骨骨膠原纖維情況(SEM)

對照組 懸尾組

白色橫線為譜分析區(qū)域; 淺藍色曲線為磷含量的波動值; 紫色曲線為鈣含量的波動值

圖6 兩組能譜分析結果

2.3 能譜分析結果

對牙槽骨吸收較重的感興趣區(qū)域進行能譜分析顯示：對照組的鈣、磷含量處于一個較為規(guī)則的波動曲線；懸尾組的鈣、磷含量曲線在中間部分波動特別小，幾乎呈一直線，提示該處的牙槽骨骨質有明顯喪失(圖6)。

3 討論

空間飛行中最重要的環(huán)境特征之一就是微重力(失重)，在失重環(huán)境下由于骨骼不再承受人體的重量，加之肢體運動量減少，從而減輕了對骨骼的刺激并最終導致骨質丟失現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為骨密度降低、骨骼礦物質喪失[10-12]。關于全身性骨質疏松與牙槽骨骨質疏松的一致性目前雖尚無定論,但大多數學者認為頜骨是全身骨骼的一部分,影響全身骨質疏松的因素同樣可作用于頜骨。 Genco RJ 等[13]認為，骨質疏松癥也是牙周病的危險因素之一。牙槽骨與長骨相比，兩者的基本構成一致，均由細胞(成骨細胞、破骨細胞和骨細胞)和基質組成; 但兩者的形態(tài)和結構不同。牙槽骨由最內側的固有牙槽骨、中間的松質骨及外側的密質骨組成；其中，松質骨由骨小梁和骨髓組成，位于密質骨和固有牙槽骨之間，占牙槽骨總體積的80%以上。有研究發(fā)現(xiàn)，失重狀態(tài)下骨質的喪失以松質骨為重[14],模擬失重下人的口腔咬合力及咬合速率均會明顯下降[5]。那么，富含松質骨的牙槽骨在失重時是否也會像長骨一樣出現(xiàn)骨質喪失呢？本實驗結果初步證實，當大鼠處于模擬失重下時，其下頜磨牙區(qū)的牙槽骨骨質也存在一定程度的骨質喪失；雖然該實驗樣本量較少，其結論還需大樣本數據進一步驗證，但足以提醒我們應該對航天員這一特殊人群的口腔健康狀況引起重視，并進一步探究模擬失重下牙槽骨喪失的原因。

骨細胞是骨組織中數量最多的細胞，作為骨機械應力的直接感受器，其不僅可以將力學信號轉化為生化信號，還可將信號傳遞給骨組織的其他細胞，調控后者的功能[15]。近年來，隨著多種骨細胞系和骨細胞特異性轉基因小鼠模型的建立，對骨細胞生物學功能的研究也不斷深入，骨細胞已經成為骨生物力學研究的最大熱點和進展最迅速的領域。最新研究發(fā)現(xiàn)：骨細胞在某些特殊狀態(tài)[16](如哺乳期)或給予糖皮質激素治療[17]后可發(fā)生自體吞噬(autophage),從而使其自身微環(huán)境中的骨陷窩-淚小管系統(tǒng)發(fā)生降解和重塑。自吞現(xiàn)象的存在，不僅是細胞清除自體垃圾的保護性行為，同時也是細胞為針對不同應力產生的適應性改變以提供營養(yǎng)和能量[18-19]。鑒于骨細胞的數量及活性對骨量的維持起著重要作用，我們推測骨細胞的自吞現(xiàn)象可能是模擬失重下大鼠牙槽骨骨質丟失的原因之一。為了明確模擬失重下大鼠下頜牙槽骨骨量的減少是否由于骨細胞減少所致,我們通過SEM及其圖像對單位骨面上的骨細胞數和骨細胞面進行了分析; 結果顯示，懸尾組大鼠下頜牙槽骨的骨細胞形態(tài)各異，且破壞明顯，嚴重者骨細胞已不可見，呈現(xiàn)空洞形。

