煙曲霉Aspf3和Aspf4的表達純化與多克隆抗體的制備

高 巖 ，霍克克，季朝能，唐海平，徐萬祥，謝 毅，顧少華

（1.復旦大學 生命科學學院，遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2.上海市工業(yè)菌株工程技術研究中心，上海 200438；3.上海市計劃生育科學研究所，國家人口和計劃生育委員會重點實驗室，上海 200032）

侵襲性曲霉?。↖nvasive Aspergillosis，IA）具有50%～95%死亡率，大約80%的IA 由煙曲霉（Aspergillus fumigatus）感染引起，黃曲霉（Aspergillus flavus）約占15%～20%，少量的為黑曲霉（Aspergillus niger）和土曲霉（Aspergillus terreus）［1－2］.曲霉是條件致病菌，惡性血液病患者、造血干細胞和器官移植受體、慢性肺阻塞患者、危重病人、長期使用類固醇者和中性白細胞減少癥患者及艾滋病患者為易感人群［3－6］.IA 的早期診斷和抗真菌藥物的及時使用能大為提高患者的生存率［7］.

IA 的臨床診斷有3個標準：（1）確診標準（Proven Criteria）：組織病理學或無菌體液檢測所獲得的微生物學證據；（2）臨床診斷標準（Probable Criteria）：由宿主因素、臨床指征及微生物學標準支持；（3）擬診標準（Possible Criteria）：僅具備宿主因素、臨床指征支持，缺少微生物學證據［8］.然而，肺活檢通常由于病人冒風險而忌用，組織病理學方法約有20%的假陰性［9］，因此在臨床實踐中通常用第二種標準對患者進行曲霉感染風險評判.

在IA 的血清學診斷中常用半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）單抗檢測可疑血清樣本中半乳甘露聚糖的GM 方法［10］.GM 是曲霉菌細胞壁的多糖成分，隨著菌絲體的生長和孢子的萌發(fā)而進入宿主的血循環(huán)，成為診斷IA 的抗原標志物.在異基因造血干細胞移植IA 患者中，GM 血清檢測的靈敏度和特異性分別高達95%和98%［11］.然而，在實體器官移植受體、慢性肺阻塞和重癥監(jiān)護室IA 患者中，GM 血清檢測的靈敏度僅為40%～50%［4，12－14］；在這部分IA 患者中，中性白細胞清除GM，使GM 血清檢驗靈敏度顯著降低［15］.此外，使用β－內酰胺類抗生素、輸注血小板、腎衰竭和食物等因素會引起GM 血清檢驗假陽性結果［16－19］.

人體在感染曲霉菌過程中，針對特定蛋白抗原，會產生相應的抗體.用煙曲霉免疫原，制備重組蛋白和多克隆抗體，繼而用多克隆抗體對靶抗原進行B 細胞表位精細掃描，分析鑒定煙曲霉特異性表位和致病曲霉中的保守性表位，將免疫原性強的特異性和保守性表位組合構建嵌合肽，檢測相應的循環(huán)抗體，是診斷曲霉感染的一個方向.煙曲霉Asp f3為過氧化物酶體膜蛋白（Peroxysomal protein），Asp f4為功能未知蛋白，均為煙曲霉的主要免疫原［20－21］，且與致病曲霉中的同源蛋白高度保守.本研究制備煙曲霉Asp f3和Asp f4重組蛋白，免疫新西蘭白兔，得到多克隆抗體，為進一步表位鑒定、分析和研制診斷IA 多表位嵌合肽打下了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌E.coli BL21（DE3）和質粒pET－21（b＋）、pET－22（b＋）為本實驗室保存.

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶BamHⅠ－HF、SalⅠ－HF和T4DNA 連接酶購自New England Biolabs公司；6×His單克隆抗體、弗氏完全佐劑以及弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠、羊抗兔IgG 購自Santa Cruz Biotechnology公司.

1.1.3 實驗動物

成年雄性新西蘭大白兔10只，質量均約2kg，以及標準兔飼料均購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司.單只分籠飼養(yǎng)于上海市計劃生育科學研究所普通級家兔動物房內，室溫（20±2）℃，并保證良好的光照及通風條件.

