馬齒莧籽粕蛋白的提取及分離純化*

董衡情，王聰，鄭蓮，敬思群

(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊，830046)

馬齒莧(Portulaca oleraceaL.)為馬齒莧科馬齒莧屬植物，又名長壽菜、安樂草，資源豐富，具有降血脂、延緩衰老、提高機體免疫力等功能［1］，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值［2－4］。

馬齒莧籽產(chǎn)油率17.68%，其籽粕產(chǎn)量在82%～90%［5］，而籽粕中蛋白質(zhì)含量為10.00%。本研究采用堿溶酸沉法［6－9］提取馬齒莧籽粕蛋白，并使用蛋白層析儀對其進行了分離純化。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

脫脂馬齒莧籽粕:實驗室自制(亞臨界異丁烷法萃取馬齒莧籽油的副產(chǎn)品，亞臨界萃取工藝條件為:萃取壓力0.8 MPa，萃取溫度40℃，萃取時間150 min;采用凱氏定氮法測得籽粕中蛋白質(zhì)含量為10.00%);NaOH、HCl、NaH2PO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4，均為國產(chǎn)分析純;UNOsphereTMQ Anion Exchange Support陰離子交換填料，BIO RAD公司;蒸餾水，實驗室自制。

HH-S2型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華有限公司;pHS-3C實驗室pH計，上海虹益儀器儀表有限公司;AL-104電子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司;FZ102-SIM真空冷凍干燥設備，德國西門子公司;BioLogic LP(731-8350)層析儀，BIO RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬齒莧籽粕蛋白提取工藝流程

馬齒莧脫脂籽粕→預處理→堿提→離心→上清液→酸沉→離心→沉淀→水洗至中性→冷凍干燥→馬齒莧籽粕粗蛋白1.2.2 操作要點

(1)預處理:將脫脂馬齒莧籽粕干燥、過80目篩。

(2)堿液浸提:將馬齒莧籽粕與NaOH溶液按液料比25∶1(mL∶g)混合，在50℃恒溫水浴鍋中浸提20 min，使蛋白質(zhì)溶于NaOH溶液中。

(3)離心:用離心機以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液。

(4)酸沉:用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液的pH至等電點4.0，使蛋白質(zhì)析出。

(5)離心:再用離心機以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取沉淀，將析出的蛋白質(zhì)分離出來，并用蒸餾水水洗至中性，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中。

(6)冷凍干燥:先將冷凍干燥機溫度降到－50℃以下，放入預先在－20℃冷凍12 h的樣品(保證沒有液態(tài)水存在)，冷凍干燥12 h，反復2次，制得馬齒莧籽粕粗蛋白的凍干粉。

1.2.3 馬齒莧籽粕蛋白分離純化試驗預處理

對固定相的預處理參考李佳梅［10］的方法并稍做改進。未知蛋白的分離純化，一般先選擇陰離子交換柱進行試驗，在未洗脫出蛋白的情況下再考慮選用陽離子交換柱。本試驗選用BIO-RAD公司提供的UNOsphereTMQ Anion Exchange Support陰離子交換填料。對樣品的預處理參考了邵明飛［11］等一步柱層析純化螺旋藻藻藍蛋白的方法。

稱取2 g的馬齒莧籽粕蛋白，加入到100 mL磷酸鹽緩沖液(0.002 mol/L，pH值7.0)中，攪拌均勻，混合液緩慢加入(NH4)2SO4至其終濃度為1.25 mol/L，持續(xù)低速攪拌1 h，放于4℃冰箱靜置12 h，離心(3 000 r/min，30 min)，上清液即為20 g/L的馬齒莧籽粕蛋白溶液。

1.2.4 馬齒莧籽粕蛋白分離純化工藝流程

馬齒莧籽粕粗蛋白→預處理→過陰離子交換柱(固定相預處理→裝柱→平衡→上樣→洗脫→檢測)→(NH4)2SO4溶液梯度洗脫→自動檢測蛋白→繪出洗脫曲線→合并峰值蛋白→透析→冷凍干燥→純化后的馬齒莧籽粕蛋白

1.2.5 分析和計算

試驗參考Gofferje'［12］等對麻瘋樹籽粕蛋白的提取試驗中對籽粕的蛋白質(zhì)、水分、灰分做基本成分測定。馬齒莧籽粕中的化學成分定量分析均采用國家標準方法，包括蛋白質(zhì)的測定［13］、水分的測定［14］、灰分的測定［15］。馬齒莧籽粕中蛋白質(zhì)、水分、灰分的含量分別為10.00%、4.01%和10.25%。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧籽粕蛋白提取單因素試驗結(jié)果

2.1.1 堿液pH值對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響

液料比20∶1(mL∶g)、提取時間 30 min、提取溫度45 ℃，分別取 pH 值為9、10、11、12、13 的 NaOH 溶液提取馬齒莧籽粕中的蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)提取率為指標，試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 NaOH溶液pH值對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of Lye pH on the extraction rates ofpurslane seed meal protein

馬齒莧籽粕蛋白提取率隨堿液pH值的升高而增大，而且在pH 9～11內(nèi)增幅較明顯(蛋白質(zhì)提取率由20.23% 增至49.63%)。pH值大于11，蛋白的提取率雖然也增加，但提取液較黏稠，呈深黃褐色，酸沉時會消耗大量的鹽酸，使產(chǎn)品中鹽分增加，不利于后續(xù)離心分離工藝的實施。因此，提取馬齒莧籽粕蛋白的最適pH值為11。

2.1.2 液料比對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響

pH值為11、提取時間30 min、提取溫度45℃，分別取液料比(mL∶g)為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1提取馬齒莧籽粕中的蛋白質(zhì)。以蛋白質(zhì)提取率為指標，試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on extraction rates of purslane seed meal protein

