殼聚糖溫敏性水凝膠蛋白載體的制備及其性能研究

楚立凱，岳 凌，楊占山

（蘇州大學 醫(yī)學部 放射醫(yī)學與防護學院 蘇州 215123）

溫敏性水凝膠是智能水凝膠的一種，自1975年發(fā)現(xiàn)聚丙烯酸能響應(yīng)溫度變化產(chǎn)生溶脹和收縮功能開始，溫敏性材料的使用已有近40年歷史.與傳統(tǒng)水凝膠相比，智能水凝膠對外界環(huán)境變化敏感，并能產(chǎn)生相應(yīng)的物理結(jié)構(gòu)及化學性質(zhì)的變化，而溫敏性水凝膠就是對環(huán)境溫度變化敏感的智能高分子材料，存在低溫臨界溶解溫度（Lower Critical Solution Temperature，LCST），即在低溫時呈現(xiàn)溶液狀態(tài)，而當溫度升高至LCST 附近時可以形成凝膠狀態(tài).因為這一特性，溫敏性水凝膠已被廣泛應(yīng)用于生物組織工程支架，藥物遞送系統(tǒng)［1－2］、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、個人護理產(chǎn)品等領(lǐng)域.制備溫敏性水凝膠的原材料主要分為兩類：第一類為合成高分子材料如丙烯酸類及其衍生物［3］、聚丙烯酸胺類及其衍生物、丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸等.第二類為天然高分子材料如羥甲基纖維素、甲殼素／殼聚糖及其衍生物［4］、膠原蛋白、透明質(zhì)酸和明膠等.合成方法主要包括共混法、凍融法及紡絲法等物理方法和接枝共聚和高能輻射等化學方法.作為藥物載體，合成高分子材料雖然種類較多，性能較好，但水凝膠內(nèi)部往往混雜未反應(yīng)的單體、殘余引發(fā)劑或催化劑等可對細胞和蛋白質(zhì)產(chǎn)生刺激作用、致敏性、毒性等不良作用［5］.而天然高分子材料在生物相容性、低抗原性和生物降解性等方面具有潛在優(yōu)勢，但存在機械性能較差，凝膠時間長，釋放效果不理想等缺點［6］.

本實驗選用殼聚糖（CS）／明膠（G）／京尼平（GP）系列的溫敏性水凝膠［7］，此類水凝膠在生物相容性、細胞毒性等方面表現(xiàn)優(yōu)良，并對蛋白類藥物具有良好釋放效果.本實驗在上述基礎(chǔ)上加入了β－甘油磷酸鈉（β－GP）［8］制備了一種新型的藥物釋放性能良好的溫敏性水凝膠，并對其理化性能進行了研究.

1 試驗材料和方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

殼聚糖（Chitosan，CS），食品級，脫乙酰度為91%，粘度為122mpa.s，購自浙江金殼生物化學有限公司；明膠（Gelatin，G），藥用級，購自成都艾科達化學試劑有限公司；京尼平（Genipin，GP）購自日本和光純藥工業(yè)株式會社；β－甘油磷酸鈉（β－glycerophosphate，β－GP），分析純，購自Sigma－Aldrich；乙酸購自國藥集團化學試劑有限公司.

1.1.2 儀器與設(shè)備

分析天平系上海精科天美科學儀器有限公司生產(chǎn)；振蕩器和鼓風干燥箱系上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；磁力攪拌器為金壇醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；－80℃冰箱系Thermo Scientific公司的產(chǎn)品；純水機，美國Millipore公司生產(chǎn)；冷凍干燥機系美國LABCONCO 公司的產(chǎn)品；傅立葉變換紅外光譜儀，NICOLET6700FT－IR，美國Thermo Scientific公司生產(chǎn).

