龍須草葉片電鏡掃描樣品制備方法及掃描電鏡下電壓選擇

羅毅文, 喬匿骎, 周仁杰, 朱育鋒, 喻夜蘭

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院， 湖南 長沙 410128)

龍須草葉片電鏡掃描樣品制備方法及掃描電鏡下電壓選擇

羅毅文, 喬匿骎, 周仁杰, 朱育鋒, 喻夜蘭*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院， 湖南 長沙 410128)

探討了龍須草葉片掃描電鏡樣品的制備技術(shù)以及掃描電鏡下電壓的選擇。結(jié)果表明: 取葉組織直接鍍金觀察的效果與通過戊二醛固定經(jīng)丙醇脫水后再鍍金觀察的效果相差不大，研究龍須草葉片結(jié)構(gòu)可以用直接制片法。為了獲得清晰的龍須草葉片掃描電鏡圖，在掃描電鏡下選擇用10 kV的電壓為最佳。

龍須草; 葉; 掃描電鏡

龍須草(EulaliopsisbinataRetz.)是一種多年生的野生草本植物，屬禾本科(Gramineae)擬金茅屬(EulaliopsisHonda.)，多生長在海拔2600m以下的丘陵、山地[1-2]。龍須草具良好的生態(tài)效益，是一種優(yōu)良的水土保持先鋒草種，分蘗能力強，生長速度快，根系發(fā)達(dá)，葉狹長披覆地表，有效地減少了雨水對地表的沖刷[3-4]；龍須草對土壤重金屬有著良好的吸附作用，有研究發(fā)現(xiàn)隨著Pb、Cd復(fù)合污染含量的升高,龍須草的光合綜合指標(biāo)下降幅度較小,說明龍須草對重金屬復(fù)合污染具有較強的耐性,且Cd對龍須草的影響大于Pb[5-6]。同時，龍須草有著良好的經(jīng)濟(jì)效益，有報道稱四川青龍山村26余hm2的龍須草種植規(guī)模，年產(chǎn)值在200～400 t之間，每年最少能帶來20萬元的經(jīng)濟(jì)收入[7]。龍須草最具經(jīng)濟(jì)價值的部分是其葉，葉片中纖維含量高，韌度高、拉力強和防潮性能好，在生產(chǎn)實踐中常用來織繩、編織、造紙及紡織[8]。劉金祥等[1]綜合前人研究發(fā)現(xiàn)龍須草能全部代替樹木造紙，木質(zhì)素含量低，纖維素含量高，且纖維細(xì)長質(zhì)韌，易成漿，易漂白，成品的質(zhì)量指標(biāo)介于針葉木漿與闊葉木漿之間，并且適用于規(guī)?；a(chǎn)。曲麗君等[9]對龍須草纖維的細(xì)度、回潮率及力學(xué)性能進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)龍須草纖維斷裂強力可達(dá)到65.58 cN，回潮率為6.99%，可以滿足紡紗工藝的要求。掃描電子顯微鏡是許多學(xué)科在形態(tài)學(xué)研究中進(jìn)行顯微觀測的重要工具，它的突出優(yōu)勢除了具有可實現(xiàn)對觀察材料的放大倍數(shù)可調(diào)范圍寬、視野大、景深長和立體感強等之外，還具有極高的分辨率，是觀察物體表面超微結(jié)構(gòu)的最有效工具，在諸多學(xué)科中得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。利用掃描電鏡觀察龍須草葉片纖維的結(jié)構(gòu)具有十分重要的意義。本文對龍須草電鏡樣品制備及觀察進(jìn)行了研究，以期為龍須草電鏡實驗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗用的龍須草來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園實驗基地龍須草種質(zhì)資源實驗地。取樣的種質(zhì)資源來源于廣東連州的龍須草種，葉片取自成熟新鮮葉片的倒三葉，用刷子將葉片上的雜質(zhì)去除掉，取2 mm×2 mm左右的中部葉脈的樣品作為試驗材料。

1.2試驗方法

取相同部分的葉片樣，一種是將葉片直接切片法制片，一種是采用戊二醛固定法制片，比較兩種制片方法的電鏡效果。直接切片法是用鋒利的小刀將樣品從葉片中部葉脈處切下來后，直接放在真空鍍膜機內(nèi)，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電子顯微鏡下觀察照相；戊二醛固定法是將葉片預(yù)取樣處放在滴有一滴預(yù)冷固定液的潔凈蠟版上，用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將葉片組織切下并修小，接著用牙簽將葉樣品塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。然后用2.5%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸固定液固定2 h，最后用緩沖液漂洗20 min完成固定。固定后的樣品依次經(jīng)過70%、80%、90%丙酮各25 min，再經(jīng)過2次100%丙酮30 min系列脫水，將樣品置于臨界點干燥器中，浸泡于液態(tài)二氧化碳中，加熱到臨界點溫度以上，使之氣化進(jìn)行干燥。干燥后的樣品將其放在真空鍍膜機內(nèi)，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進(jìn)行觀察[12]。

