坦布蘇病毒MM1775株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立

閆大為，吳曉剛，李雪松，石 迎，馮琳琳，崔宏銳，李國(guó)新，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

坦布蘇病毒MM1775株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立

閆大為，吳曉剛，李雪松，石 迎，馮琳琳，崔宏銳，李國(guó)新，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

本研究將坦布蘇病毒 MM1775 株全基因組分 3 段克隆，獲得 3 個(gè)重組質(zhì)粒，利用融合 PCR方法擴(kuò)增得到5'端含有 T 7 啟動(dòng)子的病毒全長(zhǎng) cDNA，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到感染性的 RNA，將 RNA 轉(zhuǎn)染 DF-1 細(xì)胞，48 h 后出現(xiàn)細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到 90%，將細(xì)胞上清接種 DF-1 細(xì)胞，72 h 后進(jìn)行間接免疫熒光（indirect immunofulorescence，IFA）和RT-PCR 鑒定，結(jié)果表明拯救病毒成功。序列測(cè)定結(jié)果顯示，拯救毒的全基因組序列與親本毒完全一致，表明MM1775反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究坦布蘇病毒致病性等相關(guān)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

坦布蘇病毒；MM1775；反向遺傳操作系統(tǒng)

2010年，我國(guó)首次爆發(fā)了鴨坦布蘇病毒病，該病主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降，并伴有高熱、食欲下降、運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致鴨死亡，給我國(guó)鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1-4］。到目前為止，已從鴨、鵝、雞、鴿子、麻雀和蚊子體內(nèi)分離得到多株鴨坦布蘇病毒［5-11］，可見該病毒感，可引起小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀并可能造成死亡［12］。鴨養(yǎng)殖場(chǎng)工人的被檢血清呈現(xiàn)抗坦布蘇病毒陽(yáng)性，被檢工人的咽拭子中，有47.7% 能檢測(cè)到病毒RNA［13］，表明鴨坦布蘇病毒具有潛伏感染人的幾率。

1955年，研究人員從馬來西亞庫(kù)蚊體內(nèi)分離到第1株坦布蘇病毒分離株（MM1775株）［14］，隨后幾十年陸續(xù)從蚊子體內(nèi)分離到多株坦布蘇病毒，但很少有動(dòng)物感染該病毒的報(bào)道［15-17］。目前對(duì)早期坦布蘇病毒蚊體分離株在不同動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制能力，對(duì)動(dòng)物的致病性及在動(dòng)物間的傳播能力等生物學(xué)特性缺乏足夠的研究，阻礙了我們對(duì)坦布蘇病毒致病性的深入了解和認(rèn)識(shí)。利用病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，可以在分子水平對(duì)病毒進(jìn)行改造，為研究坦布蘇病毒的分子致病機(jī)制等提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸、菌種和細(xì)胞 保存在Trizol 中的坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）MM1775 株核酸購(gòu)買自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司；E.coli DH5α購(gòu)自北京全式金公司；DF-1 細(xì)胞和抗鴨坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體（1F5）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自Gibco公司； RNAisoPlus、ATP、pSIMPLE19 EcoR V/BAP Vector、EcoR I、Kpn I、EcoR V、Not I等限制性核酸內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；PfuUltraII Fusion HS DNA 聚合酶購(gòu)自 Agilent公司；mMESSAGEmMACHINE?T7 Kit購(gòu)自 Ambion公司；Lipofectamine LTX & Plus Reagent、Super Script III反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司；Opti-MEM購(gòu)自Life technologies；DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提試劑盒購(gòu)自Axygen公司；T4 PNK購(gòu)自NEB公司。

