不同磷水平下銅綠微囊藻對砷酸鹽的吸收和凈化

王振紅，羅專溪，車霏霏，嚴雅萌，顏昌宙*

（1.中國科學院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點實驗室，福建 廈門 361021；2.閩南師范大學化學與環(huán)境學院，福建 漳州 363000）

不同磷水平下銅綠微囊藻對砷酸鹽的吸收和凈化

王振紅1，2，羅專溪1，車霏霏1，嚴雅萌1，顏昌宙1*

（1.中國科學院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點實驗室，福建 廈門 361021；2.閩南師范大學化學與環(huán)境學院，福建 漳州 363000）

通過室內(nèi)培養(yǎng)實驗，研究了富磷（+P）和缺磷（-P）環(huán)境下，銅綠微囊藻對砷酸鹽（As（Ⅴ））的累積和凈化動力學特征，探討了凈化過程中培養(yǎng)介質(zhì)砷形態(tài)的變化.結(jié)果表明：缺磷環(huán)境下雖然可顯著提升銅綠微囊藻對砷酸鹽的吸收，但該環(huán)境下的高砷藻體又具較高的砷釋放風險.+P和-P環(huán)境下，藻體中分別有41.5%和46.3%的胞內(nèi)砷可在快速清除階段（2h）被迅速排出.+P環(huán)境下經(jīng)10μmol/L As（Ⅴ）暴露后的含砷藻體，經(jīng)13d凈化培養(yǎng)后，+P培養(yǎng)介質(zhì)中藻體以砷酸鹽釋放為主，-P培養(yǎng)介質(zhì)中則存在砷的還原和甲基化現(xiàn)象，這表明不同磷水平下藻體對砷的凈化機理可能存在明顯差異.

銅綠微囊藻；砷酸鹽（As（Ⅴ））；吸收動力學；凈化；磷

砷作為一種有毒、非必需的類金屬元素，被列為優(yōu)先控制污染物［1］.在天然淡水中，砷的濃度范圍大致在0.5～5000μg/L；相關(guān)污染源附近，砷含量甚至高達20mg/L［2］.砷在淡水環(huán)境中主要以砷酸鹽（As（V））形態(tài)存在［3-4］.磷是湖泊富營養(yǎng)化主要原因之一，由于其與砷具有相似的生物化學性質(zhì)，而在砷對植物體的毒性方面起著重要作用［5-6］.浮游藻類對As（V）的吸收可通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞，進而阻礙藻體的磷酸化反應(yīng)［7］.一般認為，在缺磷環(huán)境下，As（V）通過干擾生物體的代謝過程而致毒［8］.研究表明，外部磷濃度的增高可減少細胞對As（V）的吸收，從而降低砷的細胞毒性［9-11］.Hellweger等［12］提出在磷為限制因子時，藻類對As（V）的吸收與磷的吸收率有關(guān).目前，關(guān)于不同磷水平下真核浮游藻類對As（V）的生物累積動力學和效應(yīng)的研究已有相關(guān)報道［9］.然而，較少涉及原核藻類對As（V）的累積，尤其是含砷藻體砷凈化動力學的研究.銅綠微囊藻作為世界范圍內(nèi)普遍存在的藍藻水華優(yōu)勢藻種之一，其原核細胞的結(jié)構(gòu)使它對不良環(huán)境能產(chǎn)生較強適應(yīng)性，易引發(fā)有害藻類水華［13-14］.同時其對As（V）具有較高耐受性和較強的生物富集能力［15］.因此，本文以銅綠微囊藻為研究對象，探討不同磷水平下其對As（V）的吸收與凈化特征，為深入理解富營養(yǎng)化水體中砷的生物地球化學及其環(huán)境風險提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 銅綠微囊藻的來源和培養(yǎng)

銅綠微囊藻（M. aeruginosa）FACHB-905 購自中國科學院水生生物研究所國家淡水藻種庫.藻種置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件如下：溫度為25℃，光暗比為 16h：8h、光照強度為115μmol/（m2·s），每天震搖 3 次.不同磷水平的藻種培養(yǎng)分別采用富磷（+P， P濃度為5.3mg/L）和未添加磷（?P， P濃度＜0.01mg/L）的BG11培養(yǎng)基進行，并于4℃保存?zhèn)溆茫ㄋ迷噭┚鶠榉治黾儯?所有工作在超凈工作臺進行.

