脫除天然橡膠膠乳和手套中的蛋白質(zhì)

王進(jìn)文 編譯

（西北橡膠塑料研究設(shè)計(jì)院有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712023）

脫除天然橡膠膠乳和手套中的蛋白質(zhì)

王進(jìn)文 編譯

（西北橡膠塑料研究設(shè)計(jì)院有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712023）

采用漂洗和脫蛋白方法去除了天然橡膠中的蛋白質(zhì)。對(duì)市售天然橡膠手套進(jìn)行了漂洗處理，用尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）和丙酮脫除工業(yè)高氨膠乳（HANR）中的蛋白質(zhì)。采用經(jīng)改進(jìn)的Lowry方法和Kjeldahl方法測(cè)定了橡膠的可抽提蛋白質(zhì)含量和氮含量。經(jīng)聚焦離子束掃描電鏡（FIB/SEM）觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)漂洗后，天然橡膠手套中非橡膠成分的納米基體消失，有效降低了HANR中的可抽提蛋白質(zhì)含量和氮含量。結(jié)果表明，尿素、SDS和丙酮并用可完全脫除膠乳中的蛋白質(zhì)。

天然橡膠；膠乳；手套；蛋白質(zhì)；聚焦離子束掃描電鏡（FIB/SEM）

0 前言

過(guò)去30年里，人們開(kāi)發(fā)了多種脫除天然橡膠中蛋白質(zhì)的方法：酶脫蛋白、尿素脫蛋白、十二烷基硫酸鈉（SDS）脫蛋白，以及熱水漂洗等。其中尿素和熱水漂洗兩種方法是最受重視的，其可制備低蛋白天然橡膠和無(wú)蛋白天然橡膠，可以滿足美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）的要求。采用脫蛋白方法或漂洗處理后，天然橡膠就可用于醫(yī)用產(chǎn)品、衛(wèi)生材料和制品，如手術(shù)手套、牙醫(yī)手套、衛(wèi)生手套、導(dǎo)尿管、醫(yī)用氣球、矯形橡膠帶、粘合膏、奶瓶奶嘴、醫(yī)用冰袋，以及烹飪手套、衣服松緊帶、化妝棉粉撲、橡膠墊等產(chǎn)品。因此，低蛋白天然橡膠和無(wú)蛋白天然橡膠可被用于一些新領(lǐng)域或以前不能使用的領(lǐng)域。

以前在分析天然橡膠結(jié)構(gòu)時(shí)，我們研究了尿素脫蛋白質(zhì)方法。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不是化學(xué)鍵合在天然橡膠上的蛋白質(zhì)，尿素可以有效地使膠粒表面上的蛋白質(zhì)變性。這些研究結(jié)果使我們?cè)谔烊幌鹉z脫蛋白質(zhì)方面取得了技術(shù)突破；不再需要水解酶使天然橡膠中的蛋白質(zhì)變性。因此，與水解酶脫蛋白質(zhì)方法相比，用尿素脫蛋白質(zhì)具有顯著優(yōu)勢(shì)。人們可以使用各種變性劑脫蛋白質(zhì)，縮短處理時(shí)間。例如，我們將水解酶脫蛋白質(zhì)的處理時(shí)間≥24 h縮短到≤10 min尿素脫蛋白質(zhì)處理時(shí)間。此外，我們將天然橡膠的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量從約0.40%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）降低到很低的水平。實(shí)際上，用尿素處理后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量低于0.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和1.0 mg/g 橡膠；而采用水解酶脫蛋白后，此二值分別為0.02%和3.2 mg/g橡膠。尿素脫蛋白質(zhì)天然橡膠的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量顯著低于水解酶脫蛋白質(zhì)天然橡膠?，F(xiàn)在，我們可以制備無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠，經(jīng)3次離心處理后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量低于0.000%和0.0 mg/g橡膠。相比之下，經(jīng)漂洗后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量相當(dāng)高，大于0.10%和50 mg/g橡膠。