1.3 病毒 RNA 的提取和RT-PCR 擴(kuò)增 按照Trizol說明書要求提取坦布蘇病毒MM1775株的RNA，以7條MM1775 株特異性反轉(zhuǎn)錄引物的混合液作為反轉(zhuǎn)錄引物（表1），經(jīng)Super Script III反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此cDNA為模板，以10對(duì)PCR引物用PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶擴(kuò)增得到10段兩兩重疊的PCR產(chǎn)物。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶擴(kuò)增得到的cDNA，末端沒有磷酸基團(tuán)，需經(jīng)T4 PNK磷酸化后，與pSIMPLE 19載體16℃過夜連接，然后將連接反應(yīng)液按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。將 100 μ L 菌液均勻涂在含有Amp、X-Gal和IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取白色單個(gè)菌落，接種在4 mL含Amp液體L B培養(yǎng)基（Amp+）中，37℃培養(yǎng)12 h。進(jìn)行菌液PCR，將陽(yáng)性克隆送上海桑尼生物公司測(cè)序。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取序列正確的質(zhì)粒，并進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.5 病毒基因組分段克隆 將上述10段PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外照膠儀下切割目的條帶，利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，克隆至pSIMPLE 19 載體上得到序列正確的重組質(zhì)粒：1-1174-pSIMPLE、1106-2384-pSIMPLE、2281-3434-pSIMPLE、3352-4567-pSIMPLE、4513-5874-pSIMPLE、5797-7012-pSIMPLE、6937-8078-pSIMPLE、8059-9087-pSIMPLE、9061-9961-pSIMPLE和9941-11001-pSIMPLE 。對(duì)MM1775 株基因組序列進(jìn)行單一限制性酶切位點(diǎn)分析，選取6237（EcoR V）、8283（KpnI）、9087（EcoR I）位點(diǎn)引入其他酶切位點(diǎn)后進(jìn)行亞克隆。分別以得到的重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)融合PCR擴(kuò)增并克隆得到重組質(zhì)粒1106-3827-pSIMPLE。同樣以分段克隆質(zhì)粒為模板經(jīng)融合PCR擴(kuò)增得到 3352-6237 -pSIMPLE（3'端引入NotI 酶切位點(diǎn)）、6237-8283 -pSIMPLE（3'端引入多克隆位點(diǎn) EcoRV和 NotI）、8059-9087-pSIMPLE、9061-11001-pSIMPLE（3'端引入NotI位點(diǎn)），對(duì)重組質(zhì)粒和目的片段依次進(jìn)行雙酶切、純化回收目的片段、連接、轉(zhuǎn)化等亞克隆步驟得到重組質(zhì)粒3352-11001-pSIMPLE。

1.6 TMUV MM1775株全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增 以1-1174-pSIMPLE、1106-4567-pSIMPLE和3352-11001-pSIMPLE質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR、電泳、割膠回收得到MM1775-1-1174、MM1775-1106-456和MM1775-3549-11001，以MM1775-1-1174和（5'端添加保護(hù)性堿基和T7啟動(dòng)子序列）和MM1775-3827R為上下游引物（表1）經(jīng)融合PCR擴(kuò)增得到MM1775-T7-3827。以MM1775-T7-3827和MM1775-3549-11001兩個(gè)回收后的DNA片段作為模板經(jīng)過2輪PCR得到MM1775-T7-11001。反應(yīng)體系：5μL10×pfu Buffer、5 μL 2.5mmol/L dNTP Mix、1 μL Pfu Polymerase、39 μL等摩爾比的 MM1775-T7-3827和MM1775-3549-11001。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；（94℃，30s；68℃，12min）×15個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。以上一輪PCR反應(yīng)液為模板，反應(yīng)體系：5 μLdNTP Mix （2.5 mmol/L） dNTP Mix、5 μ L10×pfu Buffer、1μL pfuDNA聚合酶、2μL第一輪PCR反應(yīng)液、2μL上游引物、2μL下游引物，H2O補(bǔ)齊至50μL。反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性2min；（94℃，30 s；68℃，16 min）×30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。進(jìn)行凝膠核酸電泳后，回收長(zhǎng)度為11 001 bp的目的片段。