1.2 銅綠微囊藻對As（V）的吸收

取對數(shù)生長期的銅綠微囊藻細胞（藻密度為1×106cells/mL）在不同磷（±P）水平下，分別暴露于10μmol/L As（V）溶液中24h，于暴露后的第1，3，5，8，12，24h（均不含離心時間）進行取樣，觀察銅綠微囊藻對As（V）的吸收.6000r/min離心收集藻體，并經(jīng)滅菌超純水清洗后于冰磷酸鹽緩沖液（1mmol/L K2HPO4、5mmol/LMES（2-嗎啉乙磺酸）及0.5mmol/L Ca（NO3）2）中浸泡10min，以徹底清除體外殘留的砷，收集的藻體經(jīng)真空冷凍干燥后以測定胞內(nèi)砷的累積.

1.3 含砷銅綠微囊藻對砷的凈化

取±P條件下，經(jīng)10μmol/L As（V）暴露24h的銅綠微囊藻，進行含砷藻體砷的凈化實驗. 6000r/min離心收集藻體，經(jīng)超純水和冰磷酸鹽緩沖液分別清洗后，使其再懸浮于相應(yīng)磷水平不含砷的培養(yǎng)介質(zhì)中.凈化過程中培養(yǎng)介質(zhì)除無As（V）添加外，與吸收實驗相同.為確定單向、不同周轉(zhuǎn)相間的釋放速率［16］，藻體砷的凈化被設(shè)定為短期（0～2h）和長期（2～24h）2個階段進行分析.在每個取樣時間點，取10或20mL溶液測定其總砷含量及藻體胞內(nèi)殘留砷的百分比.

為進一步觀察含砷藻體凈化過程中砷的形態(tài)變化，取經(jīng)10μmol/L As（V）在+P環(huán)境下暴露24h后的藻體，經(jīng)超純水和冰磷酸鹽緩沖液分別清洗后，將其分別再懸浮于+P和?P的不含砷介質(zhì)中（培養(yǎng)液體積為200mL，藻細胞密度約為4× 106cells/mL），持續(xù)培養(yǎng)13d，分別在第1，3，5，7，9，11，13d進行取樣，觀察介質(zhì)中砷形態(tài)的變化.上述各實驗分別設(shè)3個平行處理.

1.4 測定方法

1.4.1 總砷的測定 銅綠微囊藻胞內(nèi)總砷含量需測定樣品參照Yin等［17］中的方法進行準備和分析.用CEM微波消解爐（CEM Microwave Technology Ltd）進行消解，用ICP-MS（Agilent 7500a）在氦氣模式下通過排除可能的40Ar35Cl干擾后進行砷的測定.質(zhì)量控制，選取1.0，10.0 μg/L的砷標樣，每10個樣品進行一次回測，使回收率在可接受范圍內(nèi)（90%～110%）進行樣品的分析測試.通過能代表浮游植物組織的標準物質(zhì)紫菜（GBW08521，國家標準物質(zhì)研究中心）中總砷含量的測定作為消煮過程和測定分析的質(zhì)量控制. 1.4.2 砷形態(tài)的測定 含砷藻液經(jīng)0.45μm一次性醋酸纖維素注射器式過濾器過濾，上清液避光于-20℃冰箱保存，并盡快完成測定.砷形態(tài)參照Zhu等［18-19］的分析方法，采用高效液相色譜—等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-ICP-MS）（Agilent LC1100系列和Agilent 7500a）進行測定.分離柱選用Hamilton公司的PRP（苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）-X100（250mm×4.1mm）型陰離子交換柱，并配有相同填料的保護柱（11.2mm，12～20μm）.各形態(tài)砷（亞砷酸鹽As（III）、As（V）、二甲基砷酸（DMA）和一甲基砷酸（MMA））用含10mmol/L磷酸氫二銨［（NH4）2HPO4］和10mmol/L硝酸銨（NH4NO3），且pH用優(yōu)級純硝酸和氨水調(diào)節(jié)至6.2的流動相進行分離.流動相以1.0mL/min洗脫運行.

實驗中As （V）、As（III）、MMA和DMA的標準儲備液分別用Na3AsO4·12H2O （Fluka）、NaAsO2（Alfa Aesar）、NaCH4AsO3（Fluka）和NaC2H6AsO2（Sigma）配制.