1.2 方法

1.2.1 水凝膠的制備

將不同質(zhì)量的已純化殼聚糖溶解于0.1%的乙酸溶液中，在磁力攪拌器下攪拌2h.將明膠置于去離子水中50℃高溫溶解，而后加入到殼聚糖溶液中，形成殼聚糖明膠混合溶液.將殼聚糖溶解于去離子水中并50℃高溫促溶，將β－甘油磷酸鈉溶解到去離子水中，使其完全溶解.在冰浴并應(yīng)用磁力攪拌器持續(xù)攪拌下，將京尼平、β－甘油磷酸鈉溶液按順序逐滴加入到殼聚糖和明膠的混合液中，并持續(xù)攪拌0.5h，形成水凝膠混合溶液.在水凝膠混合溶液中，殼聚糖的體積質(zhì)量濃度分別為：1.6%，2.0%，2.4%，β－甘油磷酸鈉的體積質(zhì)量濃度為：12%和16%，明膠的體積質(zhì)量濃度為0.6%，京尼平的體積質(zhì)量濃度為0.1%.實驗可得到6種配比的水凝膠溶液.將水凝膠溶液緩慢倒入直徑為2.5cm 的圓柱形模具中并用封口膜封閉，置于37℃恒溫箱一段時間，即可得到6種凝膠態(tài)的溫敏性殼聚糖水凝膠.水凝膠的材料配比見表1.

1.2.2 水凝膠在37℃的凝膠時間

應(yīng)用試管倒置法，測定水凝膠在37℃的凝膠時間，將攪拌后形成的6種水凝膠溶液置于小燒杯中，每種水凝膠各制備3個平行樣.將小燒杯放置在37℃恒溫水浴鍋中，每隔10s取出小燒杯，將其向側(cè)面傾倒，觀察水凝膠溶液的流動狀態(tài)，直到水凝膠溶液形成凝膠狀的固體，在小燒杯倒置后，不再流動為止.記錄水凝膠溶液成為凝膠狀固態(tài)的時間，此即為水凝膠在37℃的凝膠時間.

1.2.3 水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

分別配置6種不同比例的水凝膠溶液，在37℃成膠后放入－80℃冰箱中過夜，而后取出進行真空冷凍干燥至恒重后切片，將干燥的樣本噴金，應(yīng)用掃描電鏡對水凝膠內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)進行觀察.

1.2.4 紅外光譜應(yīng)用CS／β－GP 5號配比的水凝膠制備加入京尼平及未加入京尼平的水凝膠樣品各1份，37℃中烘干后研磨成粉末，用溴化鉀壓片法，放入傅立葉紅外光譜儀中測定其紅外光譜圖，對比分析.

1.2.5 水凝膠降解試驗

應(yīng)用CS／β－GP 5號配比的水凝膠進行降解試驗.將制備好的柱狀水凝膠稱重為W0，冷凍干燥后稱重為W1，將配置好的水凝膠分別置于PBS和含0.2mg／mL 溶菌酶［9］的PBS中，置于37℃中，每隔3d取出稱重得到濕重重量為W2，將取出的凝膠置于－80℃冰箱中1d后用冷凍干燥機抽干水分，稱取干重重量為W3.

表1 CS／GP／G／β－GP水凝膠比例組成Tab.1 Composition of CS／GP／G／β－GP hydrogel

1.2.6 水凝膠的體外藥物釋放研究

以牛血清蛋白（BSA）為模型藥物，進行水凝膠的體外藥物釋放研究.按上述方法制備成不同比例的凝膠，在凝膠溶液攪拌均勻后加入一定量的牛血清蛋白（BSA），繼續(xù)攪拌，直到混合均勻后緩慢倒入圓柱形模具中，置于37℃溫箱中4h使其徹底交聯(lián).將水凝膠放入80mL PBS中并用封口膜封閉，置于37℃以轉(zhuǎn)速100r／min使藥物緩慢釋放，每隔一段時間取出0.2mL溶液待測，同時向燒杯中加入等量的PBS.應(yīng)用BCA 蛋白濃度測定試劑盒，通過顯色反應(yīng)，測定蛋白質(zhì)濃度.

