MYB家族轉(zhuǎn)錄因子OsMYB84通過ABA信號(hào)通路參與鹽脅迫響應(yīng)

呂 波，張文政，李春雨，明 鳳

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200433；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433）

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一.MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在C 端與DNA 結(jié)合域之間都具有一個(gè)富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活功能域，根據(jù)所包含的MYB 結(jié)構(gòu)域的序列和數(shù)量，植物中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子可以分為1R－MYB、3R－MYB、4R－MYB以及R2R3－MYB共4大類［1］.已在多種植物中發(fā)現(xiàn)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，水稻和擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有198個(gè)和183個(gè)MYB家族的成員［2］.

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各種植物體中，其具有非常廣譜的作用功能，如在參與植株形態(tài)建成以及花器官發(fā)育［3］和葉片形態(tài)的建成［4］；參與了植物次生代謝過程［5］，參與激素調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［6－7］，植物的防御反應(yīng)以及在非生物逆境中發(fā)揮作用［8］.大量的證據(jù)表明，在高溫［9］、低溫［10］、干旱［11］、高鹽［12］、氮缺失［13］等非生物脅迫應(yīng)答過程中，MYB轉(zhuǎn)錄因子也起著調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)生物防御反應(yīng)的功能.

擬南芥中的AtMYB84（又被稱為AtRAX3），其突變體最早在1998年就有報(bào)道［14］，但直到2006年Muller等［15］才發(fā)現(xiàn)當(dāng)AtMYB84基因與其他兩個(gè)基因AtMYB37（RAX1），AtMYB38（RAX2）共突變時(shí)才表現(xiàn)出對(duì)擬南芥?zhèn)壬稚M織發(fā)育的影響，因此將這三個(gè)基因命名為RAX（Regulators of Axillarymeristems）基因.

通常根據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫過程中是否依賴脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑可將其分為兩類：一類是和ABA 信號(hào)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)子區(qū)域常含有ABRE 一致序列；另一類是獨(dú)立于ABA 信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，其啟動(dòng)子中含有如CRT／DRE等核心元件［8］.

水稻是人類的主要糧食作物之一，優(yōu)良品種選育是提高水稻產(chǎn)量的主要方式之一.矮稈品種的選育和推廣是上世紀(jì)水稻育種的最主要成就之一.水稻的矮生性是指成熟期水稻植株高度較正常植株矮的遺傳特性.研究表明，這些矮稈或半矮稈水稻的產(chǎn)量一般比高桿品種要高20%～30%以上［16］.因此，矮稈基因的挖掘、鑒定和利用對(duì)于水稻增產(chǎn)的研究是有重要意義的.

植物生長和發(fā)育受到多種環(huán)境因素的影響，其中，鹽脅迫是環(huán)境脅迫中影響植物生長和農(nóng)業(yè)性狀的最主要因素之一.現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，土壤鹽漬化、海水倒灌等因素影響著水稻耕地面積，約有20%的世界耕地面積受到鹽堿化的影響［17］.Liu等［18］研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)水通道蛋白基因OsPIP1；1過表達(dá)可以提高水稻對(duì)高鹽脅迫的抗性、根系導(dǎo)水率以及種子產(chǎn)量.因此，研究高鹽抗性基因，對(duì)水稻生長發(fā)育分子機(jī)理的探討和提升農(nóng)業(yè)性狀有重要意義.

水稻中MYB84同源基因的分離以及功能研究還未見報(bào)道，因此本研究通過克隆OsMYB84基因，以轉(zhuǎn)基因日本晴水稻為材料，研究OsMYB84轉(zhuǎn)基因水稻正常生長表型以及在高鹽脅迫下的表型，為探索水稻矮稈，抗逆性狀基因以及其作用機(jī)制提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

水稻日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）在培養(yǎng)箱（GXZ－380D，Ningbo，China）中培養(yǎng)，生長條件為光周期16 h／8 h（Light／Dark），28 ℃.根癌農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium tumefaciens EHA105，E.coli DH5α均購自TaKaRa公司.pSPT19載體購自Roche，pCR－Blunt、pCAMBIA－1304（含CaMV35S組成型啟動(dòng)子）、pC35S：GFP均由本實(shí)驗(yàn)室保存.PCR 引物、限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純.水稻培養(yǎng)液配方參照Yoshida等［19］的方法.