1.5 生物累積和凈化動力學模型

根據(jù)一級動力學方程，選用非線性單室模型來描述藻體對砷的同步吸收和釋放：

式中：k1（L/（g·h））和k-1（h-1）分別為藻體砷生物累積過程中的吸收和釋放速率常數(shù)；Asin（μg/g干重）為藻體胞內(nèi)砷濃度；Asout（μg/L）為介質(zhì)中砷濃度，假設(shè)為恒量；t （h）指As（V）的暴露時間，該方程在k-1＞ 0且起始點位t=0的限定下進行求解.用GraphPad Prism 6.0軟件對模型進行分析處理.基于動力學數(shù)據(jù)，砷的生物富集系數(shù)（BCF， L/g）可通過公式BCF = k1/k-1計算［20］.模型參數(shù)的誤差可根據(jù)：（（stdx）/x） = （Σ（（stda）/a）2）1/2計算，其中x是由參數(shù)a和它的標準偏差（stda）計算出的參數(shù)值，stdx是x的標準偏差.

銅綠微囊藻砷的凈化速率常數(shù)和生物半衰期使用簡單一相和二相模型進行評價.把砷的單一釋出相劃分為短期“快速”釋放和長期“慢速”釋放兩個階段［20-21］.為簡化砷的兩相生物動力學處理過程，假定所有交換遵循一級動力學過程且各相獨立運作.快速和慢速釋放階段砷的釋放速率常數(shù)分別用ke和ke′表示.胞內(nèi)砷殘留量和總砷用公式（2）模擬：

式中：C0和Ct分別指初始和時間t時刻時胞內(nèi)砷的濃度；ke為釋放速率常數(shù)；t為凈化時間.銅綠微囊藻砷的生物半衰期（t1/2）用公式（3）計算：

2 結(jié)果與討論

2.1 銅綠微囊藻對As（Ⅴ）的累積動力學

不同磷水平下（±P）銅綠微囊藻對As（Ⅴ）的累積隨時間的增加而升高（圖1）.-P環(huán)境下銅綠微囊藻對As（Ⅴ）的累積顯著高于+P環(huán)境.用胞內(nèi)砷含量Asin作為時間的函數(shù)所預(yù)測的藻體對As（Ⅴ）累積動力學參數(shù)如表1所示.由R2可以看出，胞內(nèi)砷的累積可用吸收和釋放模型進行較好的解釋.由模型所得到的±P環(huán)境下藻體對As（Ⅴ）的釋放速率常數(shù)（k-1）顯著低于吸收速率常數(shù)（k1），且+P環(huán)境下藻體砷的釋放速率常數(shù)（k-1）是-P環(huán)境下的11.4倍，而吸收速率僅為-P環(huán)境下的71%.由此導(dǎo)致-P環(huán)境下銅綠微囊藻的BCF高出+P環(huán)境約15倍，說明-P能夠顯著提高銅綠微囊藻對As（Ⅴ）的累積，究其原因是磷與砷的競爭使得+P抑制了藻體As（Ⅴ）的吸收［9］.

圖1 在富磷和缺磷環(huán)境下藻體胞內(nèi)砷含量隨時間變化及線性擬合Fig.1 Changes in intracellular arsenic concentration under ±P conditions and their linear fitting

銅綠微囊藻在±P環(huán)境下較為接近的k1與差異明顯的k-1同萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）在相同條件下經(jīng)10μmol/L As（Ⅴ）長期暴露（6d）的實驗結(jié)果相一致（其在+P和-P環(huán)境下的k1分別為0.40，0.34L/（g·h），k-1分別為0.10，0.02h-1），而與斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）卻表現(xiàn)出明顯的不同（其在+P和-P環(huán)境下的k1分別為0.05，0.48L/（g·h），k-1分別為-0.01，0.05h-1）［9］，說明浮游藻類對As（Ⅴ）的生物累積隨物種的不同而有明顯差異.由k1和k-1所得出的BCF可以看出，+P環(huán)境下銅綠微囊藻對As（Ⅴ）的累積與萊茵衣藻基本相同（分別為3.82，4.00L/g），但在-P環(huán)境下卻顯著高于萊茵衣藻和斜生柵藻（三者BCF分別為60.02，17.00，9.60L/g）.銅綠微囊藻在-P環(huán)境下對As（Ⅴ）的高富集能力可能與其對缺磷環(huán)境的較高耐受性有關(guān)［12］.