骨骼是人體的重要組織,起著支撐身體、保護器官和調節(jié)鈣、磷代謝的作用。骨基質中所含的主要有機物為I型膠原纖維,主要無機物是由鈣、磷所構成的羥基磷灰石晶體。骨基質中的有機物除為其提供韌性特征[20]外,還能為骨基質中羥基磷灰石晶體提供沉積位點,并在骨質礦物質沉積中起著礦化支架的作用[21]。本結果顯示，懸尾組大鼠牙槽骨骨基質中的I型膠原纖維存在異常改變,其I型膠原纖維束在排列結構上與對照組相比,失去了其規(guī)律、周期的排列結構,取而代之的是排列迂曲紊亂的結構。膠原纖維及膠原纖維束的異常,可導致骨骼中的無機物(羥基磷灰石晶體)不能在有機物中正常沉積,從而使骨骼發(fā)生礦化不全或礦化缺失,最終將導致骨骼的機械強度下降。能譜分析結果顯示，懸尾組大鼠第一磨牙根分叉區(qū)的鈣、磷含量幾乎呈一直線，無明顯的上下波動；提示，模擬失重可能通過某些信號通道使骨細胞發(fā)生自吞，從而使骨細胞的數量減少并導致牙槽骨的骨質喪失。但其具體機制尚需進一步的研究。

本實驗中還發(fā)現(xiàn)，懸尾組大鼠牙槽骨骨質喪失的部位在磨牙根分叉下及牙根之間的區(qū)域(P<0.05)，而非牙槽嵴和牙槽中隔部分(P>0.05)，這有別于牙周慢性炎癥和咬合創(chuàng)傷等局部因素而引起牙槽骨吸收的特點[22]。分析其原因可能是此區(qū)域牙槽骨日常受力較小，其骨密度較內側固有牙槽骨和外側密質骨低，相對疏松的骨質可能是其在模擬失重下較早出現(xiàn)骨質喪失的原因。Johnston BD等[23]對“切除大鼠卵巢模擬絕經后女性牙槽骨喪失”進行綜述時，將感興趣區(qū)域(ROI)設定為下頜磨牙牙根間隔(interradicular septum)牙槽骨，并認為該區(qū)域是大鼠卵巢切除后牙槽骨較早和容易出現(xiàn)骨質丟失的區(qū)域；與本實驗所選的感興趣區(qū)域一致。然而，骨質喪失的機制是復雜的，其中可能涉及多個介質，且具體分子機制仍未完全明確，尚需進一步深入研究，以期為臨床調控骨改建過程、預防和治療骨疾病提供實驗依據。

[1]Mortazavi SM，Cameron JR，Niroomand- rad A．Adaptive response studies may help choose astronauts for long- term space travel[J].AdvSpaceRes, 2003，31(6)：1543-1551.

[2]孫喜慶，姜世忠．空間醫(yī)學與生物學研究[M]. 西安: 第四軍醫(yī)大學出版社，2010：103.

[3]Jiang GZ，Matsumoto H，Hori M，etal．Correlation among geometric,densitometric, and mechanical properties in mandible and femur of osteoporotic rats [J].JBoneMinerMetab, 2008，26(2)： 130-137.

[4]Brennan- Calanan RM，Genco RJ，Wilding GE，etal．Osteoporosis and oral infection:independent risk factors for oral bone loss[J]．JDentRes，2008，87(4)：323-327.

[5]史亮，牛忠英，王林杰，等．15d-6°頭低位臥床對女性最大咬合力及咬合速度的影響[J]. 航天醫(yī)學與醫(yī)學工程，2011，24(4)：280-282.

[6]董麗，王瓊，劉新民，等．地面模擬失重實驗方法概況[J]. 中國實驗動物學報，2013，21(5)：90-94.

[7]Morey- Holton ER，Globus RK．Hindlimb unloading rodent model: technical aspects[J].JApplPhysiol, 2002，92(4)：1367-l377.

[8]Morey- Holton E，Globus RK，Kaplansky A，etal．The hindlimb unloading rat model：literature overview,technique update and comparison with space flight data[J]．AdvSpaceBiolMed，2005，10：7-40.

[9]Pinto M， Jepsen KJ，Terranova CJ,etal．Lack of sexual dimorphism in femora of the eusocial and hypogonadic naked mole-rat: a novel animal model for the study of delayed puberty on the skeletal system[J].Bone, 2010，46(1)：112-120.

[10]Smith SM， Heer M ．Calcium and bone metabolism during space flight[J].Nutrition, 2002，18(10)：849-852.

