新鮮冰凍血漿對(duì)腦損傷合并失血性休克大鼠的治療作用

范超勇 李東朋 郭德偉 田毅 姚寧 齊偉 楊波

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450051)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)合并失血性休克(hemorrhagic shock，HS)病情較嚴(yán)重、死亡率高［1］，早期液體復(fù)蘇對(duì)于挽救患者生命尤為重要。目前常用的輸注大量晶體液復(fù)蘇易引起細(xì)胞外水腫、酸中毒［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，普通膠體液會(huì)引起凝血機(jī)制障礙，對(duì)腦組織的保護(hù)作用不明顯［3－4］。Hwabejire 等［5］采用新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)復(fù)蘇TBI合并HS 豬模型，發(fā)現(xiàn)FFP 通過改善腦灌注，減少谷氨酸鹽介導(dǎo)的神經(jīng)毒性從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。但FFP作為復(fù)蘇液體，對(duì)TBI 合并HS 的治療作用尚不明確。本研究通過采用FFP 給予TBI 合并HS 大鼠早期復(fù)蘇，觀察其對(duì)大鼠腦水腫、血腦屏障、神經(jīng)功能、神經(jīng)細(xì)胞生存狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 133 只健康雌性SD 大鼠，體質(zhì)量240～280 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(豫)2010－0002。25 只采用Aghaloo 法制備新鮮冰凍血漿，余108 只隨機(jī)分為3 組:sham(假手術(shù)組)組(18 只)，vehicle(生理鹽水復(fù)蘇組)組與FFP(新鮮冰凍血漿復(fù)蘇組)組(各45 只)。10%水合氯醛與4%多聚甲醛(天津登科)，0.5%伊文氏藍(lán)染液(LEAGENE，DK0001)與尼氏染色液(碧云天，C0117)，大鼠腦立體定位儀，低溫離心機(jī)(Eppendorf AG22331Hamburg)、多通道生理信號(hào)記錄儀(成都泰盟BL－420E +)、美國(guó)哈希DR3900 分光光度計(jì)。

1.2 新鮮冰凍血漿的制備及檢測(cè) SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(4 ml/kg)，無菌條件下每只大鼠心室內(nèi)采血10.0 ml，加10%枸櫞酸鈉抗凝，低溫離心機(jī)中3 838 ×g 離心15 min 后分離血漿，－80 ℃冰箱迅速冰凍為FFP，用時(shí)37 ℃水浴箱搖床融化。

1.3 動(dòng)物模型制作及分組干預(yù) SD 大鼠麻醉后Feeney 改良法［6］制作顱腦損傷模型，用一重20 g 砝碼自40 cm 高處自由落下。術(shù)畢參照Wiggers 改良法［7］制作失血性休克大鼠模型。sham 組僅打開骨窗;vehicle、FFP 組制作創(chuàng)傷性腦損傷和失血性休克模型，休克期間維持MAP 于40 mm Hg 水平，持續(xù)60 min 后vehicle 組給予3 倍失血量的生理鹽水，F(xiàn)FP 組給予等于放血量的新鮮冰凍血漿，均30 min 輸注完畢，持續(xù)監(jiān)測(cè)MAP、HR 至蘇醒。

1.4 大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià) 采用mNSS 對(duì)大鼠的神經(jīng)功能行為進(jìn)行評(píng)定。對(duì)各組大鼠在損傷前及復(fù)蘇后1、3、7 d 進(jìn)行神經(jīng)功能測(cè)定，分值越高，損傷越重。

1.5 腦水腫水平評(píng)估及血腦屏障通透性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)各組術(shù)后1、3、7 d 麻醉處死，干濕重法測(cè)量腦組織含水量;各組術(shù)后2、6、12、24、72 h 麻醉處死，溴化乙錠(EB)染色法定性定量檢測(cè)血腦屏障完整性。分光光度計(jì)檢測(cè)樣品光密度值。四參數(shù)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本EB 含量(μg/g)。

1.6 取材尼氏染色 傷后7 d 生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注取腦，脫水后石蠟包埋，冠狀位石蠟切片，片厚4 μm，甲苯胺藍(lán)染色法染色。于顯微鏡下觀察DG 區(qū)、CA1 區(qū)、CA3 區(qū)細(xì)胞變化并對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用Imaging－Pro－Plus (LEIKADMLB)軟件對(duì)切片進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 法，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新鮮冰凍血漿理化檢測(cè)情況 外觀黃色澄清液體，無色澤異常，無蛋白析出、重度乳糜，血漿蛋白含量≥50 g/L，Ⅷ因子≥0.7 IU/ml，無細(xì)菌污染。