1.2 方法

1.2.1 Asp f3和Asp f4的同源蛋白分析

根據BLAST及文獻閱讀結果，應用http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／和http：∥espript.ibcp.fr／ESPript／cgi－bin／ESPript.cgi這兩個網站的同源蛋白分析工具，進行煙曲霉Asp f3 和Asp f4分別與其黑曲霉、黃曲霉、土曲霉中同源蛋白的序列比對及分析.

1.2.2 Asp f3和Asp f4的表達與純化

1.2.2.1 原核表達載體pET－21（b）－Asp f3和pET－22（b）－Asp f4的構建

根據煙曲霉Af293菌株的Asp f3（NCBI accession No：XP＿747849）和Asp f4（NCBI accession No：XP＿749515）的蛋白序列，依據大腸桿菌密碼子偏好性，由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司全合成基因，分別從EcoRⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點克隆于pET－21（b＋）和pET－22（b＋），構建pET－21（b）－Asp f3和pET－22（b）－Asp f4重組質粒.其中，根據SignalP 軟件預測，Asp f4 的信號肽為1～14aa，故pET－22（b）－Asp f4重組質粒中，Asp f4的序列為15～322aa.

1.2.2.2 重組Asp f3和Asp f4表達與鑒定

將C端帶有6×His標簽的重組質粒pET－21（b）－Asp f3和pET－22（b）－Asp f4分別轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落于含50μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜.翌日，按照1∶50的比例將過夜菌轉接至新的LB 液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的工作濃度不變，37℃培養(yǎng)約2.5～3h（OD600為0.6～0.8）后，加入終濃度為1mmol／L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導重組蛋白表達，表達條件為37℃培養(yǎng)4h.誘導完成后，10 000r／min離心5min，收集菌體，用150μL 1×PBS緩沖液溶菌，并加入50μL 4×SDS－PAGE Loading Buffer混勻.15%SDS－PAGE 電泳及6×His單克隆抗體Western blot 鑒定蛋白表達結果.對確定有表達的菌株重新誘導培養(yǎng)，誘導完成后，10 000r／min離心5min，棄去培養(yǎng)基后用150μL 1×PBS緩沖液溶菌，對全菌蛋白超生破菌（超聲1s暫停1s，直至菌液澄清，冰上操作），10 000r／min，4℃離心20min分離上清和沉淀，同樣用150μL 1×PBS緩沖液溶解沉淀.按照“全菌－上清－沉淀”的順序上樣，進行15%SD－PAGE 電泳及6×His單克隆抗體Western blot鑒定蛋白表達結果，觀察目的蛋白在上清和沉淀中表達量的差異.

1.2.2.3 重組Asp f3和Asp f4蛋白的純化

選取表達量高的單克隆菌株，將保種菌接入50mL 含50μg／mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜.次日，按照1∶50的比例將菌液轉入500mL含50μg／mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，用1mmol／LIPTG 誘導4h.收集菌體，超聲破菌后離心取上清（條件與上述一致）.通過鎳柱親和層析純化上清中的目的蛋白.將純化后蛋白經過超濾、濃縮處理，用Bradford法估測純化后蛋白濃度.取純化蛋白進行SDS－PAGE電泳，用像素計算軟件估測純化蛋白的純度.純化后蛋白用于免疫新西蘭大白兔.

1.2.3 兔抗Asp f3和Asp f4蛋白多克隆抗體的制備、效價測定與特異性檢測

1.2.3.1 制備

免疫前收集對照雄性新西蘭大白兔耳緣靜脈血1～1.5mL用作陰性對照.重組蛋白用生理鹽水稀釋后與完全弗氏佐劑等體積混合，得到乳化混合液后對新西蘭大白兔進行后頸部皮下多點注射免疫，每個重組蛋白免疫4只兔子.初次免疫時，每只兔子注射1mg重組蛋白.3周后進行第一次加強免疫，用不完全弗氏佐劑與重組蛋白等體積混合乳化，每只兔子注射0.5mg重組蛋白.兩周后進行第二次加強免疫，方法與第一次相同.第二次加強免疫一周后于耳緣靜脈取血，對取得的抗血清進行ELISA 效價分析，抗體滴度高于1∶105后取血約70～80mL.將取得的血液置于37℃培養(yǎng)箱1h 后4 ℃過夜.然后4 ℃，8 000r／min離心20min，收集上清即抗血清.

