響應面法優(yōu)化微波輔助提取艾草黃酮工藝

何義雁，張珺，朱香燕，吳衛(wèi)國

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南長沙410128）

響應面法優(yōu)化微波輔助提取艾草黃酮工藝

何義雁，張珺，朱香燕，吳衛(wèi)國*

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南長沙410128）

以艾草為原料，通過單因素試驗和響應面試驗設(shè)計優(yōu)化微波輔助提取黃酮工藝，分別考察了乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間對黃酮得率的影響。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度72%、液料比45∶1（g/mL），微波功率520 W，微波時間151 s，在此工藝條件下，艾草黃酮得率為4.37%。

艾草；黃酮；微波；提??；響應面分析法

艾草，別名艾蒿、香艾、醫(yī)草等，菊科多年生草本植物，具有獨特的香味，營養(yǎng)豐富，藥食兼用［1］。艾草可制成各種保健食品和食品配料［2-3］，國內(nèi)已有企業(yè)將艾草開發(fā)成綠色食品［4］，出口日本，同時艾草還具有較高的藥用價值［5-6］，在我國南方一些地區(qū)，常被用作為一種滋補藥材。近來研究發(fā)現(xiàn)［7-8］：艾草中含有豐富的黃酮類化合物，具有降脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、延緩衰老以及治療慢性前列腺炎等多種生理活性功能。隨著人們健康意識的不斷增強，黃酮類化合物引起越來越多研究人員的重視，近年來，國內(nèi)外特別重視黃酮類化合物作為食品添加劑的開發(fā)研制，已開發(fā)出添加有黃酮類化合物的飲料、面包、啤酒等［9］。艾草作為黃酮類物質(zhì)的天然載體，具有廣闊的開發(fā)前景。

傳統(tǒng)的提取黃酮的方法提取率低、耗時長，相比于傳統(tǒng)方法，微波萃取技術(shù)能縮短萃取時間和提高萃取效率，并且具有高選擇性、低能耗、加熱均勻等特點［10-11］。目前，國內(nèi)對艾草黃酮的研究較多［12-13］，但采用響應面法優(yōu)化微波提取艾草黃酮工藝的研究鮮有報道。本研究根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理進行響應面試驗，優(yōu)化了微波輔助提取艾草黃酮的工藝條件，為艾草黃酮的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮艾草莖葉：采自湖南農(nóng)業(yè)大學實驗基地，采收于4月中旬，50℃熱風干燥后粉碎過80目篩，放入磨口瓶中備用。蘆丁標準品：中國食品藥品檢定研究所；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、95%乙醇、石油醚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

WFJ-7200型可見分光光度計：龍尼柯儀器有限公司；TP-213型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；NJL07-3型實驗用微波爐：南京杰全微波設(shè)備有限公司；101A-3ET型電熱鼓風干燥箱：上海滬粵明科學儀器有限公司；RE-52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；SHB-ⅢT型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Q-100A2型高速多功能粉碎機：上海冰都電器有限公司。

式中：m1為按標準曲線方程計算出來的被測液中黃酮的含量，mg；m為艾草粉質(zhì)量，g；V1為待測液體積，mL；V2為待測液總體積，mL。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素影響試驗

以0.5g艾草粉為提取對象，在固定乙醇濃度70%、液料比50∶1、微波功率500 W、微波時間120 s條件下的基礎(chǔ)上，變動其中的一個因素，分別探討其對黃酮得率的影響。單因素試驗設(shè)計如下：

1）乙醇濃度設(shè)計：50%、60%、70%、80%、90%（體積比）等5個水平；

2）液料比設(shè)計：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（g/mL）等6個水平；

3）微波功率設(shè)計：300、400、500、600、700 W等5個水平；

4）微波時間設(shè)計：60、90、120、150、180、210、240 s等7個水平。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線制作［14］

準確稱取6.5 mg蘆丁標準品，以80%乙醇定容至100mL，搖勻，既得蘆丁標準溶液，濃度為0.065 mg/mL。準確吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL蘆丁標準溶液于25 mL容量瓶中，加30%乙醇補足至12.5 mL，加5% NaNO20.7 mL，搖勻并放置5 min，再加10%Al（NO3）30.7mL，搖勻并放置5min，最后加1mol/L NaOH 4.0mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻并放置15 min，在510 nm處測定吸光度。

1.2.2 艾草黃酮的制備

準確稱取艾草粉0.5 g，置于萃取瓶中，按設(shè)計好的乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間進行微波提取。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮去除乙醇，得到的提取液用石油醚去除葉綠素等脂類物質(zhì)，再進行濃縮，最后用適量95%乙醇溶解，5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液定容至100 mL，備用。