本研究中，我們采用漂洗方法將可抽提蛋白質(zhì)的含量降低到與無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠接近的水平。采用經(jīng)改進(jìn)的Lowry方法（ISO 12243：2003）測(cè)定可抽提蛋白質(zhì)含量和氮含量。用聚焦離子束/掃描電鏡（FIB-SEM ）觀察了形態(tài)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試樣和試劑

本研究所用天然橡膠樣品是工業(yè)高氨膠乳（HANR，馬來(lái)西亞Golden hope公司產(chǎn)品），以及市售天然橡膠手套A和手套B。HANR膠乳的總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)和干膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為62.1%和60.7%。十二烷基硫酸鈉（SDS）是日本Kishida有限公司產(chǎn)品。硫酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鉀、硫酸銅、硒、25%（w/v）戊二醛溶液和四氧化鋨（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%）水溶液是日本Nacalai Tesque公司產(chǎn)品。其他試劑是分析純。

1.2 天然橡膠的純化

用0.1%的尿素、1.0%的SDS和0.025%的丙酮在室溫下處理HANR膠乳，脫除蛋白質(zhì)。乳脂部分重新分散在含有1.0% SDS和0.025%丙酮的水溶液中，制成DRC為30%的膠乳，之后離心沖洗2次。離心分離橡膠，用甲醇凝聚，再在室溫、減壓條件下干燥至恒重。將手套A（1 g）用50 ml水在各種條件下漂洗6 h 。本研究采用的溫度和pH為：40 ℃下1～10，20～100 ℃下5.5。手套A在50 ℃及減壓條件下干燥1周。

1.3 測(cè)定

按馬來(lái)西亞橡膠研究所（RRIM）試驗(yàn)方法B7所述Kjeldahl方法測(cè)定橡膠中的氮含量。橡膠試樣與催化劑（硫酸鉀∶硫酸銅∶硒的質(zhì)量比為1：2：1）的混合物用濃硫酸溶解。將所得溶液蒸餾，餾分用0.005 mol/L 的硫酸滴定，甲基紅作指示劑。

通過(guò)DC蛋白質(zhì)試驗(yàn)測(cè)定橡膠試樣中的可抽提蛋白質(zhì)含量。尺寸為2 cm×2 cm的橡膠試樣用磷酸緩沖液（1/15 mol/L， pH=7）抽提，比例為1 g橡膠/5 ml磷酸緩沖液。抽提時(shí)在40℃下連續(xù)攪拌6 h。之后過(guò)濾試樣，用Bio-Red DC蛋白質(zhì)分析裝置，以牛血清丙種球蛋白（BGG）作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定沉清液中的蛋白質(zhì)含量。

用透射電子顯微鏡（JEOL TEM-2100）觀察橡膠試樣的形態(tài)，加速電壓為200 kV。用于TEM觀察的超薄切片，用超薄切片機(jī)在低于試樣玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（約-80 ℃）下切取。切片厚度約為100 nm，用磷鎢酸（PTA）在室溫下染色10 min。

塊狀橡膠試樣在室溫25%戊二醛水溶液中浸泡12 h ，之后用蒸餾水沖洗1 h。最后用4% OSO4水溶液在室溫下染色48 h。用SII Nano Technology SMI-3050SE進(jìn)行FIB-SEM觀察。為了防止處理過(guò)程中表面彎曲，在試樣表面沉積了一薄層碳。鎵離子束在30 kV的加速電壓下以30 nm的間隔蝕刻表面，制備斷面。在2 kV加速電壓下對(duì)斷面進(jìn)行SEM觀察。由于斷面處于掃描電子顯微鏡（SEM）鏡頭的對(duì)角位，所以對(duì)所得SEM圖像進(jìn)行了校正。