表 1 MM1775基因組分段 PCR 引物Table 1 Primers for RT-PCR in this study

1.7 轉(zhuǎn)染 以5'端添加T7啟動(dòng)子序列的 MM1775株全長(zhǎng)cDNA為模板，用mMESSAGEmMACHINE?T7 Kit試劑盒對(duì) cDNA 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得具有感染性的RNA；經(jīng)氯化鋰沉淀、純化后，利用Lipofectamine LTX & Plus Reagent將感染性RNA轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后觀察轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞是否出現(xiàn)病變，當(dāng)病變達(dá)到90%時(shí)收集細(xì)胞上清接種新的DF-1細(xì)胞，并將拯救的病毒命名為vMM1775。

1.8 rMM1775 IFA檢測(cè) 接種后72 h收集細(xì)胞上清，對(duì)病變細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)（indirect immunoinfluscent assay， IFA）耐藥率相對(duì)較高:4%多聚甲醛固定30min；PBS洗滌3次，每次3min（下同）；0.5%TritonX-100通透10min，PBS洗滌；1%BSA封閉30 min，PBS洗滌；抗坦布蘇E蛋白單克隆抗體（1F5），37℃孵育1h，PBS洗滌；400倍稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，PBS洗滌；倒置熒光顯微鏡下觀察有無特異性熒光。

1.9 拯救病毒rMM1775分段PCR鑒定 對(duì)上述收集的細(xì)胞上清進(jìn)行RNA抽提，分段RT-PCR后，對(duì)目的條帶回收，經(jīng)測(cè)序及序列拼接后，得到rMM1775的全基因組序列。

圖 1 MM1775 株基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Amplified fragment of MM1775 genome

2 結(jié)果

2.1 DTMUV MM1775 株全長(zhǎng)cDNA 的擴(kuò)增結(jié)果 以MM1775-1-1174和MM1775-1106-4567為模板，MM1775-T7-1F（5'端添加保護(hù)性堿基和T7啟動(dòng)子序列）和MM1775-3827R為上下游引物經(jīng)融合PCR擴(kuò)增得到MM1775-T7-3827。以3352-11001-pSIMPLE為模板，MM1775-3352F和MM1775-11001R為上下游引物擴(kuò)增得到MM1775-3352-11001。以MM1775-T7-3827和MM1775-3352-11001為模板經(jīng)兩輪融合PCR后，得到5'端含有T7啟動(dòng)子序列的MM1775株全基因組cDNA（圖1）。

2.2 拯救病毒rMM1775致DF-1細(xì)胞病變將感染性RNA轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后48h，部分細(xì)胞出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、脫落，有些形成合胞體（圖2），至84 h，細(xì)胞病變達(dá)到90%，拯救的病毒命名為rMM1775。

2.3 rMM1775 IFA鑒定結(jié)果 將細(xì)胞病變達(dá)到90%的轉(zhuǎn)染孔上清液接種DF-1細(xì)胞后72h，細(xì)胞仍然出現(xiàn)病變，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行IFA，感染細(xì)胞呈現(xiàn)特異性綠色熒光，而陰性對(duì)照孔中并沒有出現(xiàn)特異性綠色熒（圖3）。

2.4 rMM1775基因組分段RT-PCR和序列結(jié)果 對(duì)拯救病毒rMM1775進(jìn)行RNA抽提，經(jīng)RT-PCR鑒定（圖4）及序列測(cè)定顯示，rMM1775的序列和親本MM1775株病毒序列一致。

綜上可見，TMUV Marker （DL5000）MM1775株病毒全長(zhǎng)cDNA拯救病毒成功。成功建立TMUV MM1775株反向遺傳操作系統(tǒng)。

圖 2 rMM1775 致 DF-1 病變（轉(zhuǎn)染后 48 h）Fig. 2 CPE of DF-1 cells infeeted with rMM1775（48 h post-transfection）

