冠心病患者血漿中microRNA-145表達與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的相關(guān)性研究

唐義信 孫權(quán) 朱靈萍 童霄羽 羅瑛

冠狀動脈側(cè)支循環(huán)（coronarycollateral circulation，CCC）的建立是心肌在長期、反復(fù)缺血基礎(chǔ)上形成的一種代償機制。建立良好的CCC可以在一定程度上增加冠狀動脈血流儲備，縮小急性心肌梗死的面積，降低急性冠狀動脈事件后的死亡率，減少室壁瘤的形成，改善心室功能，有益于冠心病患者的預(yù)后[1]。然而，目前對CCC的形成機制尚不清楚。大量研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,ⅤEGF）、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血小板衍生生長因子（platelet-derivedgrowth factor，PDGF）等參與了 CCC的形成。其中ⅤEGF通過FLT-1和FLT-KDR受體直接作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激其增殖、遷移、小管形成[2]，具有強大的促血管生成作用。MicroRNA-145（miRNA-145）與血管生成相關(guān)，在代謝綜合征的大鼠模型中通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的表型改變參與CCC的形成[3]。此外，ⅤEGF也是miRNA-145的靶基因，因此探討miRNA-145和ⅤEGF在CCC中表達水平及其相關(guān)性，有助于進一步揭示CCC形成的機制。

1 對象和方法

1.1 研究對象

入選2012年3月至2014年3月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院心導(dǎo)管室接受選擇性冠狀動脈造影（CAG）檢查的冠心病患者80例，其中男性53例，女性27例。 年齡51～78歲，平均（63.8±4.7）歲。

入選標準：左前降支（left anterior descending，LAD）、左回旋支（left circumflex artery，LCX）、右冠狀動脈（right coronary artery，RCA）三支主要冠狀動脈中至少一支直徑狹窄≥90%，其中一支病變、兩支病變、三支病變分別為20例（25.0%），17例（21.3%），43 例（53.8%）。

排除標準：（1）年齡 ＜18歲、＞90 歲；（2）既往曾接受過支架置入術(shù)或冠狀動脈旁路移植治療；（3）近3個月發(fā)生過急性心肌梗死；（4）合并先天性冠狀動脈畸形；（5）合并瓣膜性心臟??；（6）合并感染、腫瘤或結(jié)締組織疾病者；（7）合并肝、腎功能不全或外周血管疾病者。

征得患者知情同意后，詳細采集相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、血壓、心率、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、血脂異常及用藥情況。

1.2 冠狀動脈造影方法

冠狀動脈造影在Philips HC5000型心血管專用X光機上進行。采用Judkin法行選擇性左、右冠狀動脈造影，行多角度投照體位判斷冠狀動脈狹窄程度。每個投照體位采集3～5個以上心動周期影像，以確保冠狀動脈清晰及側(cè)支血管成像。評價冠狀動脈狹窄程度均由兩位經(jīng)驗豐富的心血管介入醫(yī)師閱片后取平均值，如兩位醫(yī)師判斷結(jié)果存在較大差異時，再請第3位經(jīng)驗豐富介入醫(yī)師商討后再計算冠狀動脈的狹窄程度。

1.3 評分標準

1.3.1 冠狀動脈病變程度評價 根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果，采用公認Gensini積分方法[4]評價冠狀動脈病變程度。冠狀動脈狹窄程度分為25%、50%、75%、90%、99%和100%。其中狹窄 ＜25%定義為1分，25% ～49%定義為2分，50%～74%定義為4分，75% ～89%定義為8分，90%～99%定義為16分，100%定義為32分。不同節(jié)段冠狀動脈評分系數(shù)嚴格按照Gensini標準執(zhí)行。每例患者冠狀動脈病變程度的最終積分為三支主要分支的積分之和。

1.3.2 CCC形成程度評價 按照Rentrop分級方法[5]對CCC進行分級。0級：不能觀察到任何側(cè)支循環(huán)通道的充盈；1級：可見側(cè)支循環(huán)充盈病變血管的分支，但不能充盈心外膜下血管段；2級：側(cè)支循環(huán)充盈部分心外膜下血管段；3級：側(cè)支循環(huán)充盈整個心外膜下血管段。