[11]LeBlanc A，Schneider V，Shackelford L，etal．Bone mineral and lean tissue loss after long duration space flight[J].JMusculoskeletNeuronalInteract，2000，1(2)：157-160.

[12]McCarthy ID．Fluid shifts due to microgravity and their effects on bone: a review of current knowledge[J].AnnBiomedEng, 2005，33(1)：95-103.

[13]Genco RJ，Borgnakke WS．Risk factors for periodontal disease[J].Periodontology2000, 2013，62(1)：59-94.

[14]Cervinka T，Siev nen H，Hyttinen J，etal．Bone loss patterns in cortical, subcortical, and trabecular compartments during simulated microgravity[J].JApplPhysiol，2014，117(1)：80-88.

[15]Ken W，Kyoji I．Osteocytes in normal physiology and osteoporosis[J].ClinicRevBoneMinerMetab, 2010，8：224-232.

[16]Qing H，Ardeshirpour L，Pajevic PD，etal． Demonstration of osteocytic perilacunar/canalicular remodeling in mice during lactation[J]．JBoneMinerRes, 2012，27(5)：1018-1029.

[17]Piemontese M，Onal M，Xiong J，etal．Suppression of autophagy in osteocytes does not modify the adverse effects of glucocorticoids on cortical bone[J].Bone，2015，75：18-26.

[18]Nollet M，Santucci- Darmanin S， Breuil V，etal．Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis[J].Autophagy，2014，10(11)：1965-1977.

[19]Yang Z，Klionsky DJ．Eaten alive: a history of macroautophagy[J].NatCellBiol, 2010，12(9)：814-822.

[20]Viguet- Carrin S,Garnero P,Delmas PD.The role of collagen in bone strength[J].OsteoporosInt, 2006,17(3):319-336.

[21]Pace JM,Atkinson M,Willing MC,etal.Deletions and duplications of Gly- Xaa- Yaa triplet repeats in the triple helical domains of type I collagen chains disrupt helix formation and result in several types of osteogenesis imperfecta [J].HumMutat, 2001,18(4):319-326.

[22]孟煥新.牙周病學[M]. 4版 . 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012: 119-123.

[23]Johnston BD，Ward WE．The ovariectomized rat as a model for studying alveolar bone loss in postmenopausal women[J].BiomedResInt, 2015 , 2015:635023. Epub 2015：1-12.

The morphological changes of mandibular alveolar bone in rats under the conditions of simulated weightlessness- a pilot study

SHEN Jin- bin*, GUO Hui- hui, LYU Qiang, FENG Juan, SHI Ying- ying, ZHANG Rong

(*StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology,DepartmentofOperativeDensityandEndodotics,SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China)

AIM: To investigate the alveolar bone loss in rats under simulated weightlessness condition. METHODS: 12 male SD rats were divided randomly into the control group and the tail suspension group(TS group) (n=6). After 4 w tail- suspension, all rats were sacrificed and the alveolar bone of the mandibular molar region were removed. The bone volume fraction wersus total volume(BV/TV,%), trabecular bone thickness(Tb.Th，μm),trabecular bone number(Tb.N，mm-1) and average density (mean density, MD) of the 2 groups were compared by MicroCT analysis. Bone cells and bone collagen fibers were observed by SEM. The relative contents of calcium and phosphorus in alveolar bone were measured with energy spectrum system. RESULTS: Bone loss was observed by MicroCT in the interradicular septum of the mandibular teeth in the TS group. Significant decrease was observed in BV/TV, Tb.N and MD in the TS group(P<0.05). The Tb.Th didn't show a significant change between the two groups (P>0.05). SEM study showed that osteocytes of TS group shrinked and lined in a disorder way, bone collagen was in disorder, discontinuity, poor integrity and lost the normal cord- like shape. The relative content of calcium and phosphorus declined in TS group. CONCLUSION：Weightlessness may lead to a certain degree of alveolar bone loss.

simulated weightlessness; alveolar bone; bone loss; osteocyte; bone collagen fibers

2015-09-21

國家自然科學基金(31170898)

申晉斌(1980-)，男，漢族，山西晉中人。碩士生(導師：張蓉)

張 蓉，E-mail：zhangrong@fmmu.edu.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0723-06

郭慧慧為共同第一作者