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    MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放

    2019-07-13 02:34:00許良濤王蕙婷劉克建謝復(fù)煒劉惠民謝劍平
    煙草科技 2019年6期
    關(guān)鍵詞:染毒卷煙磷酸化

    許良濤,李 翔,王蕙婷,劉克建,謝復(fù)煒,劉惠民,謝劍平

    中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

    炎癥,是組織和器官暴露于有害刺激物,如微生物病原體、化合物或有毒的細(xì)胞成分等而產(chǎn)生的一種復(fù)雜防御性反應(yīng)[8],參與卷煙煙氣誘導(dǎo)的多種相關(guān)疾病,例如吸煙誘導(dǎo)的長(zhǎng)期不可控的炎癥反應(yīng)會(huì)引發(fā)肺組織損傷,最終導(dǎo)致COPD等慢性疾病的發(fā)生[9]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路包括c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase,JNK1/2)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signalregulated kinase,ERK)和p38[10]。有研究結(jié)果表明,MAPK信號(hào)通路與炎癥相關(guān)。Shen等[11]研究發(fā)現(xiàn),特異性抑制JNK1/2可降低AP-1的轉(zhuǎn)錄活性和活性氧的釋放水平,并通過(guò)下調(diào)腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和 白介素 -6(Interleukin-6,IL-6)來(lái)抑制百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷和細(xì)胞凋亡。He等[12]研究報(bào)道,PM2.5會(huì)明顯地激活磷酸化的核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、p38和ERK信號(hào)通路,同時(shí)增加促炎癥因子的基因和蛋白表達(dá),最終通過(guò)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致慢性阻塞性肺病的發(fā)生。然而卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)信號(hào)通路等機(jī)制研究較少,有研究表明,卷煙煙氣中的自由基不僅會(huì)激活ERK信號(hào)通路[13],而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)肺部眾多的氧化還原敏感信號(hào)系統(tǒng)誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[14]。由此提出假設(shè),卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)。呼吸系統(tǒng)是卷煙煙氣接觸的主要靶器官。本研究中,采用人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)作為受試對(duì)象評(píng)價(jià)卷煙煙氣的體外毒性效應(yīng),分別使用抑制劑SCH772984、SP600125和SB203580對(duì)ERK1/2、JNK1/2和p38進(jìn)行特異性抑制,初步探討煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子釋放與MAPK信號(hào)通路的關(guān)系,旨在為卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)疾病的機(jī)制研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑和儀器

    3R4F參比卷煙(美國(guó)肯塔基大學(xué));BEAS-2B細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。

    二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO,美國(guó)Amresco公司);磷酸化ERK1/2抑制劑SCH772984(S7101)、磷 酸 化 JNK1/2抑 制 劑 SP600125(S1460)、磷酸化p38抑制劑SB203580(S1076)(美國(guó)Selleck公司);蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品(26617,美國(guó)Thermo Scientific公司);兔抗一抗,包括ERK1/2(4695)、磷酸化 ERK1/2(4370)、JNK1/2(9258)、磷酸 化 JNK1/2(4668)、p38(8690)、磷 酸 化 p38(4511)、β-Actin(8457)( 美國(guó) Cell Signaling Technology公司);辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(Enhanced chemiluminescence,ECL)檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天公司);哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)提取試劑(78501,美國(guó)Thermo公司);Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8,日本 Dojindo實(shí)驗(yàn)室);人 IL-6 ELISA試劑盒(S6050)、人IL-8 ELISA試劑盒(S8000C)、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(SLB50)(美國(guó)R&D system公司);人支氣管上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Bronchialepithelialcellbasalmedium,BEBM)+SingleQuots細(xì) 胞 因 子(CC-3171,Clonetics)(美國(guó)Lonza公司)。

    SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國(guó)Merck Millipore公司);60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(430166)、96孔板(3599)(美國(guó)Corning公司);AL204-IC電子天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司);TH4-200顯微鏡(日本Olympus公司);HERA cell 240細(xì)胞恒溫恒濕培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);Spectra MAX 190酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);RM20H轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)(德國(guó)Borgwaldt KC公司);Mini TransBlot Electrophoreti蛋白免疫印跡轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)BioRad公司);3-18 K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);FluorChem E超靈敏自動(dòng)成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Protein Simple公司);Nanodrop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 TPM染毒液的配制

    3R4F參比卷煙放置于(22±1)℃、相對(duì)濕度(60±2)%的環(huán)境中平衡48 h。采用轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)在ISO標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式[15]下抽吸20支參比卷煙;用劍橋?yàn)V片( 92 mm)捕集卷煙主流煙氣總粒相物(TPM),加入適量DMSO萃取劍橋?yàn)V片,超聲振蕩10 min,制備10 mg/mL的TPM儲(chǔ)備液,-80℃保存。除細(xì)胞毒性測(cè)試空白對(duì)照組培養(yǎng)基中的DMSO濃度為0.5%,其余實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組培養(yǎng)基中的DMSO濃度均為0.1%(細(xì)胞毒性測(cè)試中,最高TPM染毒劑量為50 μg/mL,其余實(shí)驗(yàn)TPM最高染毒劑量為10 μg/mL)。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性測(cè)試