1.2.3.2 效價測定

以純化后的Asp f3和Asp f4蛋白按1μg／孔包被酶標板，用免疫前血清作陰性對照，以收集的抗血清進行倍比稀釋（1∶103，1∶104，1∶2×104，1∶4×104，1∶8×104，1∶1.6×105，1∶3.2×105，1∶6.4×105，1∶1.28×106）后用作一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG 作二抗（1∶104稀釋），加入鄰苯二銨（OPD）底物反應液，37℃避光反應5min后加入反應終止液，測定各孔OD450值.

1.2.3.3 特異性檢測

在獲得抗血清之后，將抗血清與經超聲破碎后的E.coli BL21（DE3）菌體按比例混合（100mL搖過夜菌液離心后得到的菌體溶于1mL 1×PBS緩沖液中，超聲破菌后，與1mL 抗血清等體積混合），37℃孵育1.5h，12 000r／min離心20min后取上清.將誘導表達的全菌蛋白進行SDS－PAGE 電泳后，分別以吸附菌體后的抗血清及免疫前血清（作為陰性對照）作為一抗（1∶5×103稀釋），HRP 標記的羊抗兔IgG（1∶5×103稀釋）作為二抗，進行Western－blot檢測.

2 結果

2.1 Asp f3、Asp f4蛋白序列分析

Asp f3的BLAST 分析表明其與黃曲霉的同源蛋白：過氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxin，XP＿002375948）的一致度（Identity）為70%；與黑曲霉的同源蛋白：過氧化物氧化還原酶pmp20（Peroxiredoxin pmp20，XP＿001395908）的一致度為90%；與土曲霉的同源蛋白：類似過氧化物酶體膜蛋白（Hypothetical protein ATEG＿09752，XP＿001218374）的一致度為70%（圖1）.Asp f4的BLAST 分析表明其與黃曲霉的同源蛋白：變應原Asp F4樣蛋白（allergen Asp F4－like，XP＿002383433）的一致度為60%；與黑曲霉的同源蛋白：Asp f4（XP＿001391915）的一致度為62%；與土曲霉的同源蛋白：Asp f4（XP＿001218129）的一致度為60%（圖2）.

圖1 Asp f3與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉同源蛋白的序列比對Fig.1 An alignment of the Asp f3sequence and those of the homologous proteins

圖2 Asp f4與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉同源蛋白的序列比對Fig.2 An alignment of the Asp f4sequence and those of the homologous proteins

2.2 Asp f3、Asp f4蛋白的原核表達、純化與驗證

重組質粒pET－21（b）－Asp f3 和pET－22（b）－Asp f4 轉化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在1mmol／L IPTG、37℃的條件下誘導4h.破碎菌體后15%SDS－PAGE 檢測裂解液上清和沉淀中的蛋白質，分別以轉入pET－21（b＋）、pET－22（b＋）空載體的E.coli BL21（DE3）作為陰性對照.經SDS－PAGE電泳檢測顯示，圖3（a）中，在15ku至25ku之間約22ku處有明顯的蛋白表達條帶，與Asp f3的理論分子質量加上載體上氨基酸的分子質量總和約22ku相一致.且上清中的蛋白表達明顯高于沉淀.上清經鎳柱親和層析后得到純度約為98%、濃度約為15mg／mL的重組蛋白.

圖3 Asp f3和Asp f4重組蛋白表達及純化SDS－PAGE圖譜Fig.3 SDS－PAGE of expression and purification of Asp f3or Asp f4

圖3（b）中，表達的Asp f4 蛋白主條帶在SDSPAGE凝膠上顯示的相對分子質量約為40ku，略大于其理論相對分子質量與載體氨基酸之和35ku，但6×His單克隆抗體的免疫印跡鑒定結果表明PAGE凝膠上顯示的相對分子質量為40ku蛋白條帶是目的蛋白（圖4）.雖然蛋白大部分存在于沉淀中，但上清中蛋白量也達到了后續(xù)擴大表達純化的要求.上清經鎳柱親和層析，得到純度約為80%、濃度約為4mg／mL的重組蛋白.經過以His單克隆抗體為一抗，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠為二抗的Western blot驗證，結果表明上述特異性表達條帶及鎳柱親和層析蛋白條帶均分別為Asp f3和Asp f4重組蛋白的誘導表達條帶.