1.2.3 提取液中黃酮的測定

準確吸取1.2.2節(jié)中制備的提取液0.3 mL，按照標準曲線的方法測定吸光度，代入標準曲線方程，求出濃度，再按式（1）計算黃酮得率。

1.3.2 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間為自變因素，以黃酮得率為響應值，按照Box-Behnken試驗設(shè)計原理設(shè)計四因素三水平試驗，采用Design Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線方程

由1.2.1中方法可得到標準曲線方程：A=8.35714C+ 0.003 19（A表示吸光度，C表示濃度），R2=0.998 86。2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

試驗考察了乙醇濃度對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由圖1可知，隨著乙醇濃度（體積濃度）的增加，黃酮得率呈先上升后下降的趨勢，在乙醇濃度為70%時達到最大值。當乙醇濃度大于70%時，黃酮得率反而下降，這可能是由于一些醇溶性物質(zhì)、葉綠素的溶出增加，這些成分會減少黃酮類化合物同乙醇-水分子的結(jié)合，從而導致黃酮得率的減少［15］。

2.2.2 液料比對黃酮得率的影響

試驗考察了液料比對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of flavonoids

由圖2可知，隨著液料比的增加，黃酮得率先上升后逐漸達到平衡。液料比從10∶1增加到40∶1時，得率的增幅較大，液料比繼續(xù)增加，得率的增幅很小，逐漸趨于平衡。增加溶劑能夠促進黃酮類物質(zhì)的溶出，從而提高了黃酮的得率，但液料比太大，會造成溶劑的浪費。從提取效果和經(jīng)濟方面考慮，液料比選40∶1比較合適。

2.2.3 微波功率對黃酮得率的影響

試驗考察了微波功率對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波功率對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the yield of fla

由圖3可知，隨著微波功率的增加，黃酮得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當微波功率為500 W時，黃酮得率達到最大。這有可能是因為溶液分子之間的運動會隨著微波功率的增加而變得更加劇烈，從而使細胞膜的破碎程度變大，黃酮類物質(zhì)的浸出率增加，但是微波功率過高會使溶液的溫度迅速升高而導致黃酮類化合物的分解，因此使得黃酮得率下降。

2.2.4 微波時間對黃酮得率的影響

試驗考察了微波時間對黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著微波時間的增加，黃酮得率增加，當微波時間為150 s時，黃酮得率達到最大，繼續(xù)增加微波時間，黃酮得率反而下降。這有可能是由于在較短的時間里微波對細胞膜的破壞程度較大，能夠促進物質(zhì)的溶出，因此得率也高，但是如果微波時間過長，高溫對提取液中的有效成分有破壞作用，會使黃酮類化合物分解，并且高溫能夠使高分子雜質(zhì)浸出量增加，影響提取物的有效含量［16］。

圖4 微波時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on the yield of flavonoids

2.3 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.1 試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、液料比、微波功率和微波時間為自變因素，以黃酮得率為響應值，按照Box-Behnken試驗設(shè)計原理設(shè)計四因素三水平試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 模型方程的建立及其方差分析

以黃酮得率為響應值，由Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，經(jīng)回歸擬合后，得到黃酮得率（Y）對乙醇濃度（A）、液料比（B）、微波功率（C）和微波時間（D）的多元回歸方程為：Y=4.25+0.24A+0.22B+ 0.098C+0.067D-0.090AB-0.082AC+0.015AD+0.075BC-0.020BD-0.20CD-0.51A2-0.23B2-0.32C2-0.28D2

由表3的方差分析可得到，該模型達到極顯著水平（P＜0.000 1）。并且，該模型的失擬度不顯著（P＞0.1），可知該方程與實際數(shù)據(jù)擬合性良好，試驗設(shè)計可靠，適用于微波輔助乙醇提取艾草黃酮工藝的優(yōu)化。信噪比的值為57.753，遠大于4，因此該模型可以用于預測試驗數(shù)據(jù)。決定系數(shù)R2=0.9965，調(diào)整后R2=0.9931，從而說明該模型的變量與自變量之間關(guān)系顯著。在此模型中，乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間對黃酮得率都有極顯著的影響。且乙醇濃度與液料比、乙醇濃度與微波功率、液料比與微波功率、微波功率與微波時間之間的交互作用極顯著。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for each item of the developed quadratic regression model