1.2 方法

1.2.1 水稻OsMYB84基因的獲得

用TRIzol提取水稻野生型植株的總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA 第一條鏈，目的基因OsMYB84 PCR 引物見表1，利用此引物克隆OsMYB84的克隆全長OsMYB84，共1 209bp，回收PCR 產(chǎn)物構(gòu)建到pCRBlunt載體中；利用引物OsMYB84Enyzme和pCRBlunt－OsMYB84克隆全長OsMYB84并加入酶切位點(diǎn)BglⅡ和SpeⅠ，回收PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，得到含有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因片段，將其連入同樣雙酶切的pCAMBIA1304載體中，構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105.PCR 的程序?yàn)椋?4℃4min；94℃40s，50℃40s，68℃90s；68℃10min，35個(gè)循環(huán).

1.2.2 OsMYB84的序列比對(duì)和聚類分析

根據(jù)OsMYB84的DNA 序列，通過NCBI數(shù)據(jù)推測(cè)出相應(yīng)的氨基酸序列，在數(shù)據(jù)庫中檢索不同物種中R2R3－MYB亞家族的同源基因，用Clustal X 軟件進(jìn)行同源基因的序列比對(duì)，通過Neighbour－joining法對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)化分析，并利用MEGA4軟件繪制了進(jìn)化樹.

1.2.3 亞細(xì)胞定位

采用GFP標(biāo)簽技術(shù)，通過BglⅡ和SpeⅠ雙酶切得到的目的基因片段連入植物表達(dá)載體pC35S：GFP中，構(gòu)建OsMYB84與GFP融合蛋白表達(dá)載體，通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，研究目的蛋白OsMYB84的亞細(xì)胞定位.

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

將已構(gòu)建的包含35S：OsMYB84過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1304－OsMYB84，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻.以農(nóng)桿菌菌株EHA105為載體，侵染誘導(dǎo)的日本晴水稻愈傷組織，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、誘導(dǎo)分化和生根，獲得轉(zhuǎn)基因苗，得到的子代經(jīng)育種篩選獲得轉(zhuǎn)基因水稻純合體.

1.2.5 OsMYB84在水稻不同器官中的表達(dá)譜

用TRIzol提取水稻不同發(fā)育時(shí)期的葉片以及根、莖與花序的總RNA，并用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa）分解混入的DNA 并發(fā)轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect RealTime）（TaKaRa Code：DRR081）進(jìn)行qRT－PCR 反應(yīng)檢測(cè)OsMYB84的mRNA 水平.目的基因OsMYB84和內(nèi)參基因OsACTIN 的qRT－PCR 引物見表1.Real－Time PCR 程序?yàn)?5 ℃3 min；94℃10s，55℃20s，40個(gè)循環(huán).

1.2.6 OsMYB84在不同激素和逆境脅迫處理下的表達(dá)譜

以野生型水稻發(fā)芽后兩周，分別選用10%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和低溫4 ℃處理1～4d；200μmol／L NaCl、100μmol／L 茉莉酸（jasmonate，JA）處理1d；10μmol／L 激動(dòng)素（kinetin，KT）、10μmol／L細(xì) 胞 分 裂 素（6－benzyladenine，6－BA）、10 μmol／L 生 長 素（indoleacetic acid，IAA）、5μmol／L赤霉素（gibberellin，GA）處理1d；50μmol／L 脫落酸（abscisic acid，ABA）處理2～24h，按照1.2.5的方法檢測(cè)OsMYB84的表達(dá)量.