式（2）中，W 為待測樣品的載藥量（μg），CBSA（n）為t時間里第n 次測量時釋放到PBS中的BSA 濃度（μg／mL），CBSA（n－1）為第n－1次測量時釋放到PBS中的BSA 濃度（μg／mL），∑CBSA（n－1）為前n－1次測定的BSA 濃度之和.

1.2.7 水凝膠體外釋藥機制

本實驗采用Ritger－Peppas方程對不同比例水凝膠釋藥機制進行探討.將藥物前60%的累積釋放量及釋放時間代入公式（3）進行曲線擬合.

（3）式中，Mt為t時間的累計釋放量；M∞為極限時間總的累計釋放量，k為常數(shù)，與骨架結(jié)構(gòu)和幾何特性有關(guān)，隨藥物、處方組成及釋放條件的變化而變化，是表征藥物釋放速率大小的主要參數(shù).n 為擴散指數(shù)，用以表達藥物釋放機制，（1）當n＜0.45時，藥物釋放機制為Fickian擴散，是單純擴散控制的結(jié)果；（2）當0.45＜n＜1時，藥物的釋放機制為Non－Fickian轉(zhuǎn)運，是擴散和溶脹綜合作用的結(jié)果，為不規(guī)則轉(zhuǎn)運；（3）當n＞1時，藥物釋放機制為零級釋放或CaseⅡ轉(zhuǎn)運，為單純骨架溶蝕控制的結(jié)果.

1.2.8 統(tǒng)計學處理

圖1 凝膠時間的測定（n＝3）Fig.1 Determination of gel time（n＝3）

2 結(jié)果

2.1 凝膠時間的測定

由圖1 可見，殼聚糖水凝膠凝膠時間受到殼聚糖、β－甘油磷酸鈉濃度的影響.當殼聚糖濃度一定時，β－甘油磷酸鈉濃度的增加會使水凝膠在37℃的凝膠時間縮短（P＜0.05）.當β－甘油磷酸鈉濃度一定時，殼聚糖濃度的增加同樣會縮短水凝膠37℃的凝膠時間（P＜0.05）.其中，1號配比水凝膠凝膠時間最長，為（126±8.89）s；6號配比水凝膠凝膠時間最短，僅為（50±6.67）s，故該水凝膠可以滿足作為藥物載體快速成膠的要求.

2.2 掃描電鏡觀察

圖2為不同比例殼聚糖溫敏性水凝膠冷凍干燥后的電鏡分析圖.由圖2可見，本實驗所得殼聚糖水凝膠為多孔互通的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).當β－甘油磷酸鈉終濃度為12%，殼聚糖含量較低時，水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)較為疏松，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)大小不一，網(wǎng)孔完整性較差，網(wǎng)孔之間的相互貫通性較好.隨著殼聚糖濃度增加，水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)更為致密，網(wǎng)孔數(shù)量明顯減少，網(wǎng)孔完整性較好，但網(wǎng)孔之間的相互貫通性較差且網(wǎng)孔分布不均勻.當β－甘油磷酸鈉終濃度為16%，水凝膠內(nèi)部網(wǎng)孔分布較為均勻，殼聚糖含量較低時，網(wǎng)孔數(shù)量較少，網(wǎng)孔直徑較大，相互貫通性較差.隨著殼聚糖濃度增加，網(wǎng)孔直徑進一步縮小，網(wǎng)孔數(shù)量增加明顯且網(wǎng)孔之間相互貫通性較好.當殼聚糖濃度相同，β－甘油磷酸鈉濃度增加時，網(wǎng)孔縮小明顯，網(wǎng)孔完整性更好，水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加均一、致密.

