火龍果潰瘍病菌拮抗細菌的鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化①

陳靜等

摘 要 采用對峙培養(yǎng)法從來自土壤的136株細菌中篩選得到對火龍果潰瘍病菌有拮抗作用的菌株HTN-5，抑菌帶寬9.0 mm。通過形態(tài)學、生理生化特性和16s rDNA序列分析，將拮抗菌HTN-5初步鑒定為皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae。從8種培養(yǎng)基中篩選出IFFI培養(yǎng)基最有利于菌株HTN-5形成抑菌活性物質，正交試驗優(yōu)化其成分，得最優(yōu)配方為：牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化鈉5.00g/L，pH 6.8。

關鍵詞 火龍果潰瘍病 ；皮氏類芽孢桿菌 ；拮抗菌 ；培養(yǎng)基優(yōu)化

分類號 S667.9 ；S436.68

火龍果（Hylocereus spp.）是一種熱帶、亞熱帶水果，屬于仙人掌科Cactaceae量天尺屬Hylocereus植物?；瘕埞a中美洲，20世紀90年代引入我國，在廣東、廣西、海南、福建、云南和貴州等地廣泛種植，種植面積約1.3萬hm2。

近年來，火龍果遭受多種病害的侵襲[1]，其中，潰瘍病是危害最為嚴重的病害，在廣東、廣西等地導致許多果園丟荒，嚴重威脅火龍果的大面積種植和生產?；瘕埞麧儾∈怯尚掳瞪?jié)孢Neoscytalidium dimidiatum引起，主要危害莖，在高溫高濕下出現(xiàn)莖桿腐爛和果實開裂[2-3]，也可引起果肉褐腐或黑腐[4-5]。室內毒力測定顯示，許多化學藥劑對火龍果潰瘍病菌有很好的抑制作用[6]，但在生產上還沒有行之有效的方法控制火龍果潰瘍病發(fā)生和蔓延。

筆者研究了一株從發(fā)病果園及其周圍土壤中分離篩選到對火龍果潰瘍病菌具有拮抗作用的細菌，對其進行鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，以期為開發(fā)防治火龍果潰瘍病的生防制劑提供依據。

1 材料和方法

1.1 火龍果潰瘍病菌

采用病組織分離法[7]，從具有火龍果潰瘍病典型癥狀的組織上分離得到，經致病性測定，確定為病原菌，通過形態(tài)學和分子生物學鑒定為新暗色柱節(jié)孢N. dimidiatum[3]，菌種保存在廣東海洋大學農學院微生物學實驗室。

1.2 拮抗菌的分離篩選

分離：采用稀釋平板法從樣品分離細菌。將從廣東湛江地區(qū)發(fā)病果園及其周圍土壤中采集樣品，稀釋105倍，沸水浴5 min后，取200 μL稀釋液涂布于冷卻的PDA培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)48～64 h。

篩選：采用平板對峙法進行篩選。將火龍果潰瘍病菌接種到PDA平板上28℃培養(yǎng)3 d，用打孔器取直徑6.0 mm 的菌餅接種到PDA培養(yǎng)皿中央。用接種環(huán)挑取細菌接種到距菌餅3 cm處，每個菌餅周圍接種4 個細菌單菌落，28℃黑暗培養(yǎng)，3 d后觀察抑菌帶的形成，記錄抑菌帶的寬度和細菌菌落直徑，計算抑菌帶的寬度與細菌菌落直徑的比值，比值越大，抑菌效果越好。將對火龍果潰瘍病菌有拮抗作用的細菌轉接到PDA平板，劃線分離純化，在4℃冰箱中保存。

復篩：將有抑菌活性的細菌再次進行平板對峙試驗，測定其抑菌作用，挑取抑菌效果最好的菌株進行鑒定及產抗菌物質培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.3 產抑菌活性物質培養(yǎng)基篩選

供試培養(yǎng)基有（1）BPDB：馬鈴薯200 g、牛肉膏20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（2）改良BPDB：馬鈴薯200 g、牛肉膏20 g、蛋白胨7 g、葡萄糖20 g、玉米粉7 g、水1 000 mL、pH自然；（3）YPAD：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（4）NYDA：牛肉膏8 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（5）BPY：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2；（6）玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉5 g、蛋白胨0.1 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（7）IFFI：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、乳糖尿5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.8；（8）NA：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然。