2.3.3 響應面及等高線圖分析

對表3結(jié)果中交互作用顯著的因素作響應曲面及等高線圖，見圖5、6、7、8。

各個因素對黃酮得率的影響能夠從響應曲面圖的形狀反應出來，響應曲面越陡峭的因素對黃酮得率的影響就越顯著［17］。比較圖5、6、7、8并結(jié)合表3可以得出各因素對艾草黃酮得率影響大小依次是乙醇濃度＞液料比＞微波功率＞微波時間。

圖5 乙醇濃度與液料比交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface of ethanol concentration and liquid to material ratio

圖6 乙醇濃度與微波功率交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface of ethanol concentration and microwave power

圖7 液料比與微波功率交互作用的響應面圖Fig.7 Response surface of liquid to material ratio and microwave power

圖8 微波功率與微波時間交互作用的響應面圖Fig.8 Response surface of microwave power and microwave time

比較圖5、6、7、8并結(jié)合表3可知，兩因素交互作用由大到小為：微波功率和微波時間＞乙醇濃度和液料比＞乙醇濃度和微波功率＞液料比和微波功率。由圖5可知，當乙醇濃度一定時，隨著液料比的增加黃酮得率呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢；當液料比一定時，隨著乙醇濃度的增加黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；乙醇濃度和液料比的等高線趨于橢圓狀，說明二者的交互作用顯著。由圖6可知，隨著乙醇濃度和微波功率的增加黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；乙醇濃度和微波功率的等高線趨于橢圓狀，說明二者的交互作用顯著。由圖7可知，當液料比一定時，隨著微波功率的增加黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；當微波功率一定時，隨著液料比的增加黃酮得率呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢；液料比和微波功率的等高線呈橢圓狀，說明二者的交互作用顯著。由圖8可知，隨著微波時間和微波功率的增加黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢；微波功率和微波時間的等高線呈橢圓狀，說明二者的交互作用顯著。

2.4 驗證試驗

利用Design Expert 8.0.6軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化分析，可得艾草黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇濃度71.77%、液料比44.66∶1、微波功率517.12 W、微波時間151.47 s，此時艾草黃酮得率預測值為4.34%?？紤]到實際操作的可行性，將提取工藝條件調(diào)整為乙醇濃度72%、液料比45∶1、微波功率520 W、提取時間151 s，在此條件下進行3次重復驗證實驗，平均值為4.37%，與預測值相比，相對誤差為0.69%。由此可知，試驗結(jié)果與模型相符，說明通過響應面優(yōu)化法得到的微波輔助提取艾草黃酮的工藝條件是可靠的。

3 結(jié)論

本實驗采用微波輔助法對艾草中的黃酮進行提取，通過單因素和Box-Behnken響應面試驗得到黃酮得率和乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間的回歸模型，得到優(yōu)化的工藝條件為：乙醇濃度71.77%、液料比44.66：1、微波功率517.12W、微波時間151.47s。其回歸方程為：Y=4.25+0.24A+0.22B+0.098C+0.067D-0.090AB-0.082AC+0.015AD+0.075BC-0.020BD-0.20CD-0.51A2-0.23B2-0.32C2-0.28D2。結(jié)合實際可操作性調(diào)整最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度72%、液料比45∶1、微波功率520 W、提取時間151 s，黃酮得率為4.37%，與理論預測值4.34%相比，其相對誤差為0.69%，說明該模型能較好地模擬和預測艾草黃酮得率。通過方差分析可知，各因素對艾草黃酮得率影響大小依次是乙醇濃度＞液料比＞微波功率＞微波時間。由響應曲面圖分析可知，乙醇濃度與液料比、乙醇濃度與微波功率、液料比與微波功率、微波功率與微波時間之間的交互作用對艾草黃酮得率的影響極顯著。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Artemisia Argyi by Response Surface Methodology

HE Yi-yan，ZHANG Jun，ZHU Xiang-yan，WU Wei-guo*
（Food Science and Technology College，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Microwave-assisted extraction flavonoids from Artemisia argyi was investigated by examining the effects of ethanol concentration，liquid to material ratio，microwave power and microwave time on the yield of flavonoids，by using single factor method coupled with response surface experimental design.The result showed that ethanol concentration of 72%，liquid to material ratio of 45∶1，microwave power of 520 W and microwavetime of 151 s were found optimum.Under the optimized conditions，the yield of flavonoids was 4.37%.

Artemisia argyi；flavonoids；microwave；extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.018

2014-08-06

何義雁（1990—），女（漢），碩士，研究方向：食品資源開發(fā)與利用。

*通信作者