在電鏡下進(jìn)行觀察，電壓的大小也會影響到成像的效果，本實驗對戊二醛固定法的制片分別用5、10、20 kV的電壓進(jìn)行觀察。

實驗用的儀器為日本電子株式會社JSM-6380LV型掃描電鏡。

2 結(jié)果與分析

2.1不同制片方法的掃描電鏡圖像比較

將兩種不同制片法掃描電鏡下的顯示在圖1中。從圖1中可以看出，觀察的葉片上表皮放大倍數(shù)從500倍、1000倍、2000倍到5000倍，直接切片法和戊二醛固定法都比較清楚，兩者差別不是很大。對比清晰度，戊二醛固定略要清晰一些。如果是用來統(tǒng)計氣孔數(shù)，測量細(xì)胞長短，直接切片的電鏡觀察能夠達(dá)到要求。從節(jié)約實驗成本上和節(jié)省實驗時間上，龍須草葉片的掃描電鏡實驗完全可以用直接切片不經(jīng)固定脫水來進(jìn)行。

2.2不同電壓下的掃描電鏡圖像比較

圖2為不同電壓下的掃描電鏡觀察比較圖。從圖2中可以看出用5 kV觀察，圖像較清晰，但視野有點暗。用20 kV觀察時圖像暗，且邊緣較模糊，圖像不太清晰。用10 kV觀察，圖像清晰，輪廓分明，光線明亮，適合觀察。因此，觀察龍須草葉片切片時，掃描電鏡適合用10 kV的電壓進(jìn)行觀察。

觀測指標(biāo)直接切片戊二醛固定葉片上表皮放大500倍圖1 2種制片方法的掃描電鏡圖像比較Fig.1 ComparisonofimageproductionoftwokindofSEM

觀測指標(biāo)直接切片戊二醛固定葉片上表皮放大1000倍葉片上表皮氣孔放大2000倍葉片上表皮蠟質(zhì)放大2000倍續(xù)圖1 2種制片方法的掃描電鏡圖像比較CoutinuedFig.1 ComparisonofimageproductionoftwokindofSEM

圖2 3種電壓下的掃描電鏡圖像比較Fig.2 ComparisonofimageproductionofthreekindofvoltageofSEM

3 結(jié)論與討論

生物組織從生物活體取下以后，如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理，由于細(xì)胞內(nèi)部各種酶的作用，會出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞[13-14]。因此，為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài)，操作時必須做到快、小、準(zhǔn)、冷。一般要求動作迅速，取材后在最短時間內(nèi)投入2.5%戊二醛固定液。龍須草葉片水分含量低，葉表面的蠟質(zhì)覆蓋，取樣不經(jīng)過戊二醛固定后，直接鍍金觀察的效果并不比通過固定、脫水后再鍍金觀察的效果差很多。因此當(dāng)實驗較多的時候，可以采用直接切片觀察。

龍須草葉片有一定硬度，特別是中間的葉脈較厚，切片較難切入，一定要保證刀片鋒利，動作要迅速，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。

在JSM-6380 LV型掃描電鏡下觀察龍須草切片，選擇用10 kV的電壓較適合觀察。

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PreparationofEulaliopsisbinatabladeandchooseofvoltageforscanningelectronmicroscope(SEM)

LUO Yiwen， QIAO Niqin， ZHOU Renjie， ZHU Yufeng， YU Yelan*

(Orient Science and Technology College， Hunan Agricultural Uniersity，Changsha, 410128， China)

The SEM sample preparation technique ofEulaliopsisbinatablade and scanning electron microscope voltage selection were studied. The results showed: the observation effect of blade tissue by directly gold plating was not very different from blade tissue by glutaraldehyde fixing and alcohol dehydration and gold plating， most of the blade structure studing can be used to the method of directly gold plating. The 10KV was the best choice to observe blade structure which can get more clear picture.

Eulaliopsisbinata； blade； SEM

2014-12-16

湖南省大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目《不同生態(tài)型龍須草葉片纖維解剖結(jié)構(gòu)比較研究》(53020620)；國家林木種質(zhì)資源平臺項目(2013DKA210003-02-13)。

* 為通訊作者

S 543.9

A

1003-5710(2015)02-0072-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2015. 02. 018

(文字編校：龔玉子)