    使用BEBM細(xì)胞培養(yǎng)液(加SingleQuots細(xì)胞因子)對(duì)BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中,接種數(shù)目為3×105/皿。在37℃、5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞接種于96孔板,每孔加200 μL培養(yǎng)基,細(xì)胞接種數(shù)目設(shè)定為1.5×104/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,吸去培養(yǎng)基,使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)清洗3次,吸凈PBS溶液。加入200 μL含有不同TPM濃度的培養(yǎng)基,染毒培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,并于37℃下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

    (1)巖棉復(fù)合型保溫模板的組成材料為巖棉保溫板、冷拔低碳鋼絲、聚合物保溫砂漿,該模板具有免拆模、使用安全、耐火等級(jí)高、施工便捷等優(yōu)點(diǎn)。

    1.2.3 TPM染毒和抑制劑處理

    細(xì)胞傳代后培養(yǎng)24 h,細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合,進(jìn)行TPM染毒24 h,染毒前1 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抑制劑處理,使用4 nmol/L SCH772984抑制磷酸化的 ERK1/2,使用 50 μmol/L SP600125 抑制磷酸化的 JNK1/2,使用 10 μmol/L SB203580 抑制磷酸化的p38。

    1.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)

    Western blot(WB)實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)要流程如下:使用1.2.2節(jié)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒,收獲細(xì)胞于冰上裂解得到細(xì)胞全蛋白,使用分光光度計(jì)測(cè)定全蛋白濃度,電泳上樣量為20 μg蛋白。制備5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃縮膠和8%~15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分離膠對(duì)蛋白進(jìn)行分離。使用轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜電壓100 V、轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h)。PVDF膜于5%的脫脂奶粉中室溫封閉1 h,使用含0.05%Tween 20的Tris緩沖溶液(Trisbuffered saline and Tween 20,TBST)洗膜3次,每次5 min。使用相對(duì)應(yīng)的兔抗一抗于4℃下孵育過(guò)夜。次日使用TBST緩沖液洗膜3次,每次5 min。使用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗于室溫中孵育1 h。使用TBST洗膜3次,每次5 min。然后使用化學(xué)發(fā)光法ECL試劑進(jìn)行顯影,使用顯影儀拍照。

    1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme lined immunosorbent assay,ELISA)

    細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8的釋放水平采用對(duì)應(yīng)的人抗體半定量ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。使用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)間的最小顯著差異(Least significant difference,LSD)通過(guò)單因素方 差 分 析 法(One-way analysis of variance,ANOVA)檢驗(yàn)。p<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 卷煙煙氣對(duì)細(xì)胞存活的影響

    BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度TPM染毒24 h后的存活率(表1)顯示,TPM抑制BEAS-2B細(xì)胞存活率具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)TPM濃度大于10 μg/mL時(shí),實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率相較于對(duì)照組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)TPM濃度為10 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率為(90.0±2.0)%,結(jié)合光鏡下BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)(圖1a、圖1b),該濃度染毒24 h不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷。因此,后續(xù)的染毒條件均選擇10 μg/mL染毒24 h。

    表1TPM染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響(n=3)Tab.1 Effect of exposure to TPM on viability of BEAS-2B cells(n=3)

    圖1TPM染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of exposure to TPM on morphology of BEAS-2B cells

    2.2 MAPK信號(hào)通路參與卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子釋放

    MAPK 信號(hào)通路包括 ERKs,JNKs和 p38[16],其在免疫反應(yīng)中具有重要的作用[14],因此本研究選中取ERK1/2、JNK1/2和p38信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)。IL-1β、IL-6和IL-8被認(rèn)為是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[17],所以選取炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8進(jìn)行檢測(cè)。

    ERK信號(hào)通路的相關(guān)結(jié)果如圖2所示,TPM染毒組的磷酸化ERK1/2表達(dá)水平以及細(xì)胞上清液中的炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平均顯著升高。為進(jìn)一步探究ERK1/2信號(hào)通路是否參與調(diào)控卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放,進(jìn)行了ERK1/2信號(hào)通路抑制實(shí)驗(yàn),在TPM染毒下的ERK1/2特異性抑制劑組中,磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)明顯被抑制,且細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平相較于無(wú)抑制劑處理的TPM染毒組也顯著減少。ERK1和ERK2信號(hào)通路在調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放中具有重要作用[18]。有研究[14]表明,卷煙煙氣和脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放是通過(guò)激活ERK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的,抑制ERK可顯著緩解炎癥;本研究的結(jié)果與其結(jié)果一致。Shin等[19]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抑制ERK信號(hào)通路可緩解卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺部炎癥。ERK1/2可通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放,而ERK1/2激活下游的TPL2信號(hào)通路對(duì)炎癥因子的釋放具有復(fù)雜的效應(yīng)[18],既可刺激Toll樣受體(TLR)進(jìn)而誘導(dǎo)TNF、IL-1β和IL-10的釋放[20],又可下調(diào)IL-12、干擾素β(IFN-β)和iNOS的產(chǎn)生[21]。