圖3 拯救病毒rMM1775 IFA 結(jié)果Fig. 3 IFA result of rMM1775 strain

圖4 拯救病毒 rMM1775 株基因組 RT-PCR鑒定結(jié)果Fig. 4 RT-PCR result of rMM1775 strain genome

3 討論

坦布蘇病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬，該屬的病毒全基因組cDNA全長(zhǎng)或部分克隆存在不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，在大腸桿菌中容易發(fā)生突變、重排等變異，這些變異會(huì)對(duì)病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程產(chǎn)生重要影響，從而難以得到黃病毒的感染性克?。?8］。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的可能原因是克隆的目的片段對(duì)大腸桿菌具有毒性，可使大腸桿菌死亡或病毒產(chǎn)生適應(yīng)性突變［19］。

目前，黃病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)的建立主要有兩種方法：一種是將病毒的全基因組序列克隆至含有真核啟動(dòng)子的載體中，將重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染至細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)獲得感染性cDNA［20］；另一種是將病毒的全基因組序列和啟動(dòng)子序列一起克隆至低拷貝質(zhì)粒中，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后獲得病毒的感染性RNA［21］，但是用該方法構(gòu)建的鴨坦布蘇病毒JXSP株感染性cDNA具有多處隨機(jī)突變［22］，由此cDNA克隆拯救得到的病毒恢復(fù)株與原毒株序列不完全相同，這不利于對(duì)病毒致病性的研究。

本研究通過分段克隆的方式構(gòu)建出3個(gè)涵蓋全基因組序列的重組質(zhì)粒，然后以此為模板，采用高保真DNA聚合酶直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到序列完全沒有改變的病毒基因組的全長(zhǎng)cDNA，并以此為基礎(chǔ)，首次建立了鴨坦布蘇病毒MM1775株的反向遺傳操作系統(tǒng)，由此系統(tǒng)拯救得到的病毒恢復(fù)株不含有任何突變，生物學(xué)特性與原毒株一致。

在此基礎(chǔ)上，可通過研究坦布蘇病毒MM175株拯救毒rMM1775與鴨坦布蘇病毒FX2010株對(duì)不同動(dòng)物的致病性差異，再將兩株病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)［23，24］相互結(jié)合，通過替換基因序列，構(gòu)建重組病毒，研究相關(guān)氨基酸變異對(duì)病毒致病性的影響，從而進(jìn)一步闡明坦布蘇病毒的致病性差異的分子機(jī)制。

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ESTABLISHMENT OF REVERSE GENETICS SYSTEM FOR TEMBUSU VIRUS STRAIN MM1775

YAN Da-wei， WU Xiao-gang， LI Xue-song， SHI Ying， FENG Lin-lin， CUI Hong-rui，LI Guo-xin， LI Ze-jun
（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

The cDNA of Tembusu virus strain MM1775， were inserted segmentally into 3 plasmids， by PCR amplification， cloning and sub-cloning methods. The full-length cDNA， with T7 promoter sequence added at 5 'ends， was amplified by infusion-PCR using the recombinant plasmids as templates and transfected in vitro to produce the virus RNA， which was then transfected into DF-1 cells to rescue virus. Detectable cytopathic effect （CPE） was found at 48 hours post-transfection. To test the rescued virus， fresh DF-1 cell were infected with the supernatant of transfected-cell culture when 90% transfected-cells showed CPEs. Specific green fluorescence could be detected in the newly infected cells by indirect immuno fluorescence （IFA） and specic RT-PCR products could be amplified from the supernatants at 72 hours post-infection， suggesting the success of MM1775 rescue. Sequence analysis confirmed the rescued virus have no unexpected nucleotide change comparing with its parental virus. The establishment of the reverse genetics system of MM1775 settled the foundation for further study on the molecular basis of the pathogenicity of Tembusu virus.

Tembusu virus； MM1775； reverse genetics system

S852.659.6

A

1674-6422（2015）04-0008-06

2015-04-07

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（31172332）

閆大為，男，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李澤君，E-mail:lizejun@shvri.com.cn