2 結(jié)果與討論

表1示出了天然橡膠（HANR）和脫蛋白質(zhì)天然橡膠中的氮含量，其中A代表丙酮，0.025代表丙酮的含量（0.025%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），丙酮添加到膠乳中。用尿素和SDS處理1 h，再離心分離2次后，天然橡膠中的氮含量從0.279% 降到0.021%，可抽提蛋白質(zhì)含量從115.2 μg/g橡膠下降到3.2 μg/g橡膠。脫蛋白質(zhì)天然橡膠（DPNR）的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量與酶解脫蛋白質(zhì)天然橡膠的非常類似（膠乳用水解酶和SDS處理24 h以上，之后離心分離2次）。處理時(shí)間大幅縮短，這是因?yàn)椴捎媚蛩刈鳛樽冃詣?，未使用水解酶。例如，尿素使蛋白質(zhì)變性時(shí)，由于氫鍵斷裂使高級(jí)結(jié)構(gòu)變形；而采用水解酶時(shí)，由于水解而產(chǎn)生?；饔?。

膠乳用尿素、丙酮和SDS處理1 h，再離心分離2次后，氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量進(jìn)一步降低到0.000%和0.0 μg/g橡膠。換言之，用尿素、丙酮和SDS將天然橡膠中的蛋白質(zhì)完全除去了。這可能是由于丙酮是油脂和脂肪酸的良溶劑（圖1）。油脂和脂肪酸可能從膠粒上脫落，在水溶液相形成膠團(tuán)，可能會(huì)使膠粒中產(chǎn)生自由空間。在用尿素和SDS變性后，自由空間可能會(huì)使蛋白質(zhì)更容易從天然橡膠上脫離，這是因?yàn)闅滏I斷裂后蛋白質(zhì)的體積收縮了。釋放出來(lái)的蛋白質(zhì)被尿素和SDS穩(wěn)定在水相中，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的憎水部分被尿素和SDS覆蓋。因此，去除油脂和脂肪酸后膠粒結(jié)構(gòu)松散，蛋白質(zhì)會(huì)自然脫落。所得純化天然橡膠據(jù)稱是無(wú)蛋白質(zhì)橡膠，因?yàn)槠洳缓鞍踪|(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，需要離心分離2次才可以將天然橡膠中的蛋白質(zhì)除掉。

表1 天然橡膠（HANR）、脫蛋白質(zhì)天然橡膠（DPNR）和無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠（PFNR）的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量

圖1 用尿素、極性溶劑和SDS從天然橡膠中脫除蛋白質(zhì)的示意圖

表2示出了天然橡膠手套A和手套B（市售產(chǎn)品）的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量。手套A和手套B的氮含量值類似。但是手套A的可抽提蛋白質(zhì)含量是手套B的2倍?？沙樘岬鞍踪|(zhì)含量值顯著高于美國(guó)FDA推薦的標(biāo)注值（＜50 μg/g橡膠）。因此，手套A和手套B不符合法規(guī)要求，不能出口到美國(guó)。本研究中，我們用手套A作為漂洗試驗(yàn)的試樣，因?yàn)槠涞恐岛涂沙樘岬鞍踪|(zhì)含量分別大于0.2%和600 μg/g橡膠。

表2 天然橡膠手套A和天然橡膠手套B的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量

圖2所示為天然橡膠（HANR）、無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠和手套A的透射電子顯微鏡（TEM）照片。暗區(qū)是蛋白質(zhì)，亮區(qū)是天然橡膠［蛋白質(zhì)由磷鎢酸（PTA）進(jìn)行了染色］。由圖2（A）可清楚地看出，HANR擁有納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)，主要組分是平均直徑約為1 μm的天然橡膠粒子，蛋白質(zhì)基體平均厚度約為15 nm。從HANR中脫除蛋白質(zhì)后，納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)消失，這由無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠［圖2（B）］的TEM照片可以看出。這說(shuō)明，天然橡膠中含有蛋白質(zhì)時(shí)會(huì)出現(xiàn)納米基質(zhì)結(jié)構(gòu)。納米基質(zhì)的厚度可能取決于蛋白質(zhì)的含量。

圖2 HANR（A）、無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠（PFNR）（B）和天然橡膠手套A（C）的TEM圖像