圖4 Asp f3和Asp f4蛋白表達的Western blot驗證Fig.4 Western blot of recombinant Asp f3and Asp f4

2.3 重組Asp f3、Asp f4蛋白多克隆抗體的制備及其特異性檢測

將純化好的Asp f3、Asp f4蛋白免疫新西蘭大白兔，以免疫前血清做為陰性對照.經3次免疫后取血樣，通過ELISA 實驗測定兔抗重組Asp f3、Asp f4蛋白抗血清效價.結果表明，分別免疫Asp f3和Asp f4的8只實驗兔的抗血清中特異性IgG 抗體滴度均在1.28×106以上（圖5），符合后續(xù)實驗要求.

圖5 兔抗Asp f3或Asp f4抗血清ELISAFig.5 ELISA of antiserum to Asp f3or Asp f4

取抗體滴度最高的抗Asp f3的4號兔的抗血清以及抗Asp f4的3號兔的抗血清進行進一步的吸附純化，以純化后的抗血清作為一抗，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）為二抗，對未純化目的蛋白進行Western bolt.結果表明，實驗獲得了高滴度、特異性較好的兔抗Asp f3和兔抗Asp f4蛋白多克隆抗體（圖6）.

3 討論

本研究構建了帶有6×His 標簽的重組質粒pET－21（b）－Asp f3 和pET－22（b）－Asp f4，在大腸桿菌中高效表達了目的蛋白.如圖3 所示，Asp f3 在SDS－PAGE凝膠上顯示的相對分子質量與其理論相對分子質量22ku相接近；Asp f4條帶在SDS－PAGE凝膠上顯示的相對分子質量大于其理論相對分子質量35ku，這可能與重組蛋白的氨基酸電荷組成情況有關，是基因工程表達目的蛋白常見的現象［22－24］.6×His單克隆抗體的免疫印跡結果顯示在22ku左右有清晰的條帶即Asp f3重組蛋白以及在35ku上方有清晰的條帶即Asp f4重組蛋白.如圖3（b）所示，兩個目的蛋白在破菌后上清中的表達量都比較高，因此可直接取上清進行鎳柱親和層析.純化后所得的蛋白用超濾的方法將緩沖液替換為Milli－Q 超純水以減少蛋白中的鹽分對后續(xù)免疫工作的影響，并進行濃縮.Asp f4蛋白在表達和純化后有一定程度的降解，降解可能發(fā)生在帶有His標簽的另一端即N 端.Asp f4蛋白的穩(wěn)定性較低，但由于以主條帶為主，可以用作抗血清的制備.經過新西蘭大白兔后頸部皮下多點注射，獲得了兔抗Asp f3和Asp f4蛋白的抗血清，并且經ELISA 實驗驗證其抗體效價符合后續(xù)實驗的要求.但是，由于Asp f3和Asp f4蛋白是借助于大腸桿菌系統進行表達的，因此本研究獲得的多克隆抗體中，難免會出現抗大腸桿菌本體蛋白的抗體，因此需要在獲得抗血清后進一步對其進行吸附處理，Western blot驗證其抗Asp f3和Asp f4特異性，以在進行表位鑒定時避免大腸桿菌本體蛋白產生的雜帶干擾.如圖6所示，本研究制備的多克隆抗體具有較好的抗Asp f3和Asp f4特異性，可以用作下一步的表位的鑒定.

本研究制備了高滴度兔抗Asp f3和Asp f4多克隆抗體.進一步擬用生物合成肽方法［26］鑒定Asp f3和Asp f4最小線性B細胞表位，分析其煙曲霉特異性及與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉保守性，構建檢測可疑血清樣本中相應抗體的多表位嵌合肽，以診斷煙曲霉特異性IA 和致病曲霉廣譜性IA.

圖6 兔抗重組Asp f3和Asp f4蛋白多克隆抗體特異性的Western blot驗證Fig.6 Western blot of specificity of antiserum to Asp f3and Asp f4

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