1.2.7 原位雜交

選取OsMYB84mRNA 的308bp的高特異性片段為探針，以克隆的OsMYB84片段為模板，設(shè)計(jì)原味雜交探針引物（表1），回收PCR 片段，EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后連入同樣雙酶切的pSPT19載體.探針制備方法參照Roche DIG RNA labeling Kit（SP6／T7）.選取水稻根、芽以及不同發(fā)育時(shí)期的花，4%多聚甲醛固定，參照Wang等［20］方法進(jìn)行脫水包埋、切片、雜交.

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的RNA 表達(dá)水平鑒定

以兩周齡的水稻葉片為材料，按照1.2.5的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)量.

1.2.9 轉(zhuǎn)基因植株苗期耐鹽性鑒定

將OsMYB84過表達(dá)株系和野生型催芽后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中正常生長兩周，兩周后轉(zhuǎn)移至添加200mmol／L NaCl（參照文獻(xiàn)［10］）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)；15h后取部分植株測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系與野生型在兩種培養(yǎng)條件下的葉片的電導(dǎo)率（電導(dǎo)率儀：雷磁DDS－307），剩余植株恢復(fù)培養(yǎng)；恢復(fù)培養(yǎng)2d后測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的莖、根以及整株鮮重，并與對(duì)照組比較取相對(duì)值為相對(duì)莖鮮重（Relative Shoot Weight，RSW）、相對(duì)根鮮重（Relative Root Weight，RRW）以及相對(duì)整株鮮重（Relative Fresh Weight，RFW）.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物＊Tab.1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 OsMYB84基因的克隆、序列分析和亞細(xì)胞定位

通過對(duì)應(yīng)的擬南芥的AtMYB84進(jìn)行生物信息學(xué)分析與基因文庫中比對(duì)與搜索，克隆水稻中與擬南芥的AtMYB84 最為相似的基因（80%相似性），命名為OsMYB84（NM＿001057941.1），該基因全長1 209bp，開放閱讀框?yàn)?66bp，編碼321 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量35.35ku.同源序列比對(duì)分析表明OsMYB84基因含有R2和R3保守的3個(gè)色氨酸區(qū)域（圖1（a）），屬于R2R3－MYB家族.

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的不同物種R2R3－MYB 家族成員序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)OsMYB84與其他MYB家族基因一樣具有保守的R2R3結(jié)構(gòu)域，聚類分析顯示OsMYB84除了與AtMYB84基因關(guān)系較近外，還與GmMYB161、AtRAX2、AtMYB37、AtMYB96 等基因關(guān)系也相近（圖1（b）），其中，AtMYB84、AtRAX2、AtMYB37參與擬南芥?zhèn)壬稚M織的起始［15］，而AtMYB96 參與擬南芥在干旱［21－23］和冷脅迫［21］下的響應(yīng)，所以推測(cè)OsMYB84與這些基因功能最為相近.

根據(jù)全長cDNA 推測(cè)的OsMYB84蛋白，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)含有潛在的核定位信號(hào).為了研究OsMYB84蛋白的亞細(xì)胞定位，將去掉終止密碼子的OsMYB84編碼框鏈接在綠色熒光蛋白GFP的N端，構(gòu)建pOsMYB84－GFP融合蛋白表達(dá)載體，在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá).在僅轉(zhuǎn)化GFP的對(duì)照洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中（圖1（c）1～3）；而融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光集中分布在細(xì)胞核中（圖1（c）4～6）.這些結(jié)果說明OsMYB84蛋白屬于核定位蛋白.

2.2 OsMYB84在水稻不同器官中以及不同激素和逆境脅迫處理下的表達(dá)模式分析

為了解OsMYB84基因在水稻不同器官中的表達(dá)定位，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的葉片以及其他器官如根、莖與花序取樣，進(jìn)行Real－Time RNA 水平分析.結(jié)果表明OsMYB84基因?yàn)榻M成型表達(dá)（圖2（a）），但在各器官之間表達(dá)量有很大差異：在莖中表達(dá)量最高，莖、幼葉、成熟葉、老葉之間的表達(dá)量沒有明顯差異，根中表達(dá)量相對(duì)較少，花中表達(dá)量最少.