1.4 血漿樣本的收集

患者行冠狀動脈造影術(shù)前，從橈動脈血管鞘內(nèi)抽取動脈血5 ml，迅速轉(zhuǎn)入EDTA采血管中，在室溫下靜置 15～30 min后，3 000 r/min（離心半徑：10 cm）離心10 min，取血漿分裝于EP管中，-80℃冰箱保存待用。

1.5 血漿中miRNA-145的提取

取上述血漿樣本，每份 400 μL，按 Trizol（TaKaRa，中國大連）試劑盒說明書提供的方法提取總 RNA。RNA溶于20 μL DEPC處理過的水中，4℃過夜后測定其水平，并電泳檢測 RNA完整性。血漿中miRNA-145的表達采用realtime PCR方法測定。每個待測樣取500 ng總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國大連）合成cDNA，稀釋 4倍后取2 μL作為 real-time PCR的模板。利用ABI7500 real-time PCR儀檢測血漿中miRNA-145表達，反應(yīng)體系和程序設(shè)置均參考real-time試劑盒（TaKaRa，中國大連）說明書。內(nèi)參基因U6和目的基因miRNA-145的反轉(zhuǎn)錄引物和real-time引物均購自廣州銳博生物科技有限公司。Real-time PCR結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法。

1.6 血漿中ⅤEGF水平的測定

血漿中ⅤEGF的測定采用ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），操作步驟參考說明書。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，最后記錄450 nm的OD值，用于繪制標準曲線和計算待測樣品水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基線臨床資料比較

如表1所示，各組患者在年齡、性別、血壓、心率、吸煙史、血脂異常、高血壓史、糖尿病史、心肌梗死病史及用藥情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明各組間存在可比性。且隨著CCC分級的升高，Gensini積分也隨之升高，其中 CCC 2級和3級組的Gensini積分明顯高于 CCC 0級組（P＜0.05或 P＜0.01）。

2.2 不同 CCC組患者血漿中 ⅤEGF水平及miRNA-145相對表達比較

單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，不同CCC組患者血漿中ⅤEGF水平及miRNA-145相對表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；通過LSD-t檢驗進行組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，上述兩個指標的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表 2。

2.3 血漿中ⅤEGF水平和miRNA-145相對表達水平與CCC相關(guān)性分析

如圖1、2所示，采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)嚴重冠心病患者的血漿中ⅤEGF水平與患者的CCC分級呈明顯的正相關(guān)（r=0.672，P ＜0.01）；血漿中miRNA-145相對表達水平與患者的CCC分級呈明顯的負相關(guān)（r=-0.761，P ＜0.01）。

2.4 血漿中ⅤEGF水平與miRNA-145相對表達水平相關(guān)性分析

通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)ⅤEGF 3′UTR存在miRNA-145的結(jié)合位點（圖3A），因此我們分析了不同CCC組血漿中ⅤEGF水平與miRNA-145相對表達水平的相關(guān)性。結(jié)果表明，不同CCC組血漿中ⅤEGF水平與miRNA-145相對表達水平呈明顯負相關(guān)（r=-0.529，P ＜0.01，圖3B）。

2.5 miRNA-145相對表達水平、血漿ⅤEGF水平與CCC分級的相關(guān)性

以冠狀動脈CCC分級為因變量，血漿ⅤEGF水平與miRNA-145相對表達水平為自變量，構(gòu)建多元線性回歸分析模型，分析miRNA-145相對表達水平或血漿ⅤEGF水平與CCC分級間單獨的相關(guān)關(guān)系。如表3結(jié)果所示，控制血漿ⅤEGF水平后，miRNA-145相對表達水平與患者的CCC分級呈明顯的負相關(guān)（r=-0.669，P ＜0.01）；控制 miRNA-145相對表達水平后，血漿ⅤEGF水平與患者的CCC分級呈明顯的正相關(guān)（r=0.524，P ＜0.01）。