2.2 腦水腫程度及血腦屏障通透性的檢測(cè) 1、3、7 d時(shí)vehicle 組與FFP 組較sham 組腦組織含水量明顯升高(P ＜0.05)，1、3、7 d 時(shí)FFP 組腦水腫程度均高于vehicle 組(P ＜0.05)(圖1)。EB 染色法測(cè)定腦組織EB 含量，2、6、12、24、72 h 時(shí)vehicle 組與FFP 組血腦屏障通透性較sham 組顯著增加(P ＜0.05);2 h 及6 h時(shí)vehicle 組與FFP 組EB 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);12、24、72 h 時(shí)各組EB 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且12、24、72 h 時(shí)FFP 組與vehicle 組EB 含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(圖2)。

圖1 各組1、3、7 d 時(shí)腦組織含水量的變化

圖2 各組2、6、12、24、72 h 時(shí)腦組織EB 含量變化

2.3 mNSS 神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果 mNSS 評(píng)分越高說明大鼠的神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重，越低說明損傷越輕。FFP 組與vehicle 組在1 d 時(shí)mNSS 神經(jīng)功能評(píng)分顯著增高，3 d 后下降。3、7 d 時(shí)FFP 組評(píng)分均低于vehicle組(P ＜0.05)(圖3)。

2.4 DG 區(qū)、CA1 區(qū)、CA3 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞生存情況sham 組Nissl 染色可見DG 區(qū)、CA1 區(qū)、CA3 區(qū)較多排列緊密錐體細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、染色質(zhì)均勻分布，胞漿內(nèi)含大量的尼氏小體。與sham 組相比，vehicle 組及FFP 組各區(qū)神經(jīng)元大量脫失、排列疏松，輪廓模糊、界限不清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);vehicle 組與FFP 組相比，神經(jīng)元數(shù)目更少，排列更加疏松，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表1)。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組在1、3、7 d 時(shí)mNSS 神經(jīng)功能評(píng)分情況

表1 FFP 對(duì)腦損傷大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)域神經(jīng)元存活的影響(±s)

表1 FFP 對(duì)腦損傷大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)域神經(jīng)元存活的影響(±s)

注:與sham 組比較，aP ＜0.05;與vehicle 組比較，bP ＜0.05。

組別 DG 區(qū) CA1 區(qū) CA3區(qū)sham 組2 585±142 1 931±134 1 786±86 vehicle 組 1 362±111a 1 090±210a 951±63a FFP 組 1 933±158ab 1 522±179ab 1 255±97 ab

3 討論

腦損傷合并失血性休克將加劇創(chuàng)傷患者的總體死亡率和致殘率［8］。有效的液體復(fù)蘇可以恢復(fù)并保持全身和腦循環(huán)，支持組織灌注和氧輸送，并減少誘發(fā)低血壓和腦缺氧長(zhǎng)期神經(jīng)損傷［9］。目前，臨床上常用的復(fù)蘇液體主要有晶體液和膠體液，晶體液包括生理鹽水、乳酸林格氏液及高滲鹽液等;膠體液主要分為人工膠體(白蛋白)和天然膠體(右旋糖酐、明膠、羥乙基淀粉)。最近的研究指出，在重大創(chuàng)傷休克患者的救治過程中，晶體液應(yīng)盡量減少應(yīng)用，因?yàn)榇罅康木w復(fù)蘇與炎癥反應(yīng)和組織水腫、腫脹相關(guān)，主張選用血液制品，如濃縮紅細(xì)胞(PRBC)和FFP 的控制復(fù)蘇［10－11］。給予HS 患者大量生理鹽水輸注雖能夠暫時(shí)性維持血壓，但快速擴(kuò)容造成自身血管內(nèi)細(xì)胞及血漿成分稀釋，晶體液快速滲透到組織間隙，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并引起組織間隙水腫，導(dǎo)致二次損傷［8］，對(duì)生理鹽水與白蛋白休克復(fù)蘇進(jìn)行比較，表明采用生理鹽水復(fù)蘇的死亡率更高［12］。一些研究表明，膠體復(fù)蘇可以維持和增加血漿膠體滲透壓，減少血管內(nèi)流體外滲進(jìn)入腦間質(zhì)，減輕腦腫脹，改善腦功能［13－14］。但有研究采用白蛋白進(jìn)行復(fù)蘇，患者死亡率增加，可能原因是膠體液穿透破壞的血腦屏障，到達(dá)損傷區(qū)域，降解產(chǎn)物的形成促進(jìn)組織水腫，加重腦損傷［5］。