    JNK信號(hào)通路具有促進(jìn)炎癥的作用,抑制JNK可能會(huì)成為炎癥相關(guān)疾病的有效治療手段[22]。Tian等[23]發(fā)現(xiàn)了一種新的治療手段,可以明顯抑制小鼠肺泡灌洗液中單核細(xì)胞趨化蛋白(Monocyte chemoattractant protein,MCP-1)、IL-2、IL-6和IL-10的釋放水平,并減少肺組織中JNK和p38蛋白的mRNA水平,該方法可能會(huì)減輕卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥。在本研究中,JNK1/2相關(guān)結(jié)果(圖3)顯示TPM染毒組的磷酸化JNK1/2水平顯著升高;在TPM染毒下的JNK1/2特異性抑制劑組中,磷酸化JNK1/2蛋白被明顯抑制,細(xì)胞上清液中的 IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平也顯著下降。該結(jié)果從體外實(shí)驗(yàn)水平證明了卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥受JNK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)。有研究[18]表明,很多刺激均可以通過(guò)激活上游信號(hào)通路MAP3K-MAP2K來(lái)激活JNK1/2信號(hào)通路,但是探究JNK1/2信號(hào)通路在后續(xù)炎癥反應(yīng)中的生理學(xué)機(jī)制較為困難,因?yàn)樵摰鞍椎娜笔?huì)導(dǎo)致胚胎死亡。Martinez等[22]發(fā)現(xiàn)選擇性敲除JNK1/2的骨髓細(xì)胞會(huì)減少巨噬細(xì)胞中部分M1型巨噬細(xì)胞特異性基因的表達(dá),這些基因是體外IFN-γ和脂多糖刺激致病的關(guān)鍵基因,該結(jié)果表明巨噬細(xì)胞中JNK1/2信號(hào)通路具有促炎癥作用。

    圖2ERK1/2參與調(diào)控TPM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig.2 ERK1/2-regulated release of inflammatory cytokines in BEAS-2B cells induced by TPM

    圖3 JNK1/2參與調(diào)控TPM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig.3 JNK1/2-regulated release of inflammatory cytokines in BEAS-2B cells induced by TPM

    圖4 p38參與調(diào)控TPM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig.4 p38-regulated release of inflammatory cytokines in BEAS-2B cells induced by TPM

    本研究中進(jìn)一步探究了p38信號(hào)通路在卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥中的作用,結(jié)果(圖4)顯示,在TPM染毒組中,磷酸化的p38蛋白水平相較于對(duì)照組顯著升高;在TPM染毒下,加入p38的特異性抑制劑后,磷酸化的p38蛋白表達(dá)被抑制,細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平也被顯著抑制。由于p38信號(hào)通路可以通過(guò)激活負(fù)反饋信號(hào)通路抑制TLR信號(hào)通路來(lái)調(diào)控炎癥,所以其在促炎癥因子的產(chǎn)生中具有獨(dú)特的作用[18]。Kang等[24]發(fā)現(xiàn)在p38缺失的小鼠肝臟組織內(nèi),炎癥因子和趨化因子均顯著升高,并募集更多的炎癥細(xì)胞,表明在急性肝炎中p38信號(hào)通路起到了抗炎的保護(hù)作用;相反地,在人脂肪細(xì)胞中,脂多糖誘導(dǎo)的炎癥是通過(guò)激活p38/NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的[25]。由此可以看出,p38信號(hào)通路在不同化合物的染毒以及不同暴露部位下可能發(fā)揮著不同的作用。

    卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥不僅受MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié),還受到其他信號(hào)通路的調(diào)控。Rom等[26]綜述了在免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞體系下,卷煙煙氣和煙氣提取物可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)呼吸道炎癥和慢性阻塞性肺病等相關(guān)疾??;Jiang等[27]發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣首先激活Rac1信號(hào)通路,然后調(diào)節(jié)ERK1/2和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducers and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)小鼠肺細(xì)胞中IL-6和炎癥趨化因子的釋放,最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生;Nguyen等[28]發(fā)現(xiàn)Nrf2(NF-E2-related factor 2)信號(hào)通路參與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和肺部炎癥的調(diào)控。這些信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路均參與了卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥的發(fā)生。炎癥相關(guān)信號(hào)通路之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

    3 結(jié)論

    ①卷煙煙氣染毒可以引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞炎癥因子(IL-1β、IL-6和IL-8)的釋放;②卷煙煙氣染毒可激活ERK1/2、JNK1/2和p38信號(hào)通路;③MAPK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放。該研究結(jié)果可為煙草制品健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論參考。

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