仔豬源大腸桿菌耐藥性分析

常曉敬

(盧龍縣職業(yè)技術教育中心，河北秦皇島066400)

為了解河北省仔豬源大腸桿菌耐藥現狀及耐藥質粒的分布情況，本試驗運用K-B 法對分離自河北省十個不同市縣的已經過系統(tǒng)鑒定和致病性檢驗的40 株仔豬源大腸桿菌進行了22種常見抗菌藥的藥敏試驗，并提取質粒，進行質粒譜型分析，初步探討大腸桿菌耐藥性與質粒圖譜之間的關系。結果顯示:40 株菌均為多重耐藥菌株，6 耐和7 耐的居多，占了總數的42.5%，其中對氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、復方新諾明耐藥率較高，分別達到了95%，87.5%，85%和72.5%；對卡那霉素、慶大霉素、氯霉素和強力霉素耐藥率也達到了40%以上。

1 緒論

由腸毒素性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉在我國及世界各地均有發(fā)生，每年死亡的仔豬中約有50%與此有關。隨著養(yǎng)豬業(yè)向規(guī)模化發(fā)展，飼養(yǎng)密度不斷增加，仔豬大腸桿菌性腹瀉有明顯上升的趨勢，我國大多數省、市、自治區(qū)均有不同程度的發(fā)生與流行，該病已成為養(yǎng)豬業(yè)一個有重要經濟意義的疾病。目前，對于仔豬大腸桿菌性腹瀉病的防治主要是以注射疫苗以及應用抗菌藥物為主要手段，但隨著抗菌藥物長期大量廣泛應用，大腸桿菌耐藥株不斷出現，耐藥譜不斷擴大，使得大腸桿菌病成了疫病防制中的一大難題，嚴重困擾著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。為控制大腸桿菌耐藥性的蔓延，加強對沙門氏菌耐藥性的監(jiān)測力度和大腸桿菌耐藥機制的研究迫在眉睫。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗菌株

來自河北省邯鄲市、秦皇島昌黎縣、秦皇島撫寧縣、張家口市等幾個不同市縣的已經過系統(tǒng)鑒定和致病性檢驗的豬源大腸桿菌20 株。

2.1.2 標準質控菌株

大腸桿菌ATCC25922 由本校預防獸醫(yī)學實驗室保存。

2.1.3 培養(yǎng)基及藥品試劑

Mue11er-Hinton（MH）培養(yǎng)基、LB 肉湯、入DNA/HindⅢ、瓊脂糖、TAE、凝膠載樣緩沖液、22種藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；相關試劑配置均按常規(guī)方法配置。

2.1.4 儀器

TGL-16 型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO－BEST200E），美國西盟生產；凈化工作臺（SW-CJ-ZFD 雙人單面），蘇凈集團安泰公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-103B），上海智城分析儀器制造有限公司等。

2.2 抗生素敏感性試驗

采用NCCLS 推薦的瓊脂擴散法（K-B）測定已經生化鑒定和致病性檢驗的40 株豬源大腸桿菌對22 種常用抗菌類藥物的敏感性。從培養(yǎng)了16～24 小時的麥康凱瓊脂平板上，挑出單個菌落，直接用生理鹽水制成0.5 麥氏單位。在15 分鐘內，用無菌棉拭子蘸取調好的菌液，在MH 瓊脂培養(yǎng)基表面涂布接種，將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。紙片一旦與平板接觸，不應再移動。37℃培養(yǎng)18～20 小時以后，測量各藥敏紙片抑菌圈直徑，同時以大腸桿菌ATCC25922 進行質控。參照NCCLS（2009）公布的標準以敏感、中介、耐藥三種形式對抑菌圈作出判定，個別NCCLS（2009）沒有列出但我國人醫(yī)或獸醫(yī)仍使用的藥物按杭州天和微生物試劑有限公司提供的標準解釋，見表1。

表1 藥敏試驗的判定標準

3 結果與分析

3.1 藥敏試驗結果

20 株致病性大腸桿菌對7 種臨床常用藥物的藥敏試驗結果見表2。20 菌株中對氨芐西林、阿莫西林、復方新諾明耐藥率較高，分別達到了95%，87.5%和72.5%；對頭孢菌素類藥物的耐藥率低于10%。

表2 20 株豬源大腸桿菌的耐藥情況

3.2 大腸桿菌的耐藥譜及多重耐藥情況

20 株豬源大腸桿菌對7 種藥物的耐藥譜及多重耐藥性情況可看出：20 株豬源大腸桿菌分離株共有26 種耐藥譜，耐藥譜完全相同的分離株最多4 株，大多數分離株都具有不同的耐藥譜。

可知20 株大腸桿菌分離株均為多重耐藥菌株，平均每株菌耐藥5～6 種，最少為2 種，最多為10 種，6 耐和7 耐的居多，占了總數的42.5%，這與一些抗菌藥物在生產中的長期使用有關。

4 討論與小結

本試驗中，臨床分離的20 株仔豬源大腸桿菌均為耐藥菌，共有26 種耐藥譜。這些耐藥菌株中，無單耐菌株。6 耐和7 耐的居多，占了總數的42.5%，耐藥性產生嚴重的抗生素是磺胺類藥物、四環(huán)素類、青霉素類藥物，耐藥率達到了70%以上，說明仔豬源大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為主，且耐藥現象非常嚴重和普遍。這與養(yǎng)豬場在豬病預防治療上使用以上抗生素，并在飼料中長期添加四環(huán)素類、阿莫西林等青霉素類抗生素有著密切的聯系。張鐵等（2005）從河北、北京、天津地區(qū)發(fā)生仔豬黃、白痢的十個豬場分離60 株大腸桿菌，對其耐藥性進行了監(jiān)測與分析。結果發(fā)現：耐藥率較高的分別為鏈霉素(80%)、慶大霉素(53.3%)、氨芐青霉素(75%)、復方新諾明(86.7%)、痢菌凈(76.7%)、呋喃唑酮(71.2%)、諾氟沙星、環(huán)丙沙星(51.7%)、喹乙醇(75%)和洛美殺星(70%)氟苯尼考(55%).60 株大腸桿菌多數為6 耐以上的菌株(80%),其中8 耐、10 耐、6 耐最高分別為17%、15%、12%。邢艷蘋等（2010）對吉林分離出的113 株動物源性大腸桿菌耐藥性進行分析，結果表明：113 株均表現出不同程度的耐藥，耐藥譜廣，且多表現為多重耐藥。大腸桿菌具有廣泛的耐藥性，推測這種現象的原因可能是：①我國養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物使用不規(guī)范，存在盲目性，正常大腸桿菌對環(huán)境適應性增強，易產生耐藥性。②耐藥質粒在細菌間的水平傳播也是細菌產生耐藥性的一個重要原因。耐藥質?？删幋a細菌對藥物的耐藥性，耐藥質粒可以在不同的細菌之間傳遞，通過耐藥質粒的傳遞，耐藥基因也就完成細菌間的廣泛傳播。