手套A也具有納米基體結(jié)構(gòu)，如圖2（C）所示。手套A 的納米基體結(jié)構(gòu)幾乎與HANR的相同；例如，納米基體的厚度約為15 nm。這可能是因?yàn)榕cHANR一樣，手套A具有較高的氮含量（0.251%）和可抽提蛋白質(zhì)含量（692 μg/g橡膠）。這證明手套A 含有大量的蛋白質(zhì)，足以形成納米基體結(jié)構(gòu)。

圖3所示為手套A 漂洗試驗(yàn)中可抽提蛋白質(zhì)含量與pH的關(guān)系；漂洗在40 ℃下進(jìn)行6 h?？沙樘岬鞍踪|(zhì)含量顯著取決于漂洗試驗(yàn)的pH。pH為1.9時(shí)，漂洗后，可抽提蛋白質(zhì)含量從692 μg/g橡膠下降到86 μg/g橡膠；pH大于6.8時(shí)，則蛋白質(zhì)含量低于200 μg/g橡膠。相比之下，pH為4.0和5.5時(shí)，手套A 漂洗后的蛋白質(zhì)含量為633 μg/g橡膠和611 μg/g橡膠，與未處理手套A的可抽提蛋白質(zhì)含量692 μg/g橡膠相近。手套A 可抽提蛋白質(zhì)含量隨漂洗試驗(yàn)中pH而變化，這可能與天然橡膠中存在的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)。例如40 ℃下，在pH 4到6之間的條件下，橡膠蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，這是因?yàn)橄鹉z蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在酸度系數(shù)（pKa）約為4處。水相中不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可能會(huì)返回橡膠粒子表面，會(huì)使可抽提蛋白質(zhì)含量增大。天然橡膠手套在使用過(guò)程中也可能會(huì)發(fā)生同樣的情況。在中溫條件下，蛋白質(zhì)可能不能從手套中抽提出來(lái)，因?yàn)槿祟惼つw的pH為4.5到6.0，溫度約為40 ℃。但是，出汗后，從手套中抽出的蛋白質(zhì)量可能會(huì)增大，因?yàn)楹沟膒H為7.0～8.0。這樣就會(huì)產(chǎn)生膠乳過(guò)敏問(wèn)題。例如，以前的研究表明，在接觸手套A 這種高蛋白含量天然橡膠手套時(shí)，身體健康的人發(fā)生膠乳過(guò)敏的比率為30%。此外，我們發(fā)現(xiàn)，溫度40 ℃不足以從天然橡膠中脫除蛋白質(zhì)，不能達(dá)到FDA的標(biāo)識(shí)要求值，即50 μg/g橡膠。

圖3 天然橡膠手套A可抽提蛋白質(zhì)含量隨pH的變化

pH對(duì)手套A 氮含量的影響示于圖4。氮含量幾乎與漂洗pH無(wú)關(guān)（在40 ℃下漂洗6 h）。這意味著天然橡膠手套表面的蛋白質(zhì)量與蛋白質(zhì)總量相比很少。但是嚴(yán)格地說(shuō)，在pH 4.0和pH 5.5條件下漂洗時(shí)，漂洗后手套A的氮含量稍高。氮含量較高可能與可抽提蛋白質(zhì)含量較高有關(guān)，說(shuō)明漂洗后保留了大量的蛋白質(zhì)。漂洗后，氮含量＜0.2%，比手套A（0.251%）的低。所以脫除的蛋白質(zhì)量約為天然橡膠中存在的蛋白質(zhì)總量的20%。因而證實(shí)漂洗只能有效脫除橡膠手套表面的蛋白質(zhì)。