圖1 （a）OsMYB84基因序列比對(duì)，（b）進(jìn)化分析和（c）亞細(xì)胞定位Fig.1 （a）Amino acids sequence alignment，（b）phylogenetic analysis and（c）subcellular localization of OsMYB84

為了解OsMYB84基因?qū)Ψ巧锩{迫和外源植物激素處理的表達(dá)特性，對(duì)野生型日本晴水稻發(fā)芽后14d的幼苗進(jìn)行了生長素（IAA）、激動(dòng)素（KT）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（6－BA）、聚乙二醇（PEG）、高鹽以及低溫等處理.利用Real－Time PCR 的方法檢測(cè)不同激素和脅迫處理下OsMYB84表達(dá)量的變化.在ABA 處理6h后，OsMYB84表達(dá)水平迅速提高，隨著處理時(shí)間的延長，表達(dá)量隨之上升，到12h表達(dá)量達(dá)到最大值，而到24h時(shí)，OsMYB84表達(dá)量與對(duì)照并沒有顯著差異（圖2（b，c））.此外，OsMYB84的表達(dá)還受到6－BA、PEG、NaCl誘導(dǎo).PEG 模擬干旱處理1d時(shí)OsMYB84表達(dá)量與對(duì)照組相比并沒有顯著差異，到4d時(shí)表達(dá)水平變高；鹽脅迫處理1d時(shí)OsMYB84就開始表達(dá)，到4d時(shí)與對(duì)照組差異更顯著（圖2（d））.上述研究結(jié)果表明，OsMYB84基因受到ABA、高鹽脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)，也受到干旱誘導(dǎo)的微弱表達(dá)，暗示著OsMYB84在應(yīng)答高鹽、干旱脅迫時(shí)可能是依賴于ABA 途徑.

圖2 OsMYB84在水稻（a）不同器官、（b）不同激素、（c）激素ABA 不同時(shí)間段和（d）逆境脅迫處理下的表達(dá)模式Fig.2 The OsMYB84expression pattern（a）in various organs of rice，（b）under different hormones treatment，（c）ABA treatment over different times，（d）different abiotic stresses

2.3 OsMYB84基因組織水平的表達(dá)模式分析

因器官表達(dá)譜（圖2（a））說明OsMYB84表達(dá)的遍在特性，為進(jìn)一步確定目標(biāo)基因在不同組織器官中的具體定位，通過序列同源性分析，設(shè)計(jì)OsMYB84高特異片段為原位探針，對(duì)水稻不同花發(fā)育時(shí)期、根、芽進(jìn)行了原位雜交.結(jié)果顯示OsMYB84在穎花原基（圖3（a，b））、小穗（圖3（c，d））、藥室（圖3（e，f））與花粉（圖3（h））中高度表達(dá)，這些結(jié)果暗示OsMYB84可能參與花粉發(fā)育.同時(shí)，該基因在葉基部葉枕（圖3（i））和根原基高表達(dá)（圖3（j）），也預(yù)示著OsMYB84可能參與細(xì)胞分裂分化.

圖3 OsMYB84在不同組織的原位分析Fig.3 In situ hybridization analysis of OsMYB84in various tissues

2.4 過表達(dá)OsMYB84基因的水稻株系株高變矮

由于OsMYB84基因在不同器官中的表達(dá)差異，為深入了解OsMYB84 基因?qū)λ景l(fā)育的影響，將OsMYB84基因的編碼框連入pCAMBIA1304載體，使之在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá).利用real－time PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻純合體株系中的OsMYB84的表達(dá)水平（圖4（a）），結(jié)果顯示OX1、OX3、OX4轉(zhuǎn)基因株系中目的基因表達(dá)量高于野生型（WT）.通過對(duì)28℃光照16h／黑暗8h培養(yǎng)兩周齡的轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型（WT）的株高分析測(cè)量（圖4（b，c）），結(jié)果表明正常培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)基因水稻株高要明顯比野生型矮.