表1 不同CCC分級組患者基線臨床資料比較

表2 不同CCC分級組患者血漿中ⅤEGF及miRNA-145相對表達水平比較（）

表2 不同CCC分級組患者血漿中ⅤEGF及miRNA-145相對表達水平比較（）

CCC分級 例數(shù) ⅤEGF（ng/L） miRNA-145 0級 24 100.3± 6.0 0.75±0.11 1級 19 109.7±12.4 0.66±0.13 2級 20 120.8±14.0 0.58±0.09 3級 17 131.7±19.5 0.40±0.09 F值 20.88 37.9 P值 0.001 0.001

圖1 冠心病患者血漿ⅤEGF水平與CCC分級相關(guān)性分析

圖2 冠心病患者血漿miRNA-145相對表達水平與CCC分級相關(guān)性分析

圖3 冠心病患者血漿ⅤEGF水平與miRNA-145相對表達水平相關(guān)性分析（n=80）

表3 CCC分級的多元線性回歸分析結(jié)果

3 討論

Merenich等[6]在1956年發(fā)現(xiàn)正常心臟冠狀動脈之間存在側(cè)支通道，其直徑為20～350 μm，長度為1～5 cm，但這些通道無論形態(tài)上還是功能上都不成熟，不具備動脈血管的結(jié)構(gòu)與功能。當冠狀動脈嚴重狹窄病變或閉塞時，在壓力階差和細胞因子的刺激下冠狀動脈之間不成熟的側(cè)支通道逐漸發(fā)育成熟的CCC，良好的CCC的建立直接影響到冠心病患者的預(yù)后。本研究通過觀察不同CCC組患者血漿中ⅤEGF水平及 miRNA-145相對表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）隨著CCC分級的增加，血漿中ⅤEGF水平亦隨之升高，血漿中miRNA-145相對表達隨之下降；（2）血漿中 ⅤEGF水平與 CCC的建立呈正相關(guān)，miRNA-145相對表達與CCC呈負相關(guān)，且miRNA-145與ⅤEGF呈負相關(guān)。

ⅤEGF是一種促進血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成的細胞因子，通過與受體的結(jié)合從而誘導(dǎo)多種細胞反應(yīng)，包括促進細胞的增殖、遷移、血管新生及抑制細胞凋亡等[7]。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)ⅤEGF在CCC的形成中起重要作用，血漿中ⅤEGF水平與CCC的形成呈正相關(guān)[8]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，在正常的動物模型中給予ⅤEGF能促進CCC的形成，而予以ⅤEGF抑制劑能抑制CCC的形成，表明ⅤEGF是CCC形成必不可少的細胞因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)血漿中ⅤEGF水平CCC分級的增加而升高，不同CCC組之間差異明顯，且ⅤEGF水平與CCC的建立呈正相關(guān)，與Matsunaga等[10]的研究結(jié)果相一致，可能與機體缺血缺氧后，誘導(dǎo)ⅤEGF產(chǎn)生，通過與受體相結(jié)合刺激多種信號通路，促進CCC的形成。

miRNA是一類在翻譯水平上調(diào)控基因表達的小分子非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)有一些miRNA參與血管生成，如 miRNA-216、miRNA-21、miRNA-145等。本研究中，隨著 CCC分級的增加，血漿中miRNA-145相對表達隨之下降，且CCC的形成呈負相關(guān)。因此推測，miRNA-145可能通過影響其下游靶基因如ⅤEGF的表達參與CCC的形成。同時通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ⅤEGF 3′UTR區(qū)存在miRNA-145的結(jié)合位點，而已有研究也表明miRNA-145可以通過抑制ⅤEGF的表達參與血管的新生及血管平滑肌細胞表型的改變[11-12]。同時分析了不同CCC組間血漿中miRNA-145表達水平及ⅤEGF水平相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在不同CCC組間兩者呈負相關(guān)，表明miRNA-145通過調(diào)控ⅤEGF的表達參與CCC的建立。

總之，CCC的形成機制極其復(fù)雜，深入探討對冠心病的預(yù)后具有重要臨床意義。本研究提示，在CCC形成中，miRNA-145發(fā)揮著重要作用，可能通過調(diào)控ⅤEGF的表達參與CCC的建立。但本研究由于樣本量小，其確切的機制有待進一步研究。