響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取金針菇根部蛋白的工藝研究

張樂，周林燕，宋洪波，李鵬，李亞茹，曹珍珍，魏明，李淑榮，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取金針菇根部蛋白的工藝研究

張樂1，2，周林燕1，宋洪波2，李鵬2，李亞茹1，曹珍珍1，魏明1，2，李淑榮1，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

以廢棄的金針菇菌根為原料，采用復(fù)合酶法提取蛋白。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇加酶量、pH、提取溫度、時(shí)間為自變量，以蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和響應(yīng)面分析法，建立總蛋白提取率的二次回歸模型，確定了影響提取率的因素依次為溫度＞時(shí)間＞酶加量＞pH；最佳提取工藝條件為：酶加量1.03%、pH 6.49、溫度43.92℃、時(shí)間33.03 min，在此條件下蛋白提取率預(yù)測(cè)值為64.16%，驗(yàn)證試驗(yàn)中蛋白的得率為63.86%，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值沒有顯著差別。

金針菇；蛋白；酶法提?。豁憫?yīng)面法

金針菇（Flammulina velutipes），擔(dān)子菌目金錢菌 屬，又名冬菇、樸菇、枸菇等，因其金黃細(xì)嫩的柄如金針而得名［1］。金針菇營(yíng)養(yǎng)豐富，其中的多糖、火菇素、倍半萜、免疫調(diào)節(jié)蛋白、核糖體失活蛋白等活性成分具有很高的藥用價(jià)值，是珍貴的食用菌之一［2-3］。

隨著人們對(duì)金針菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的認(rèn)識(shí)，金針菇的消費(fèi)量越來(lái)越高。產(chǎn)生的大量金針菇菌柄基部（俗稱金針菇根）因其雜質(zhì)、纖維素等成分較多，口感較差，售前或食用前被切下來(lái)直接被當(dāng)作垃圾扔掉。這些下腳料中仍然含有大量的蛋白質(zhì)、纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分，這就造成極大浪費(fèi)［4］。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)金針菇功能成分提取的研究主要集中在子實(shí)體和菌絲體上［5-7］，金針菇菌柄基部中含有大量的蛋白質(zhì)，活性蛋白具有抗氧化、抗疲勞、提高記憶力、減緩細(xì)胞衰老、延年益壽等功效，但利用金針菇菌柄基部為原料提取蛋白的研究還鮮有報(bào)道。關(guān)于植物蛋白提取方法主要有堿法和酶法。堿法雖然操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，但在提取率、衛(wèi)生安全、營(yíng)養(yǎng)特性等方面存在缺陷；酶法是利用酶對(duì)細(xì)胞壁或蛋白的降解，促使蛋白溶出，具有條件溫和、提取率高，能更多保留蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種高效、環(huán)保的植物蛋白提取技術(shù)。國(guó)內(nèi)外已有利用酶法提取大豆、花生、大米等植物物蛋白的研究報(bào)道［8-9］。

本文以金針菇菌根為研究對(duì)象，研究影響金針菇根部蛋白浸提率的因素，并利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，獲得最佳工藝參數(shù)。通過(guò)本研究能有效提高金針菇副產(chǎn)物和下腳料的價(jià)值，有效保護(hù)環(huán)境，減少污染，增加農(nóng)戶和生產(chǎn)企業(yè)的收入。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇購(gòu)于北京市天秀路菜市場(chǎng)，取菌根部分50℃電熱鼓風(fēng)干燥至恒重，萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩貯于干燥器備用。NaCl、NaOH、鹽酸等購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，分析純；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Cellulase1.5L纖維素酶（酶活9 973.6 U/g）、Protamex復(fù)合蛋白酶（酶活22 191.4 U/g）、Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶（酶活25 228.8 U/g）、Neutrase0.8L中性蛋白酶（酶活21 148.7 U/g），購(gòu)于丹麥諾維信公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SL-100型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金廠；pB-10 sartorius普及型pH計(jì)：美國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；全自動(dòng)凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 金針菇菌根蛋白的提取