圖4 OsMYB84轉(zhuǎn)基因水稻的（a）RNA 水平鑒定，（b）株高表型及（c）株高分析Fig.4 （a）RNA level identification，（b）the height phenotype and（c）measurement of wild type and OsMYB84transgenic rice

2.5 過表達(dá)OsMYB84基因的水稻提高了對(duì)高鹽脅迫的耐性

因OsMYB84受到高鹽誘導(dǎo)，推測(cè)其參與高鹽脅迫下的水稻逆境的應(yīng)答反應(yīng)，在逆境應(yīng)答中起重要的調(diào)控作用.因此，通過對(duì)正常培養(yǎng)兩周齡的轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型植株分別放至正常培養(yǎng)液以及添加200mmol／L NaCl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，正常培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)基因和野生型水稻葉片都沒有發(fā)生變黃卷曲現(xiàn)象，而NaCl處理的野生型水稻葉片相較于轉(zhuǎn)基因水稻卷曲黃化更明顯，這種黃化現(xiàn)象在恢復(fù)培養(yǎng)后越加明顯（圖5（a））.

圖5 OsMYB84轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型水稻幼苗的高鹽抗性Fig.5 High salinity tolerance of wild type and OsMYB84transgenic rice OX1at the vegetative stage

鹽處理15h后測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系與野生型在兩種培養(yǎng)條件下的葉片的電導(dǎo)率（圖5（b）），轉(zhuǎn)基因株系的電導(dǎo)率顯著低于野生型.并將NaCl處理的幼苗用正常培養(yǎng)液恢復(fù)培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)2d后，測(cè)量轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的莖、根以及整株鮮重，并與對(duì)照組比較取相對(duì)值（圖5（c）），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻相對(duì)莖鮮重顯著高于野生型，表明OsMYB84 轉(zhuǎn)基因植株受高濃度鹽脅迫的損傷比野生型小.這些結(jié)果說明OsMYB84過表達(dá)能夠顯著提高苗期水稻對(duì)高鹽脅迫的耐受能力.

2.6 過表達(dá)OsMYB84基因的水稻對(duì)激素ABA表現(xiàn)敏感

由于OsMYB84受到激素ABA 誘導(dǎo)高表達(dá)，推測(cè)其影響了水稻對(duì)激素ABA 的敏感性.因此，對(duì)萌發(fā)期轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了ABA 處理實(shí)驗(yàn)，以正常MS培養(yǎng)基為對(duì)照，選取3μmol／L ABA 為添加處理激素，檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因水稻在ABA 處理下的發(fā)芽情況（圖6（a）），并測(cè)定每天的發(fā)芽率（圖6（c））.在添加ABA 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因水稻的種子萌發(fā)受到顯著抑制，而無論是否添加ABA，野生型種子的萌發(fā)卻無明顯抑制現(xiàn)象.同時(shí)分析了水稻發(fā)芽8d后的生長勢(shì)情況（圖6（b，d）），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系的生長受到ABA 抑制，相對(duì)株高顯著低于野生型（圖6（a，b，d））.這些結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)ABA 更敏感.

圖6 OsMYB84轉(zhuǎn)基因株系OX1與野生型水稻在3μmol／L ABA 處理下的種子萌發(fā)情況Fig.6 Seed germination of wild type and OsMYB84transgenic rice OX1under treatment of 3μmol／L ABA

3 討論

3.1 OsMYB84屬于R2R3－MYB亞家族，定位于細(xì)胞核內(nèi)

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子包含很多基因，功能廣泛，參與植物生長發(fā)育的各個(gè)過程.本研究從水稻中克隆了一個(gè)與擬南芥AtMYB84（At3g49690）高度同源的新基因OsMYB84（Os03g0771100），通過同源比對(duì)該基因具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，R2 和R3，得出OsMYB84 屬于R2R3－MYB 亞家族.聚類分析顯示OsMYB84與GmMYB84、AtMYB84同源性最高.亞細(xì)胞定位結(jié)果表明OsMYB84屬于核定位蛋白.