馬齒莧籽粕蛋白的提取率隨液料比的增加而升高。盡管液料比為25∶1(蛋白提取率53.28%)高于20∶1(蛋白提取率51.09%)的實驗組，但其蛋白提取率增幅較小，而耗水量與用堿量都會大大增加。從經(jīng)濟角度考慮，選擇液料比20∶1較為合適。

2.1.3 浸提溫度對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響

pH 值為11、液料比 20∶1(mL∶g)、提取時間 30 min，提取溫度分別為 30、35、40、45、50 ℃，提取馬齒莧籽粕中的蛋白質(zhì)。以蛋白質(zhì)提取率為指標，試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 浸提溫度對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of temperature on the extraction rates of purslane seeds meal protein

在30～60℃內(nèi)，馬齒莧籽粕蛋白的提取率隨反應溫度的升高而增大，當溫度為45℃時，蛋白提取率52.65%，溫度為50℃，提取率為54.04%，增幅較小，且由于蛋白在50～60℃易受熱變性，因此最適提取溫度為45℃。

2.1.4 浸提時間對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響

pH值為11、液料比20∶1(mL∶g)、提取溫度 45℃，提取時間分別為 10、20、30、40、50 min，提取馬齒莧籽粕中的蛋白質(zhì)，試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提時間對馬齒莧籽粕蛋白取率的影響Fig.4 Effects of time on the extraction rates ofpurslane seeds meal protein

隨著浸提時間的延長，馬齒莧籽粕蛋白的提取率呈升高趨勢，但幅度不太明顯，表明浸提時間對馬齒莧籽粕蛋白提取率的影響較小。浸提時間從30 min增至50 min，蛋白提取率僅由47.10%增至50.63%，而提取時間增長會增加經(jīng)濟成本，因此，最適提取時間30 min。

2.2 正交試驗優(yōu)化馬齒莧籽粕蛋白提取工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇堿液pH、液料比(mL∶g)、溫度、時間做L9(34)四因素三水平正交優(yōu)化試驗，試驗結(jié)果及方差分析分別見表1和表2。

表1 正交優(yōu)化試驗結(jié)果表Table 1 Experimental results of orthogonal

表2 各因素方差分析表Table 2 The ANOVA table of each factor

影響蛋白質(zhì)提取率的各因素的主次關系從大到小依次為:堿液pH、液料比、溫度、時間。各因素的最優(yōu)水平組合為A3B3C1D3，即采用pH值為12的NaOH溶液、液料比25∶1(mL∶g)、50 ℃條件下提取20 min，即可達到最佳提取效果。經(jīng)驗證試驗測得平均提取率為56.04%，此時馬齒莧籽粕蛋白純度(以蛋白質(zhì)含量計)為58.53%。相對標準偏差RSD=1.1%，表明結(jié)果重復性良好，說明所選最優(yōu)工藝條件合理。

2.3 馬齒莧籽粕蛋白等電點的確定

按馬齒莧籽粕蛋白的最優(yōu)提取工藝，即液料比25∶1(mL∶g)，pH值為12的堿液，在45℃恒溫水浴中浸提20 min，通過測定蛋白質(zhì)的提取率來確定酸沉的最適pH值，即為蛋白質(zhì)等電點。從圖5中可看出，馬齒莧籽粕蛋白的等電點在4.0，即pI=4.0。

圖5 馬齒莧籽粕蛋白等電點測定結(jié)果Fig.5 Purslane seed meal protein isoelectric point determination results

2.4 馬齒莧籽粕蛋白分離純化工藝確定

2.4.1 洗脫液流速的選擇

洗脫速度為0.3 mL/min和0.5 mL/min時，洗脫一段時間之后柱子中的液體低于或遠高于填料平面，不符合要求。所以洗脫液流速初選0.4 mL/min，當流速為0.4 mL/min時，峰的分辨率不太高，峰形近似對稱。其原因可能是在較低的流速條件下，溶質(zhì)的擴散作用，使得譜帶擴張而峰形寬，分辨率下降［13］。

2.4.2 上樣量的選擇

當上樣量為1 mL時，峰的分辨率不高，峰型不明顯，近似平穩(wěn)，上樣量為5 mL時，峰比較明顯，但是峰形較寬，分辨率不高。上樣量增加導致峰形較寬［10］，當上樣量為3 mL時，峰形較窄，分辨率較高且峰形近似對稱。所以初步確定最佳上樣量為3 mL。洗脫曲線見圖6。因此分離純化最適工藝為:上樣量為3 mL，洗脫液流速為0.4 mL/min，同時表明陰離子交換填料適合于馬齒莧籽粕蛋白的分離純化。將處于峰值的試管中的液體收集到透析袋中，進行透析、冷凍干燥，得到分離純化的馬齒莧籽粕蛋白，其含量(以蛋白質(zhì)含量計)為91.02%，比純化前提高了32.49%。

圖6 洗脫曲線Fig.6 Elutioncuves

3 結(jié)論

馬齒莧籽粕蛋白最優(yōu)提取工藝為:液料比25∶1(mL∶g)，堿液pH值12，浸提溫度50℃，浸提時間20 min，提取率56.04%，馬齒莧籽粕蛋白含量(以蛋白質(zhì)含量計)為58.53%，馬齒莧籽粕蛋白的等電點pI=4.0;馬齒莧籽粕蛋白的分離純化最優(yōu)工藝為:上樣量為3 mL，洗脫液流速為0.4 mL/min。馬齒莧籽粕蛋白含量(以蛋白質(zhì)含量計)為91.02%，比分離純化前提高了32.49%。

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