圖5所示為在pH 5.5及不同溫度條件下漂洗6 h后的可抽提蛋白質(zhì)含量。在20 ℃和40 ℃下漂洗6 h后，可抽提蛋白質(zhì)含量較高，說(shuō)明在漂洗過(guò)程中脫除的蛋白質(zhì)較少。相比之下，在60 ℃、80 ℃和100 ℃下漂洗時(shí)，可抽提蛋白質(zhì)含量低于200 μg/g橡膠，大約是未處理時(shí)的1/3。從圖5和圖3的結(jié)果可看出，漂洗的適宜條件是溫度高于60 ℃，pH大于7.0。圖6示出了在pH 5.5及各種溫度條件下漂洗6 h后手套A的氮含量。在20 ℃下漂洗后，手套A氮含量未發(fā)生變化，但在高于40 ℃下漂洗后，氮含量降低到0.2%以下。所以漂洗溫度是天然橡膠脫除蛋白質(zhì)的重要因素，而且60 ℃是一個(gè)關(guān)鍵溫度，該溫度下可脫除20%～30%的蛋白質(zhì)。

圖4 天然橡膠手套A氮含量隨pH的變化

圖5 天然橡膠手套A可抽提蛋白質(zhì)含量隨溫度的變化

圖6 天然橡膠手套A氮含量隨溫度的變化

手套A和漂洗后手套A的FIB-SEM圖像示于圖7。漂洗在pH 5.5及不同溫度下進(jìn)行6 h。暗區(qū)是天然橡膠，亮區(qū)是非橡膠組分，如蛋白質(zhì)和磷脂。未漂洗手套A作為參比試樣，用Ga離子從表面蝕刻20 μm深后，觀察到了納米基體結(jié)構(gòu)。直經(jīng)約1 μm的橡膠粒子均勻分散在非橡膠組分（如蛋白質(zhì)和磷脂）的納米基體中。從FIBSEM（圖7）觀察到的納米基體結(jié)構(gòu)與TEM（圖2）所觀察到的相同，說(shuō)明從表面到內(nèi)部都均勻地形成了這種納米基體結(jié)構(gòu)。手套A在20 ℃下漂洗后納米基體結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，因?yàn)榈颗c可抽提蛋白質(zhì)含量未改變。但是，手套A在60 ℃和80 ℃漂洗后納米基體結(jié)構(gòu)消失，在FIBSEM圖像中未觀察到雜合結(jié)構(gòu)。假定手套A 的厚度為1 mm，漂洗時(shí)從表面脫除20%的蛋白質(zhì)，則估計(jì)是脫除了表面深度100μm以內(nèi)的蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)表面層的估計(jì)厚度與圖7所示結(jié)果一致，圖7表明，漂洗后，從表面到20 μm深未觀察到雜合結(jié)構(gòu)。證明在特定條件下（溫度高于70 ℃，pH大于7），漂洗可以有效地從橡膠的表面脫除蛋白質(zhì)。

圖7 天然橡膠手套A在漂洗前（A）， 以及在20 ℃（B）、60 ℃（C）和80 ℃（D）下漂洗后的FIB-SEM照片

3 結(jié)論［1］

在各種條件下制備了無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠和漂洗天然橡膠手套，用TEM和FIB-SEM觀察其形態(tài)。無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠的氮含量和可抽提蛋白質(zhì)含量分別為0.000%和0.0μg/g橡膠，漂洗天然橡膠手套的相應(yīng)值為0.175%和86μg/g橡膠。研究發(fā)現(xiàn)，制備無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠時(shí)需要進(jìn)行2次離心分離。脫除蛋白質(zhì)后非橡膠組分的納米基體結(jié)構(gòu)消失，無(wú)蛋白質(zhì)天然橡膠的整個(gè)斷面以及漂洗手套的表面（表面以下深20μm）未觀察到雜合結(jié)構(gòu)，但脫除蛋白質(zhì)前存在著這種結(jié)構(gòu)。

［1］ Lina Fukuhara. Removal of Proteins from Natural Rubber Latex and Gloves［J］. Kautsckwk Gummi Kunststoffe，2015， 68（3）:24-28.

［責(zé)任編輯：翁小兵］

TQ 337

B

1671-8232（2015）11-0026-05

2015-07-28

王進(jìn)文（1967— ），男，陜西澄城人，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事期刊審校、信息及專業(yè)翻譯工作，發(fā)表論文及譯著近60篇。