mTOR、eIF4E在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

雷華文 馬秀現(xiàn) 宋黎明 孫玉嶺

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 河南鄭州 450052;2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 肝膽胰外科 河南鄭州 450007)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病和死亡均具有明顯的地域分布特征，河南省作為人口大省，原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病率一直位于我國前列。目前，臨床上對(duì)于肝癌的常用治療方法主要是手術(shù)切除、介入手術(shù)治療及放化療，但治療效果均欠佳。細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)的合成為腫瘤細(xì)胞分裂增殖所必不可少的條件［1］。近年發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞分裂、增殖的過程中，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)及異常激活的真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)的調(diào)控作用均至關(guān)重要。因此，探索原發(fā)性肝細(xì)胞癌mTOR、eIF4E 的表達(dá)以及其侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，對(duì)于找到有助于原發(fā)性肝癌早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)以及探尋新的治療途徑有著非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年6月至2013年7月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的45例肝細(xì)胞癌患者，術(shù)前均行CT 或MRI 檢查，均為第1 次手術(shù)治療，術(shù)前均未接受任何形式的放療和化療，病理學(xué)檢查均證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。其中男31例，年齡29～68 歲，平均(48.36±2.13)歲;女14例，年齡32～73歲，平均(51.41±3.17)歲。手術(shù)完成后，所有標(biāo)本均先給予0.9%氯化鈉溶液沖洗以去除血污，然后修剪除去壞死組織，再用10%福爾馬林保存固定，最后在1 周內(nèi)完成石蠟包埋，連續(xù)切片。Edmondson 病理分級(jí):高分化11例，中分化17例，低分化17例。TNM 分期:Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期13例。

1.2 檢測方法 將標(biāo)本分為3 組。肝細(xì)胞癌(HCC)組:HCC 腫瘤組織標(biāo)本45例;癌旁肝組織組:距離腫瘤邊緣1～2 cm 的肝臟組織30例;遠(yuǎn)癌肝組織組:距離腫瘤邊緣組織＞5 cm 肝組織30例。全部標(biāo)本組織固定、常規(guī)脫蠟、脫水、透明、封片、石蠟包埋。免疫組化采用SP 法，mTOR 兔多克隆抗體和eIF4E 兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，免疫組化SP 試劑盒購自北京中杉生物工程公司，DAB 顯色試劑盒購自北京中杉生物工程公司。操作均按說明進(jìn)行，每組采用已知的mTOR 與eIF4E 的陽性片(乳腺癌)作為陽性對(duì)照，分別以PBS、同源正常IgG 兔的血清替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果分析 高倍鏡下，細(xì)胞內(nèi)mTOR 和elF4E 均大量定位于細(xì)胞質(zhì)，elF4E 少量定位于細(xì)胞核，陽性信號(hào)為細(xì)胞胞漿染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色。高倍鏡下觀察mTOR 和eIF4E 免疫組化結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像采用Biosens Digital Imaging System v1.6 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。mTOR 和eIF4E 免疫組化結(jié)果的染色標(biāo)記強(qiáng)度用平均灰度值(average aensity)表示，染色標(biāo)記越強(qiáng)，平均灰度值越大，比較各實(shí)驗(yàn)組陽性表達(dá)區(qū)域平均灰度值的差異，同時(shí)分析在同一組織內(nèi)mTOR和eIF4E 表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，灰度值用(±s)表示，癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)癌組織3 組灰度值比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用Bonferroni 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，兩組變量間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mTOR、eIF4E 染色情況 在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌肝組織組中，mTOR 的陽性信號(hào)呈棕黃色或黃色，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見圖1、2、3。eIF4E 陽性信號(hào)呈棕黃色或黃色，大部分eIF4E 蛋白以彌漫性分布或散在顆粒狀分布存在于胞漿中，只有少部分分布于胞核中，見圖4、5、6。

圖1 mTOR 在肝癌肝組織中的表達(dá)(SP×400)

圖2 mTOR 在肝癌肝組織中的表達(dá)(SP×400)

圖3 mTOR 在癌旁肝組織中的表達(dá)(SP×400)

圖4 eIF4E 在遠(yuǎn)癌肝組織中的表達(dá)(SP×400)

圖5 eIF4E 在癌旁肝組織中的表達(dá)(SP×400)

圖6 eIF4E 在癌旁肝組織中的表達(dá)(SP×400)

2.2 mTOR、eIF4E 表達(dá)情況 癌、癌旁、遠(yuǎn)癌組織中mTOR、eIF4E 的表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FmTOR=261.985、FeIF4E=155.601，P 均＜0.001)。進(jìn)一步兩兩比較，癌與癌旁組、癌與遠(yuǎn)癌組、癌旁與遠(yuǎn)癌組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.001)，見表1、2、3。