將經活化后的拮抗菌用無菌水配成106～107 CFU/mL的菌懸液，按1%的接種量接種到裝有20 mL BPDB 培養(yǎng)液的50 mL三角瓶中，在轉速為150 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中28℃下黑暗培養(yǎng)24 h，作為種子液。按1%的接種量將種子液分別接種到裝有供篩選培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，裝瓶量為20 mL，150 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 后，經12 000 r/min，離心15 min，取上清液，用0.22 μm細菌過濾器過濾除菌，經無菌檢驗后得到無菌發(fā)酵液。

牛津杯法測定無菌發(fā)酵液的抑菌活性?；瘕埞麧儾【赑DA平板上培養(yǎng)7 d后，用無菌水將孢子洗后加入PDA培養(yǎng)基中，制備含菌量為104～105個孢子/mL的帶菌PDA平板。在每個平板中放4個牛津杯，加200 μL無菌發(fā)酵液至牛津杯，28℃培養(yǎng)72 h后，測量抑菌圈大小，篩選得到最有利于產抑菌活性物質的培養(yǎng)基進行成分優(yōu)化。每個處理重復3次。

1.4 產抑菌活性物質培養(yǎng)基優(yōu)化

從8種供試發(fā)酵培養(yǎng)基中篩選出最有利于拮抗菌產抗菌活性物質的培養(yǎng)基IFFI，采用L16（45）正交試驗進行培養(yǎng)基成分優(yōu)化（表1）。培養(yǎng)基接種、發(fā)酵條件和發(fā)酵液抑菌活性測定同1.3，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)配方。

1.5 拮抗菌的鑒定

形態(tài)學和生理生化特性：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]。

16s rDNA序列分析：16s rDNA序列擴增引物為細菌鑒定通用引物（27f：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3和1512R：5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3）[10]。將保存的拮抗菌劃線接種PDA平板，用無菌牙簽挑取單菌落進行菌落PCR[11]。PCR反應體系采用TaKaRa公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒，反應體積50 μL。PCR擴增程序：98℃預變性5 min；98℃變性1 min，56 ℃復性30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將所得序列在GenBank進行BLAST分析，選取與病菌序列同源性高及近緣種菌株序列，用MEGA 6.0[12]軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap進行自舉檢驗，1 000次重復。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離及篩選

從廣東省湛江地區(qū)發(fā)病果園及其周圍土壤中采集的樣品中分離得到136株細菌，平板對峙試驗結果顯示，其中12株對火龍果潰瘍病菌有抑制作用，通過復篩，7菌株仍有很好的抑制作用（表2）。

從表2可以看出，細菌HTN-5抑菌效果最好，在初篩和復篩時，均形成抑菌帶寬9.00 mm，抑菌活性穩(wěn)定。復篩時，抑菌帶寬與菌落直徑比值最大為1.64。

2.2 產抑菌活性物質培養(yǎng)基篩選

將HTN-5接種到8種供試發(fā)酵培養(yǎng)基中，無菌發(fā)酵液的拮抗活性順序為：IFFI>NYDA>YPAD>改良BPDB> BPDB>玉米粉培養(yǎng)基>BPY>NA。對應的抑菌圈直徑分別為21.00、20.50、18.50、17.50、15.50、13.00、11.50和9.50 mm。用IFFI發(fā)酵的發(fā)酵液拮抗效果最好，故以IFFI作為最適發(fā)酵培養(yǎng)基進行含量優(yōu)化試驗。

2.3 產抑菌活性物質培養(yǎng)基成分優(yōu)化

對拮抗效果最好的發(fā)酵培養(yǎng)基IFFI進行L16（45）正交試驗，改變蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乳糖5個因素的用量，用L16（45）正交試驗設計優(yōu)化產抗菌活性物質的培養(yǎng)基成分，試驗結果見直觀分析表（表3）。