稱取已制備好的金針菇菌根粉末，按料液比1∶ 15（g/mL）加入蒸餾水搖勻，調(diào)pH為酶的適宜pH，加酶，一定溫度下浸提一定時(shí)間后，80℃滅酶10 min，之后將料液轉(zhuǎn)入離心管，8 000 r/min離心20 min，取上清液，測(cè)蛋白含量。

1.3.2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100 mL，配制成100μg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取出0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6支具塞試管，分別加水補(bǔ)足到1 mL，然后各加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑蓋上塞子，搖勻，室溫靜置2 min后在595 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.006 4X+0.005 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.3.3 蛋白提取率測(cè)定

蛋白提取率（%）=（上清液中蛋白質(zhì)量/菌根粉中總蛋白質(zhì)量）×100%；菌根粉總蛋白測(cè)定采用凱氏定氮法（GB/T 15673-2009《GBT 15673-2009食用菌中粗蛋白含量的測(cè)定》）；提取液蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［10-11］。水分含量測(cè)定采用直接干燥法（GB5009.3-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》）；纖維素酶活力測(cè)定采用3、5—二硝基水楊酸法；蛋白酶活力測(cè)定采用福林法（GB/T23527-2009《蛋白酶制劑》）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在其它條件一致時(shí)，改變一個(gè)因素，分別研究不同酶制劑：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶；酶用量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5；酶反應(yīng)時(shí)間 15、30、45、60、75、90 min；酶反應(yīng)溫度35、40、45、50、55、60℃對(duì)蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定酶制劑為復(fù)合蛋白酶，以酶加量、提取溫度、時(shí)間、pH為自變量，蛋白提取率為響應(yīng)值（y），采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法［12］，建立金針菇根蛋白提取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。自變量因素及編碼水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Variables and experimental design levels for response surface

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖；通過(guò)Design-Expert.8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面模型建立和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑篩選

本試驗(yàn)選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶四種常見酶，在各自適宜的pH、溫度等作用條件下對(duì)金針菇菌根蛋白進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同酶制劑對(duì)蛋白提取率的影響Table 2 Effects of enzyme on extraction rate of protein

由表2可以看出，復(fù)合蛋白酶提取效果最好，中性蛋白酶、堿性蛋白酶次之，纖維素酶效果較差，原因可能是金針菇經(jīng)過(guò)粉碎過(guò)篩，細(xì)胞壁被破壞，纖維素起到的阻礙作用幾乎可以忽略，因此纖維素酶并沒有起到很大作用。復(fù)合蛋白酶能將大的蛋白質(zhì)分子水解成短肽鏈等較小的分子，有利于蛋白質(zhì)溶解，有效提高了蛋白的提取率［13］。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中選用復(fù)合蛋白酶作為提取蛋白的酶試劑。

2.2 酶法提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響

酶的添加量對(duì)蛋白提取率具有顯著的影響，不同酶添加量對(duì)金針菇菌根中蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 復(fù)合蛋白酶加量對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of protamex dose on extraction rate of protein

由圖1可知，蛋白提取率隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量為1.0%時(shí)提取率最高。這是因?yàn)殡S著提取液中酶濃度的升高，與底物的接觸面積增大，酶解反應(yīng)速率增大。但當(dāng)酶的濃度達(dá)到過(guò)飽和時(shí)，底物濃度相對(duì)較低，酶與底物競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用。同時(shí)過(guò)多的酶可能作用于已經(jīng)溶出的蛋白質(zhì)使其水解［14］，從而降低了提取率。

2.2.2 pH對(duì)蛋白提取率的影響

pH對(duì)蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 pH對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of pH on extraction rate of protein