2.3 FT－IR

圖2 不同比例水凝膠的電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM photos of different proportions of the hydrogel

圖3為殼聚糖水凝膠紅外光譜圖.由圖中CS曲線可見，3 359cm－1處為殼聚糖－OH伸縮振動吸收峰和－NH2伸縮振動吸收峰重疊導致的，1 647cm－1處為較強的酰胺Ⅰ吸收峰，1 589cm－1處為殼聚糖氨基特征吸收峰.由曲線CS 與CS／β－GP／G 對比可見，3 359cm－1處在CS／β－GP／G 中向低頻方向移動為3 276cm－1，說明殼聚糖與β－甘油磷酸鈉之間有配位鍵形成，由N—H 鍵減弱及其伸縮震動和彎曲振動的能量減弱導致的，而1 589cm－1處峰的消失說明兩組分之間形成了氫鍵配合物.在殼聚糖水凝膠中1 589cm－1處吸收峰減弱以及1 647cm－1處的增強表明殼聚糖與明膠分子上氨基和羥基間有共價鍵和氫鍵形成.由圖譜CS／β－GP／G與CS／β－GP／G／GP對比可見，1 638cm－1與1 541 cm－1處強度比值的進一步增加是由于殼聚糖和明膠分子上的伯胺基團與京尼平分子上的酯基形成的仲酰胺基團及質(zhì)子化胺的吸收峰導致的.紅外分析表明，實驗所用4種物質(zhì)之間成功交聯(lián)形成了水凝膠共聚物.

圖3 殼聚糖水凝膠紅外光譜圖Fig.3 FT－IR of CS hydrogel

2.4 水凝膠降解試驗

圖4為水凝膠在不同緩沖液中降解性能的結(jié)果.圖4（a）為水凝膠干重的質(zhì)量變化，由圖可見，在不含溶菌酶的緩沖液中，水凝膠質(zhì)量緩慢減少，表明在PBS中，殼聚糖水凝膠同樣會緩慢降解，但降解速率較慢且較為均一，第24d的剩余干重比值為（47.62±1.99）%.在含溶菌酶的緩沖液中，溶菌酶對殼聚糖的降解主要發(fā)生在降解過程的前期，水凝膠在0～6d 的降解速率明顯加快，第6d 的剩余干重比值為（60.61±1.50）%，而在第6～24d 內(nèi)降解速率減慢，第24d 的剩余干重比值為（44.26±1.83）%（P＜0.05）.圖4（b）為水凝膠濕重的變化，由圖4可見，在不含溶菌酶的緩沖液中，水凝膠質(zhì)量降低主要發(fā)生在第0～6d，第6d的剩余濕重比值為（46.07±2.02）%，6～24d內(nèi)降解速率減慢，第24d的剩余濕重比值為（16.87±0.94）%.在含溶菌酶的緩沖液中，0～6d內(nèi)水凝膠質(zhì)量下降相對于不含溶菌酶緩沖液中水凝膠質(zhì)量下降的不明顯，但水凝膠在3～9d內(nèi)持續(xù)下降，第9d的剩余濕重比值為（21.68±0.52）%，9～24d內(nèi)降解速率緩慢，第24d的剩余濕重比值為（14.25±1.21）%（P＜0.05）.