從表3可以看出，各因素的極差排序為牛肉膏>蛋白胨>葡萄糖>乳糖>酵母膏，表明牛肉膏為影響拮抗菌HTN-5產抗菌活性物質的最主要因素，發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化鈉5.00 g/L，pH 6.8。經檢驗，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑為23.30 mm，抑菌活性提高了11.0%，更有利于生產抗菌活性物質。

2.4 拮抗細菌的形態(tài)學及生理生化鑒定

形態(tài)學特征：在PDA培養(yǎng)基，菌株HTN-5菌落圓形突起，乳白色，有光澤，不透明，具有粘性，邊緣整齊，培養(yǎng)72 h可活躍擴展為“運動的菌落”（圖1A）。菌體細胞桿狀，成對排列，G+（圖1B），0.33 μm×1.87 μm （n>50）；可形成內生芽孢，芽孢囊膨脹，芽孢橢圓形。

生理生化特征（表4）：該菌產生過氧化氫酶，可分解葡萄糖和甘露醇，能夠液化明膠和水解淀粉；在pH 5.7和6.8的營養(yǎng)肉湯中能生長；在含2%、5%和7% NaCl的培養(yǎng)基中生長；在20、30、37和41℃下可生長。V.P.反應、肌醇降解、利用葡萄糖產氣、苯丙氨酸脫氨酶和卵磷脂酶測定、吲哚產生試驗，硝酸鹽還原反應均為陰性；在含10% NaCl的培養(yǎng)基中不生長；在4、45和65℃下不可生長。

16s rDNA序列分析：菌株HTN-5的16s rDNA序列經PCR擴增得到1 039 bp的片段（KT274704），在GenBank中進行Blast比對，菌株HTN-5的16s rDNA序列與皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae 模式菌株DSM 8320（HG794409），多粘類芽孢桿菌P. polymyxa 模式菌株DSM 36（HG324071）和P. brasilensis模式菌株ATCC BAA-413（AF273740）的序列同源性均為99%。從GenBank中選取類芽孢桿菌屬Paenibacillus的近緣種序列，Mega 6.0 軟件進行Clustal比對后，采用最大似然數法（Maximum Likelihood method）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）， HTN-5與P. peoriae DSM 8320聚集在同一個分枝上，而與P. polymyxa DSM 36和P. brasilensis ATCC BAA-413位于不同分枝上。綜合形態(tài)學、生理生化特性以及系統(tǒng)發(fā)育分析，將拮抗菌HTN-5初步鑒定為皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae[13-16]。

3 討論與結論

火龍果潰瘍病是一個世界性的病害，在馬來西亞、以色列、墨西哥、美國和尼加拉瓜等火龍果種植區(qū)均有發(fā)生，嚴重危害火龍果的產量和質量?；瘕埞麧儾【谧匀唤缰型ㄟ^無性孢子蔓延和傳播，在高溫高濕條件下容易爆發(fā)。雖然毒力測定結果顯示有一些化學藥劑對其有很好的抑制作用，有希望控制該病的發(fā)生和蔓延，但是在田間并沒有表現(xiàn)出很好的防治效果，因此，應用拮抗菌防治火龍果潰瘍病是一條很好的途徑。

皮氏類芽孢桿菌P. peoriae（早期為Bacillus peoriae）是一個土壤習居菌，最早于1993年從土壤根際中分離，Heyndrickx等對Bacillus peoriae和B. lautus進行修訂時確定的一個新組合種[13]。皮氏類芽孢桿菌P. peoriae對多種植物病原菌有很好的拮抗作用，產生如細胞外蛋白水解酶和幾丁質酶等抗菌物質，并且能夠固氮[17-18]，是一個潛在的生物防治菌。本研究篩選到一株細菌菌株HTN-5，對火龍果潰瘍病原菌具有明顯的拮抗作用，通過形態(tài)學、生理生化特性以及16s rDNA序列分析，將拮抗菌HTN-5初步鑒定皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae。目前，有關皮氏類芽孢桿菌P. peoriae作為生物防治菌的研究報道較少，因此有必要深入研究該菌的抑菌機制、在環(huán)境的定殖以及產生抗菌活性物質的主要成分等，以期更好開發(fā)利用皮氏類芽孢桿菌P. peoriae。

皮氏類芽孢桿菌P. peoriae菌株HTN-5對火龍果潰瘍病菌有穩(wěn)定的抑制作用，具有一定的開發(fā)應用前景。本研究對其產抗菌活性物質的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，為開發(fā)菌株HTN-5防治火龍果潰瘍病的生防藥劑奠定一定的基礎。

參考文獻

[1] Valencia-Botín A J， Kokubu H， Ortíz-Hernández Y D. A brief overview on pitahaya （Hylocereus spp.） diseases[J]. Australasian Plant Pathology， 2012， 42（4）： 437-440.