由圖2可看出，當(dāng)提取液pH在5～6.5時(shí)，蛋白提取率隨著提取液pH的升高顯著增大有顯著差異（P＜0.05），當(dāng)pH大于6.5后，蛋白質(zhì)提取率略有降低。蛋白酶活力受pH影響很大，復(fù)合蛋白酶的最適pH為6.5。在最適pH下蛋白酶催化反應(yīng)的速率最高，這是因?yàn)閜H會(huì)影響底物和酶的構(gòu)象，從而影響酶的活力及其與底物的結(jié)合［15］。

2.2.3 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

酶不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of time on extraction rate of protein

由圖3可看出，在反應(yīng)初期，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率增加較快，在30 min時(shí)，蛋白提取率最高，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力得到充分利用，酶解反應(yīng)進(jìn)行得較完全，酶反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，蛋白基本被提取出來(lái)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率迅速下降，這可能因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物的積累抑制了酶的活力，同時(shí)部分溶出蛋白被水解，生成多肽或氨基酸，最終造成考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定出的蛋白含量降低［16］。故酶解時(shí)間控制在30 min左右為宜。

2.2.4 酶反應(yīng)溫度對(duì)蛋白提取率的影響

酶反應(yīng)溫度對(duì)金針菇菌根中蛋白提取率影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of protein

由圖4可看出，酶反應(yīng)溫度在35℃～45℃時(shí)，蛋白提取率隨溫度的升高而增大，45℃達(dá)最大值，而后隨溫度的增大蛋白提取率減小。這是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，溫度升高，酶活性增強(qiáng)、反應(yīng)速度加快、酶與底物結(jié)合程度提高，有利于蛋白質(zhì)提?。坏?dāng)溫度升高超過(guò)酶作用的適宜溫度，不僅使酶活性降低，而且會(huì)引起蛋白質(zhì)的聚集和沉淀，使其溶解度下降，從而降低了蛋白提取率［17］。同時(shí)高溫還會(huì)破壞原本已被提取出來(lái)的蛋白的結(jié)構(gòu)，造成蛋白的不可逆變性。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析

本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

對(duì)表中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到金針菇根部蛋白提取率與酶加量（A）、pH（B）溫度（C）和時(shí)間（D）4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=+63.82+0.43A+0.22B-1.98C+0.72D+0.97AB+ 3.60AC+1.60AD+1.65BC-0.18BD-1.40CD-1.15A2-5.83B2-5.18 C2-1.84D2。對(duì)二次回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental designs and extraction results

表4 回歸模型的方差分析Table 4 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

表4 回歸模型的方差分析Table 4 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

由表4可知，該模型的F=5.4，表明該模型有意義且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。失擬項(xiàng)的F值為0.32，說(shuō)明失擬項(xiàng)相對(duì)于誤差項(xiàng)來(lái)講不顯著；其中決定系數(shù)R2為0.893 7，說(shuō)明該模型的擬合性較好，可用此模型對(duì)蛋白的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從表4還可以看出，一次項(xiàng)與二次項(xiàng)中的C，AC，B2，C2這幾項(xiàng)為顯著性的模型項(xiàng)。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：C＞D＞A＞B，即溫度＞時(shí)間＞酶加量＞pH。

2.3.2 單因素效應(yīng)分析

為進(jìn)一步分析試驗(yàn)中各因素對(duì)蛋白提取率的影響，對(duì)回歸模型進(jìn)行降維處理。固定任意3個(gè)因素于零水平，依次得到各個(gè)單因素與蛋白提取率的效應(yīng)方程，根據(jù)方程可得到單因素效應(yīng)曲線如圖5。

圖5 單因素效應(yīng)分析圖Fig.5 Domino effect analysis of single factor

由圖5可知，各因素對(duì)蛋白提取率的影響均呈先增大后減小的趨勢(shì)，其中C酶解溫度變化幅度最大，說(shuō)明酶解溫度對(duì)蛋白提取率影響最大。圖中各曲線的變化趨勢(shì)與前面單因素試驗(yàn)結(jié)果基本吻合，說(shuō)明所建立的數(shù)學(xué)模型是合適的。