2.5 水凝膠體外藥物釋放

圖5為本實驗所得水凝膠對模型藥物BSA 的釋放曲線.由圖可見，不同比例的水凝膠樣品對藥物的釋放曲線都存在兩個階段，第一個階段為從開始釋放到25h之間，本階段藥物釋放速度較快，第二個階段為25h之后，釋放速度較為緩慢.由圖4可見，當β－甘油磷酸鈉含量為12%時（P＜0.05），殼聚糖濃度對藥物釋放速率影響明顯，殼聚糖含量為1.6%時，BSA 釋放速率最快，累計釋放率最高，為（89.56±0.99）%；其次為殼聚糖含量為2.0%時，累計釋放率為（85.73±1.01）%；殼聚糖含量為2.4%時，BSA 釋放速率最慢，累計釋放率最低，為（78.72±0.97）%.當β－甘油磷酸鈉含量為16%時（P＜0.05），殼聚糖濃度對藥物釋放速率的影響減弱，殼聚糖含量為1.6%時，BSA 釋放速率最快，累計釋放率最高，為（86.23±0.58）%；其次為殼聚糖含量為2.0%時，釋放速率較慢，釋放曲線良好，累計釋放率為（83.23±1.36）%；殼聚糖含量為2.4%時，釋放速率最慢，累計釋放率最低，為（76.01±1.1）%.由圖6可見，當殼聚糖濃度一定時，β－甘油磷酸鈉含量對釋放速率的影響逐漸減小，當殼聚糖濃度為1.6%時（P＜0.05），具有統(tǒng)計學差異，但當殼聚糖含量為2.0%，2.4%時（P＞0.05），不具有顯著的統(tǒng)計學差異.

圖5 β－甘油磷酸鈉分別為（a）12%和（b）16%時的BSA 累積釋放率（n＝3）Fig.5 The cumulative release rate whenβ－GP were（a）12%and（b）16%（n＝3）

圖6 殼聚糖分別為（a）1.6%；（b）2.0%；（c）2.4%時的BSA 累積釋放率Fig.6 The cumulative release rates when CS were（a）1.6%；（b）2.0%；（c）2.4%respectively

2.6 水凝膠體外釋放機制

將這6種載藥水凝膠前60%的累計釋放率和釋放時間用Ritger－Peppas方程進行曲線擬合，擬合結(jié)果見表2.

由表2可見，6種水凝膠n值均小于0.5，表明6種水凝膠的釋放機制均遵循Fickian轉(zhuǎn)運規(guī)則，為藥物擴散作用的結(jié)果.

表2 水凝膠體外釋放機制Tab.2 The release mechanism of the hydrogels in vitro

3 討論

粒細胞集落刺激因子［10］、粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子等［11］蛋白類藥物對急性放射性損傷的治療具有非常重要的意義，然而由于體內(nèi)酶的分解及新陳代謝作用，外源性蛋白類藥物給予機體后其半衰期較短［12］，增大劑量或頻繁注射常引起血清中藥物濃度大范圍變化甚至產(chǎn)生毒性作用.為增加藥物作用時間，本實驗以京尼平為交聯(lián)劑，交聯(lián)天然高分子材料殼聚糖／明膠／β－甘油磷酸鈉，制成新型溫敏性水凝膠作為藥物載體并對其性能進行了研究.

研究結(jié)果表明，本實驗所得水凝膠在37℃時成膠時間較短，50～126s之內(nèi)即可.殼聚糖和β－甘油磷酸鈉含量增加會降低凝膠時間，同時SEM 顯示水凝膠結(jié)構(gòu)變得更加致密，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)更加均一且表面結(jié)構(gòu)更加光滑.這種現(xiàn)象的出現(xiàn)主要是由于β－甘油磷酸鈉分子中存在大量的羥基和磷酸根負離子，可以奪走殼聚糖分子中氨基基團的質(zhì)子，使殼聚糖分子間的氫鍵作用增強，而殼聚糖與水分子之間的氫鍵作用減弱，同時可以通過靜電引力引發(fā)交聯(lián)作用.殼聚糖含量增加使氨基含量增加，使交聯(lián)的幾率增大，從而使其具有更快的溫度響應(yīng)性.通過FT－IR 對CS，CS／β－GP／G，CS／β－GP／G／GP 圖譜之間進行比較，證實實驗所得水凝膠為4種物質(zhì)相互交聯(lián)形成的產(chǎn)物.

水凝膠降解速率的增加是由于溶菌酶可以以內(nèi)切的方式作用于殼聚糖，切開殼聚糖分子鏈上的β－1，4糖苷鍵.由于殼聚糖降解作用增加，使水凝膠保持水分的能力下降，使水分的排出速度增加，持續(xù)的時間延長，由于水凝膠骨架結(jié)構(gòu)的存在，使最終干重及濕重基本相同.