2.3 mTOR 和eIF4E 表達(dá)的相關(guān)性 定量分析得到的3 組數(shù)據(jù)分別行兩因子相關(guān)性分析，其中癌組織rs=0.315，P=0.006;癌旁組織rs=0.445，P =0.003;遠(yuǎn)癌組織rs=0.392，P =0.014。在癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織中兩種因子的相關(guān)分析，P 均＜0.05，rs均為正數(shù)，在3 組組織中mTOR 和eIF4E 表達(dá)均存在相關(guān)性，且呈正相關(guān)。

表1 mTOR、eIF4E 在癌、癌旁、遠(yuǎn)癌組織中的灰度值比較(±s，%)

表1 mTOR、eIF4E 在癌、癌旁、遠(yuǎn)癌組織中的灰度值比較(±s，%)

組別 n mTOR eIF4E癌組45 159.64±22.51 147.03±25.13癌旁組 30 66.41±4.62 91.32±9.58遠(yuǎn)癌組 30 22.35±5.87 21.75±6.03 F 261.985 155.601 P ＜0.001 ＜0.001

表2 mTOR 在各組中表達(dá)的Bonferroni 檢驗(yàn)結(jié)果

表3 eIF4 在各組中表達(dá)的Bonferroni 檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在細(xì)胞分裂、生長及增殖過程中，mTOR 的調(diào)控作用至關(guān)重要。mTOR 是細(xì)胞開啟蛋白質(zhì)翻譯過程的閘門，并且提供必需物質(zhì)保證細(xì)胞由G0 /G1 期正常進(jìn)入S 期，所以其是細(xì)胞內(nèi)分解代謝和合成代謝過程中的控制臺(tái)。其活性作用主要受PI3K/AKT 和AMPK 兩條途徑調(diào)節(jié)，mTOR 激酶的活性受到FATC 與FAT 結(jié)構(gòu)在分子內(nèi)部協(xié)同作用的調(diào)節(jié)，而這則是必須由FATC 與FAT 相結(jié)合作為基礎(chǔ)的［2］，而在細(xì)胞多種不同信號(hào)的共同刺激下，細(xì)胞內(nèi)對(duì)mTOR 的調(diào)節(jié)主要是通過PI3K/AKT 及AMPK 通路途徑發(fā)揮作用的。一般情況下，體內(nèi)分泌的生長因子可以通過激活PI3K 途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)mTOR 的激活。AKT 通過兩種方式激活mTOR:一種是直接磷酸化激活mTOR;另一種是通過磷酸化TSC1/TSC2 二聚體，并抑制其活性，來實(shí)現(xiàn)對(duì)mTOR 途徑的調(diào)節(jié)［3－4］。當(dāng)AMP 的數(shù)量增多，而ATP的數(shù)量下降時(shí)，AMPK 通路活性被激活，被激活后的AMPK 可以通過磷酸化途徑激活TSC1/TSC2 二聚體，進(jìn)而抑制mTOR 活性的表達(dá)。

eIF4E 之所以能夠參與mRNA 翻譯的啟動(dòng)，完全是因?yàn)槠淇梢蕴禺愋缘亟Y(jié)合mRNA5’端帽結(jié)構(gòu)［5］，其對(duì)ATP 具有依賴性。mTOR 活化后可磷酸化的兩個(gè)下游分子，翻譯抑制分子eIF4E 結(jié)合蛋白(4EBPS)和核糖體蛋白p70S6K，4EBPS 磷酸化后失活，因而降低eIF4E 的結(jié)合能力，使eIF4E 與之分離，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯。而與此相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道表明，mTOR 和eIF4E 在浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)增加可能與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)［6］。mTOR 的抑制劑最近被發(fā)現(xiàn)對(duì)各種非霍奇金淋巴瘤(NHLS)具有確切的治療效果，如雷帕霉素和依維莫司，已被用作癌癥的治療而取得一定的成功，在此過程中進(jìn)一步證實(shí)抑制eIF4E 的活性是抑制mTOR 的關(guān)鍵效應(yīng)物［7－8］。國內(nèi)亦有研究表明，mTOR 信號(hào)通路在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中同樣具有重要作用［9］。隨著研究的進(jìn)展，分子靶向治療有望取得更大進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mTOR 和eIF4E 在原發(fā)性肝癌組織中高表達(dá)，說明細(xì)胞蛋白質(zhì)合成抑制減弱，且二者升高呈現(xiàn)正相關(guān)，在肝癌發(fā)展的過程中可能具有一定的協(xié)同作用。mTOR 的異常激活致使下游底物4EBPS蛋白磷酸化失活，釋放與其結(jié)合的eIF4E，加快細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長和惡性轉(zhuǎn)化［10］。mTOR 和eIF4E 在原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，如今對(duì)于mTOR 與eIF4E 的信號(hào)傳導(dǎo)過程已有較深的認(rèn)識(shí)，如何阻斷傳導(dǎo)過程可能成為將來肝細(xì)胞癌藥物治療的新方向。

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