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)在不可逆性原發(fā)性損傷之后，海馬神經(jīng)元進(jìn)行性死亡是顱腦外傷后的重要病理特征。研究證實(shí)TBI 后海馬CA1、CA3 和齒狀回等部位神經(jīng)細(xì)胞丟失，突觸傳遞功能的改變是造成認(rèn)知記憶障礙的原因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，采用FFP 液體復(fù)蘇可以增加血漿及腦組織血小板活性，改善腦血流灌注，減少谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性繼發(fā)性腦損傷，降低線粒體功能障礙，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［14］。因此，改善腦外傷后腦組織灌注、減輕腦水腫、改善血腦屏障通透性可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，腦損傷合并失血性休克發(fā)生后應(yīng)用新鮮冰凍血漿復(fù)蘇較普通晶體液可有效減輕大鼠腦組織的水腫，改善血腦屏障的通透性。應(yīng)用FFP 復(fù)蘇組大鼠的神經(jīng)功能改善情況優(yōu)于生理鹽水復(fù)蘇組，并且DG 區(qū)、CA1 區(qū)、CA3 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)較生理鹽水復(fù)蘇組有明顯改善。

綜上所述，對(duì)腦損傷合并失血性休克大鼠，新鮮冰凍血漿有減輕腦水腫、降低血腦屏障通透性、改善神經(jīng)功能作用，為臨床救治此類重大創(chuàng)傷患者提供了一個(gè)新的思路，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

［1］ Kauvar D S，Lefering R，Wade C E.Impact of hemorrhage on trauma outcome:an overview of epidemiology，clinical presentations，and therapeutic considerations［J］.J Trauma，2006，60(6 Suppl):S3－S11.

［2］ Martini W Z.Coagulopathy by hypothermia and acidosis:mechanisms of thrombin generation and fibrinogen availability［J］.J Trauma，2009，67(1):202－209.

［3］ Alam H B，Bice L M，Butt M U，et al.Testing of blood products in a polytrauma model:results of a multi－institutional randomized preclinical trial［J］.J Trauma，2009，67(4):856－864.

［4］ Ertmer C，Kampmeier T，Rehberg S，et al.Fluid resuscitation in multiple trauma patients［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2011，24(2):202－208.

［5］ Hwabejire J O，Imam A M，Jin G，et al.Differential effects of fresh frozen plasma and normal saline on secondary brain damage in a large animal model of polytrauma，hemorrhage and traumatic brain injury［J］.J Trauma Acute Care Surg，2013，75(6):968－975.

［6］ 張榮軍，游潮，蔡博文，等.Feeney 法建立大鼠閉合性腦損傷模型及評(píng)估［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2005，19(12):1015－1018.

［7］ 周俊，姚尚龍，楊承祥，等.6%羥乙基淀粉130/0.4 液體復(fù)蘇對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷合并失血性休克大鼠的腦保護(hù)作用［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2009，29(19):1030－1033.

［8］ Dekker S E，Sillesen M，Bambakidis T，et al.Treatment with a histone deacetylase inhibitor，valproic acid，is associated with increased platelet activation in a large animal model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock［J］.J Surg Res，2014，190(1):312－318.

［9］ Baker A J，Park E，Hare G M，et al.Effects of resuscitation fluid on neurologic physiology after cerebral trauma and hemorrhage［J］.J Trauma，2008，64(2):348－357.

［10］ Joseph B，Zangbar B，Pandit V，et al.The conjoint effect of reduced crystalloid administration and decreased damage－ control laparotomy use in the development of abdominal compartment syndrome［J］.J Trauma Acute Care Surg，2014，76(2):457－461.

［11］ Campion E M，Pritts T A，Dorlac W C，et al.Implementation of a military－derived damage control resuscitation strategy in a civilian trauma center decreases acute hypoxia in massively transfused patients［J］.J Trauma Acute Care Surg，2013，75(2 Suppl 2):S221－S227.

［12］ Myburgh J，Cooper D J，F(xiàn)infer S，et al.Saline or albumin for fluid resuscitation in patients with traumatic brain injury［J］.N Engl J Med，2007，357:874－884.

［13］ King D R，Cohn S M，Proctor K G.Changes in intracranial pressure，coagulation，and neurologic outcome after resuscitation from experimental traumatic brain injury with hetastarch［J］.Surgery，2004，136:355－363.

［14］ Jin G，Duggan M，Knightly T，et al.Traumatic brain injury and hemorrhagic shock:evaluation of different resuscitation strategies in a large animal model of combined insults［J］.Shock，2012，38(1):49－56.