2.3.3 交互作用分析

方差分析結(jié)果表明，模型中AB，AD，BC，BD，CD無(wú)明顯的交互作用，AC的交互作用顯著，即酶加量和溫度之間的交互作用對(duì)蛋白提取率有顯著影響，其交互作用響應(yīng)曲面和等高線如圖6所示。

圖6 酶加量和提取溫度交互影響蛋白質(zhì)提取率的曲面圖及等高線圖Fig.6 Influence of protamex dose and extracting temperature on extraction rate of protein

從圖6可以看出，當(dāng)酶加量一定時(shí)，提取溫度在40℃至50℃之間變化，蛋白的提取率先上升后下降；當(dāng)提取溫度一定時(shí)，酶加量對(duì)蛋白提取率的影響與溫度相同。從圖等高線的疏密度和形狀還可以看出，橢圓形明顯，二者的交互作用顯著。

2.3.4 回歸模型驗(yàn)證

由Design-Expert.8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析結(jié)果表明，提取蛋白的最佳條件為：酶加量1.03%、pH 6.49、溫度43.92℃、時(shí)間33.03 min，蛋白提取率的理論值為64.16%。采取上述最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作，將蛋白提取條件修正為酶加量1%、pH6.5、溫度44℃、時(shí)間33 min，實(shí)測(cè)提取率為63.86%，相對(duì)偏差0.47%。說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，根據(jù)建立的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白提取時(shí)可行的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先通過(guò)比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、纖維素酶的提取效果，確定復(fù)合蛋白酶為提取蛋白的酶試劑。對(duì)影響金針菇菌根蛋白提取的因素：酶添加量、pH、提取溫度、時(shí)間進(jìn)行了研究，在此單因素基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和響應(yīng)面分析建立了回歸方程。通過(guò)方差分析和失擬項(xiàng)分析，證明該模型擬合度較好且合理可靠，能夠較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)金針菇菌根蛋白的提取率。得出的金針菇菌根蛋白的最佳提取條件為：酶加量1.03%、pH 6.49、溫度43.92℃、時(shí)間33.03 min。為了充分開發(fā)利用金針菇廢棄菌根，有效提高金針菇副產(chǎn)物和下腳料的價(jià)值仍需加大科研力度，完善蛋白提取分離基本理論和方法，滿足工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。

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Optimization of Enzymatic Extraction of Protein from Root of Flammulina velutipes by Response Surface Methodology

ZHANG Le1，2，ZHOU Lin-yan1，SONG Hong-bo2，LI Peng2，LI Ya-ru1，CAO Zhen-zhen1，WEI Ming1，2，LI Shu-rong1，*
（1.Key Laboratory of Agro-product Processing and Quality Control/Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China）

Protein in root of Flammulina velutipes was extracted with the assistance of protamex proteinase in this study.Based on single factor experiments，dosage of protamex protease，pH value，enzymatic extraction time and temperature were optimized using Box-Behnken design and response surface methodology for achieving maximum extraction rate of proteins.Factor contribution rate obtained from the F-test were as follows：extraction temperature＞extraction time＞dosage of protamex protease＞pH value.The optimum extraction parameters obtained from response surface analysis were as follows：dosage of protamex protease 1.03%，pH 6.49，extraction temperature 43.92℃and extraction time 33.03 min.By using the optimized extraction parameters，the predicated extraction rate of proteins from base of Flammulina velutips was 64.16%，meanwhile the rate of proteins was 63.86%in the validated experiment.There was no significant difference between predictive value and actual value.

Flammulina velutipes；protein；enzymatic extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.011

2013-10-15

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303080）

張樂（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工理論與應(yīng)用。

*通信作者：李淑榮（1967—），女（漢），研究員，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。