表1 ±P環(huán)境下銅綠微囊藻對As（Ⅴ）的累積動力學參數(shù)Table 1 Accumulation kinetics parameters of As（Ⅴ） in M. aeruginosa under ±P conditions

2.2 含砷銅綠微囊藻中砷的凈化

+P和-P環(huán)境下預(yù)暴露于10μmol/L As（Ⅴ）24h后的含砷銅綠微囊藻，其體內(nèi)砷的含量分別為：（4.29±1.08），（60.37±11.39）μg/g.如圖2所示，凈化期間藻體胞內(nèi)砷含量顯著降低.快速釋放階段（2h），+P 和-P環(huán)境下藻體分別凈化釋放出41.5%和46.3%的胞內(nèi)砷.經(jīng)24h的長期凈化后，在+P 和-P環(huán)境下藻體慢速清除階段中的砷含量分別為初始值的31.0%和22.2%.用公式2獲得的模型曲線（圖2）顯示其可以很好地解釋銅綠微囊藻砷的凈化過程.

圖2 ±P環(huán)境下含砷藻體短期和長期凈化過程中胞內(nèi)砷變化Fig.2 Fraction of arsenic retained in M. aeruginosaunder ±P conditions for short- and long-term depuration

如表2所示，由于初始胞內(nèi)砷含量有明顯差異，該藻對砷的凈化速率常數(shù)在-P環(huán)境下均比+P環(huán)境時高.-P環(huán)境下ke約為+P環(huán)境的2.65倍.但對24h的慢速清除階段而言，+P和-P環(huán)境下ke′分別為（0.18±0.13），（0.22±0.09）h-1，二者較為接近，表明磷對藻體砷的快速清除（短期）影響較大，而對藻體砷的慢速清除（長期）影響較小.同時，初始砷含量高的藻體，其對砷的快速清除也相對更快.與±P環(huán)境下經(jīng)10μmolAs（Ⅴ）暴露6d后的斜生柵藻和萊茵衣藻的8h凈化過程相比［9］，銅綠微囊藻24h慢速清除階段砷的凈化速率常數(shù)均比萊茵衣藻（其在+P和-P環(huán)境下的ke′分別為0.10，0.12h-1）和斜生柵藻（其在+P和-P環(huán)境下的ke′分別為0.07，0.11h-1）要高.但±P環(huán)境對銅綠微囊藻慢速清除階段砷的凈化速率常數(shù)的影響均較小，顯示出不同磷環(huán)境對浮游藻類砷長期凈化影響較小的相同特征.由砷在藻體內(nèi)的生物半衰期（t1/2）可以看出，在+P環(huán)境下藻體內(nèi)的砷較-P環(huán)境而言相對更難清除，這與不同磷水平對斜生柵藻和萊茵衣藻中砷的生物半衰期影響一致，一方面可能是由于胞內(nèi)砷含量的差異性所致，另一方面說明水體中的磷能夠阻礙藻體內(nèi)低濃度砷的清除.因而，-P環(huán)境下砷含量高的藻體具有較高的砷釋放風險.

表2 含砷銅綠微囊藻在±P環(huán)境下砷的凈化速率常數(shù)Table 2 Efflux rate constants for short- and long-term arsenic depuration in M. aeruginosa under ±P conditions

2.3 凈化過程培養(yǎng)介質(zhì)中的砷形態(tài)變化

+P環(huán)境下經(jīng)10μmol/L As（Ⅴ）預(yù)暴露24h后的含砷藻體，于±P環(huán)境下長期（13d）凈化培養(yǎng)過程中，在+P培養(yǎng)介質(zhì)中觀察到僅有As（Ⅴ）釋出，其濃度為1.12～2.03μg/L；而在-P培養(yǎng)介質(zhì)中除As（Ⅴ）外，還有As（Ⅲ）和DMA的釋出（圖3）.由圖3可見，含砷量相同的藻體（總砷含量為7.5～10.6μg/g干重）在+P介質(zhì)中比在-P介質(zhì)中釋放較多的砷，說明+P環(huán)境利于藻體對砷、磷的識別，從而使得藻體在優(yōu)先吸收利用磷的同時可將體內(nèi)砷釋出胞外.這與前人的一些研究結(jié)果（某些硅藻如海鏈藻、角毛藻和中肋骨條藻等似乎能識別磷酸鹽和As（V））類似［22］.此外，Elias等［23］也曾指出，環(huán)境中較高的磷/砷比可提高藻體對As（V）和磷酸鹽的識別.環(huán)境中高濃度的磷能通過磷酸鹽運輸系統(tǒng)或競爭性結(jié)合As（V）還原酶的活性點位而抑制甚至完全阻止細胞對As（V）的吸收和還原［24］.由此可見， +P環(huán)境可促進As（V）的釋放.