藥物體外釋放結(jié)果顯示，0～25h快速釋放期可能是由于在水凝膠表面及表層網(wǎng)孔中存在的藥物在無阻力的情況下被快速釋放到緩沖液中形成的，緩慢釋放期是由于存在于水凝膠內(nèi)部及在制備過程中包埋在水凝膠內(nèi)的藥物在凝膠緩慢降解的過程中被釋放出來而形成的，其結(jié)果與SEM 結(jié)果基本吻合.

4 結(jié)語

本實驗應(yīng)用物理交聯(lián)技術(shù)制備了不同比例殼聚糖／京尼平／明膠／β－甘油磷酸鈉共混的溫敏性水凝膠，并對其性能進行了研究，結(jié)果表明，殼聚糖／京尼平／明膠／β－甘油磷酸鈉水凝膠最佳組合為體積質(zhì)量濃度殼聚糖2.0%，β－甘油磷酸鈉16%，京尼平0.1%，明膠0.6%.此比例水凝膠凝膠時間短，結(jié)構(gòu)均一，釋放速率平緩且最終釋放率較高.

［1］Pietro M，Chiara D M，Tommasina C，et al.Interpenetrating polymer networks polysaccharide hydrogels for drug delivery and tissue engineering［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65（9）：1172－1187.

［2］Ramesh N，Chandru K，Sekaran S，et al.A novel injectable temperature－sensitive zinc doped chitosan／βglycerophosphate hydrogel for bone tissue engineering ［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2013，54（3）：24－29.

［3］Yoo M K，Sung Y K，Lee Y M，et al.Effect of polyelectrolyte on the lower critical solution temperature of poly（N－isopropyl acrylamide）in the poly（NIPAAm－co－acrylic acid）hydrogel［J］.Polymer，2000，41（15）：5713－5719.

［4］陳美玲，岳 凌，魏召陽，等.單甲氧基乙二醇接枝殼聚糖溫敏性水凝膠的制備及其性能表征［J］.蘇州大學學報：醫(yī)學版，2011，31（1）：35－38.

［5］Rochelle W，Melissa C M，Christina B M，et al.Relationship between acrylamide reproductive and neurotoxicity in male rats［J］.Reproductive Toxicology，2000，14（2）：147－157.

［6］Aja A，Daisy M R，Ahmed A N，et al.Natural and Synthetic Biomedical Polymers［M］.Netherlands：Elsevier，2014：67－89.

［7］Li Cui，Jun Fang，Yi Guo，et al.Preparation and characterization of IPN hydrogels composed of chitosan and gelatin cross－linked by genipin［J］.Carbohydrate Polymers，2014，99（2）：31－38.

［8］Cheng Yung－Hsin，Yang Shu－Hua，Liu Chia－Ching，et al.Thermosensitive hydrogel made of ferulic acidgelatin and chitosan glycerophosphate［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92（2），1512－1519.

［9］Yi Hong，Song Haiqing，Gong Yihong，et al.Covalently crosslinked chitosan hydrogel：Properties of in vitro degradation and chondrocyte encapsulation［J］.Acta Biomaterialia，2007，3（1）：23－31.

［10］Vijay K S，Victoria L N，Thomas M S，et al.Colony－stimulating factors for the treatment of the hematopoietic component of the acute radiation syndrome（H－ARS）：A review［J］.Cytokine，2015，71（1）：22－37.

［11］Lopes M，Martin M.Medical management of the acute radiation syndrome［J］.ScienceDirect，2011，16（4）：138－146.

［12］Smith T J，Khatcheressian J，Lyman G H，et al.2006update of recommendations for the use of white blood cell growth factors：An evidence－based clinical practice guideline［J］.Clin Oncol，2006，24（19）：3187－3205.