3.2 OsMYB84可能通過ABA 信號(hào)通路參與水稻耐鹽響應(yīng)

根據(jù)Nakashima等的研究，當(dāng)植物受到高鹽等滲透脅迫時(shí)，除了啟動(dòng)CBF 和DREB 類調(diào)節(jié)子的表達(dá)，還會(huì)啟動(dòng)表達(dá)多種激素ABA 合成基因，如ZEP、NCED 等，從而大量積累ABA，并且通過含有ABA響應(yīng)元件ABRE的調(diào)節(jié)因子啟動(dòng)下游基因表達(dá)［25］.而MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫過程中根據(jù)是否依賴ABA 信號(hào)途徑可將其分為依賴于ABA 和獨(dú)立于ABA 信號(hào)通路兩類［8］.OsMYB84脅迫和激素表達(dá)譜分析結(jié)果表明，OsMYB84受到NaCl和ABA 的顯著誘導(dǎo).200mmol／L NaCl苗期處理和3μM ABA 萌發(fā)實(shí)驗(yàn)分別說明OsMYB84 參與了水稻耐鹽響應(yīng)以及ABA 信號(hào)通路.另外，我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：∥www.dna.affrc.go.jp／PLACE／）預(yù)測(cè)OsMYB84基因啟動(dòng)中的順式元件，發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子中含有一個(gè)ABA 響應(yīng)元件ABRELATERD1.因此，我們推測(cè)OsMYB84可能通過ABA 信號(hào)通路參與水稻耐鹽響應(yīng).

3.3 OsMYB84基因其他功能的探索

葉枕是在禾本科植物中，在葉片、葉鞘連接處的外側(cè)，具有決定葉傾角發(fā)育，影響水稻株高的功能［24］.擬南芥中與OsMYB84最為同源的基因AtMYB84基因，當(dāng)其與其他兩個(gè)基因AtMYB37、AtMYB38共突變時(shí)葉腋發(fā)育受到抑制［15］，也與側(cè)枝發(fā)育相關(guān).OsMYB84器官表達(dá)譜結(jié)果表明OsMYB84在水稻葉片和根部高表達(dá)，原味雜交結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證OsMYB84在葉片葉枕部位高表達(dá).同時(shí)，我們?cè)讷@得OsMYB84轉(zhuǎn)基因水稻的基礎(chǔ)上，比較了OsMYB84過表達(dá)與野生型水稻的株高表型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)水稻的株高要明顯比野生型矮.這些結(jié)果說明OsMYB84參與了水稻生長，且有可能與葉枕發(fā)育有關(guān).但是，OsMYB84參與株高發(fā)育的具體機(jī)制，尚需更多的實(shí)驗(yàn)探索.

根系生長是多種植物激素，如生長素IAA、細(xì)胞分裂素CK 等調(diào)控的結(jié)果［26］.在根系發(fā)育中，細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)植物根系生長并抑制側(cè)根和冠根的起始［27］.OsMYB84 激素表達(dá)譜分析結(jié)果表明，OsMYB84受到6－BA 的誘導(dǎo)，同時(shí)器官表達(dá)譜和原味雜交的結(jié)果表明此基因在根系中高表達(dá)，這些結(jié)果說明OsMYB84基因極有可能參與了水稻根系發(fā)育，而且與細(xì)胞分裂素有關(guān).

根據(jù)Preston等的研究結(jié)果，MYB家族成員AtMYB32調(diào)控?cái)M南芥花粉的正常發(fā)育［28］；Baumann等也發(fā)現(xiàn)AtMYB16可以調(diào)控細(xì)胞和花瓣形態(tài)的建成［29］.OsMYB84器官表達(dá)譜和原位雜交結(jié)果表明，此基因在小穗、藥室與花粉中高度表達(dá)，說明OsMYB84也有可能參與了花器官形態(tài)建成和花粉發(fā)育過程，但具體的功能以及調(diào)控機(jī)制尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

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