圖3 13d凈化期內(nèi)含砷藻體向±P介質(zhì)中釋放的各形態(tài)砷含量Fig.3 Concentrations of different arsenic species in±P media during 13days depuration period

在凈化的第1d和第3d，-P介質(zhì)中可分別檢測到As（Ⅲ）和DMA的存在.在13d的凈化期內(nèi)培養(yǎng)介質(zhì)中As（Ⅲ）含量增加未超出總砷量的14%；而DMA的含量相對穩(wěn)定，為總砷含量的（49±5）%.此前已有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻具有將無機砷甲基化并迅速排除體外的能力［9，25］，由此推測培養(yǎng)介質(zhì)中的As（Ⅲ）和DMA可能均由藻體產(chǎn)生并釋出.但其具體轉(zhuǎn)化機制還需要進一步結(jié)合藻體內(nèi)砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化進行深入探討.

不同磷環(huán)境對含砷銅綠微囊藻的砷釋放的影響與Guo等［25］的研究結(jié)果（水環(huán)境中磷的含量較砷更能顯著影響介質(zhì)中砷的形態(tài)）相一致.總之，-P能提升藻體砷的甲基化能力，而+P在上調(diào)藻體磷運輸系統(tǒng)過量攝取磷的同時可促進體內(nèi)砷的排出.因而，含砷水體中磷水平的差異顯著影響著銅綠微囊藻對砷的吸收與凈化.含砷水體銅綠微囊藻水華暴發(fā)及其相關(guān)處置所可能導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境風險應(yīng)受到更多地關(guān)注.

3 結(jié)論

3.1 -P環(huán)境下，銅綠微囊藻對As（Ⅴ）較高的吸收速率結(jié)合較低的釋出速率，使其生物累積顯著高于+P環(huán)境，但-P誘導(dǎo)的高砷藻體，在相同磷環(huán)境下砷的釋放風險也高.

3.2 不同磷環(huán)境下含砷藻體中的砷可在快速清除階段以近似的比例被迅速排出，但在慢速清除階段其對藻體砷的凈化率常數(shù)影響較小.

3.3 含砷量相同的銅綠微囊藻，在不同磷水平下凈化時，其機制不同.+P環(huán)境下藻體以胞內(nèi)As（Ⅴ）釋出為主；-P則促進了藻體砷的形態(tài)轉(zhuǎn)化，As（Ⅴ）和DMA成為釋出砷的主要形態(tài).

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Uptake and depuration kinetics of arsenatein Microcystis aeruginosaunder different phosphate regimes.

WANG Zhen-hong1，2， LUO Zhuan-xi1， CHE Fei-fei1， YAN Ya-meng1， YAN Chang-zhou1*（1.Key Laboratory of Urban Environment and Health， Institute of Urban Environment， Chinese Academy of Sciences， Xiamen 361021， China；2.College of Chemistry and Environment， Minnan Normal University， Zhangzhou 363000， China）.

China Environmental Science， 2015，35（2）：533～538

The uptake and depuration kinetics of arsenate inMicrocystis aeruginosa （M. aeruginosa） were investigatedunder phosphate-enriched （+P） and depleted （-P） culture conditions. Similarly， M. aeruginosa， pre-exposed to 10μmol/L arsenate for 24 hours under +P conditions， were used to examine arsenic efflux and species changes in culture media during 13 days depurations under +P and-P conditions. Results showed that P-depletion was found to significantly improve the accumulation of arsenate in Microcystis aeruginosa， in which the algae with high accumulated amounts of arsenic had high risks due to arsenic rapid efflux. Additionally， ca. 41.5% and 46.3%intracellular arseniccould be rapidly excreted in rapidclearance phase （2h） under +P and -P conditions， respectively. During the depuration period， arsenate efflux was the crucial process from algae cells in +P media， but arsenate reduction and methylation were observed in -Pmedia. This indicates significant differences inM. aeruginosa depuration mechanism under different phosphorus conditions.

Microcystis aeruginosa；arsenate （As（Ⅴ））；uptake kinetics；depuration；phosphorus

X703.1

A

1000-6923（2015）02-0533-06

王振紅（1979-），女，河北平山縣人，副教授，博士，主要從事水環(huán)境微污染控制研究.發(fā)表論文20余篇.

2014-05-20

國家自然科學基金資助項目（21277136，41401552）；福建省教育廳A類科技項目（JA12214）

* 責任作者， 研究員， czyan@iue.ac.cn.