[2] 張 榮，劉愛媛，白成艷，等. 火龍果潰瘍病的癥狀觀察和病原菌鑒定[J]. 果樹學報，2013，30（5）：854-856.

[3] 易潤華，甘羅軍，晏冬華，等. 火龍果潰瘍病病原菌鑒定及生物學特性[J]. 植物保護學報，2013，40（2）：102-108.

[4] Yi R H， lin Q L， Mo J J， et al. Fruit internal brown rot caused by Neoscytalidium dimidiatum on pitahaya in Guangdong province， China[J]. Australasian Plant Disease Notes， 2015， 10（1）： 1-4.

[5] Ezra D， Liarzi O， Gat T， et al. First report of internal black rot caused by Neoscytalidium dimidiatum on Hylocereus undatus （Pitahaya） fruit in Israel[J]. Plant Disease， 2013， 97（11）： 1 513.

[6] 李 敏，胡美姣，高兆銀，等. 殺菌劑對火龍果革節(jié)孢屬病菌的室內毒力測定[J]. 熱帶農業(yè)科學，2012，32（4）：72-75，78.

[7] 方中達. 植病研究方法（第三版） [M]. 北京：中國農業(yè)出版社，1998.

[8] 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[9] 布坎南（R.E.Buchanan）R E， 吉本斯（N.E.Gibbons）N E編，中國科學院微生物研究所翻譯組譯. 伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M]. 北京：科學出版社，1984.

[10] Edwards U， Rogall T， Blocker H， et al. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA[J]. Nucleic Acids Res， 1989，

17： 7 843-7 853.

[11] Lu Q， Hu H， Mo J， et al. Enhanced amplification of bacterial and fungal DNA using a new type of DNA polymerase[J]. Australasian Plant Pathology， 2012， 41（6）： 661-663.

[12] Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al. MEGA6： Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2013， 30（12）： 2 725-2 729.

[13] Heyndrickx M， Vandemeulebroecke K， Scheldeman P， et al. A Polyphasic Reassessment of the Genus Paenibacillus， Reclassification of Bacillus lautus （Nakamura 1984） as Paenibacillus lautus comb. nov. and of Bacillus peoriae （Montefusco et al. 1993） as Paenibacillus peoriae comb. nov.， and Emended Descriptions of P. lautus and of P. peoriae[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 1996， 46（4）： 988-1 003.

[14] Yoon J H， Oh H M， Yoon B D， et al. Paenibacillus kribbensis sp. nov. and Paenibacillus terrae sp. nov.， bioflocculants for efficient harvesting of algal cells[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2003， 53（1）： 295-301.

[15] von der Weid I， Duarte G F， van Elsas J D， et al. Paenibacillus brasilensis sp. nov.， a novel nitrogen-fixing species isolated from the maize rhizosphere in Brazil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2002， 52（6）： 2 147-2 153.

[16] Wang L Y， Li J， Li Q， et al. Paenibacillus beijingensis sp. nov.， a nitrogen-fixing species isolated from wheat rhizosphere soil[J]. Antonie van Leeuwenhoek， 2013， 104（5）： 675-683.

[17] von der Weid I， Alviano D S， Santos A L S， et al. Antimicrobial activity of Paenibacillus peoriae strain NRRL BD-62 against a broad spectrum of phytopathogenic bacteria and fungi[J]. Journal of Applied Microbiology， 2003， 95（5）： 1 143-1 151.

[18] Alvarez V M， Von Der Weid I， Seldin L， et al. Influence of growth conditions on the production of extracellular proteolytic enzymes in Paenibacillus peoriae NRRL BD-62 and Paenibacillus polymyxa SCE2[J]. Letters in Applied Microbiology， 2006， 43（6）： 625-630.