溫度、光照和磷酸鹽脈沖輸入對(duì)三角褐指藻的交互影響

周慧敏，馮劍豐，朱 琳，李文嬌 （南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染過程與環(huán)境基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071）

溫度、光照和磷酸鹽脈沖輸入對(duì)三角褐指藻的交互影響

周慧敏，馮劍豐*，朱 琳，李文嬌 （南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染過程與環(huán)境基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071）

研究了光照和溫度聯(lián)合作用下磷酸鹽脈沖輸入對(duì)三角褐指藻生長的影響.結(jié)果表明隨著溫度的升高，磷酸鹽脈沖輸入頻率對(duì)三角褐指藻生長的影響趨于顯著，連續(xù)添加磷酸鹽和低頻脈沖更有利于三角褐指藻快速增長，但較高的光照強(qiáng)度［125μmol/（m2·s）］和較高的溫度（18℃、25℃）同時(shí)作用將抑制三角褐指藻的磷酸鹽吸收能力.研究證實(shí)了溫度、光照和脈沖對(duì)三角褐指藻的生長存在交互影響.

磷酸鹽脈沖輸入；溫度；光照；交互作用；浮游植物

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量生產(chǎn)和生活廢水排放入海，導(dǎo)致我國近岸海域水質(zhì)不斷惡化，富營養(yǎng)化程度日趨嚴(yán)重，藻華災(zāi)害頻發(fā)［1-2］.藻華的發(fā)生包括了一系列復(fù)雜的海洋學(xué)和生態(tài)學(xué)過程，是各種環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果.營養(yǎng)物質(zhì)作為生物生長的限制性因素，在藻華形成過程中有非常重要的作用［3-5］.近岸海域的營養(yǎng)鹽輸入主要有陸源輸送、與開放海域的海水交換、沉積物與水界面交換和大氣沉降等方式.在工農(nóng)業(yè)比較發(fā)達(dá)的沿海地區(qū)，近海區(qū)域的營養(yǎng)鹽濃度水平很大程度上取決于陸源營養(yǎng)物的輸入強(qiáng)度及頻度.陸源營養(yǎng)鹽的輸入方式有連續(xù)輸入和脈沖輸入兩種形式［6-7］. 由降水決定的陸源輸入具有高度的脈沖特征，從而導(dǎo)致近海區(qū)域營養(yǎng)鹽水平的脈沖性響應(yīng)［8-9］.營養(yǎng)鹽脈沖輸入可以理解為“營養(yǎng)鹽間歇性的大量供給”［10］或“營養(yǎng)物質(zhì)含量在短時(shí)間內(nèi)快速增高的低頻發(fā)生行為”［11-12］. 營養(yǎng)鹽脈沖輸入可導(dǎo)致短期內(nèi)可利用營養(yǎng)鹽濃度的大幅度變化，從而影響生物生長，改變種群數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)［13-18］.研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)鹽輸入的時(shí)間差異性（輸入頻率的變化）在赤潮藻類的生長過程中可能會(huì)發(fā)揮更大的作用［19-22］.藻華的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，除營養(yǎng)鹽之外，溫度與光照也是影響藻類生長的重要環(huán)境因子.目前相關(guān)研究多側(cè)重于單個(gè)環(huán)境因子（溫度或光照）的研究，對(duì)于多種環(huán)境因子與營養(yǎng)鹽脈沖的交互作用的研究還比較少.考慮到藻華形成過程的復(fù)雜性以及其中關(guān)鍵環(huán)境因子可能存在的交互作用，本文進(jìn)行了光照和溫度聯(lián)合作用下營養(yǎng)鹽脈沖輸入對(duì)典型赤潮藻類—三角褐指藻生長的影響.由于目前我國近海處于總氮嚴(yán)重超標(biāo)狀態(tài)，N/P比值嚴(yán)重失衡，我國海域整體處于嚴(yán)重的磷脅迫壓力下［23］.因此本文選擇磷酸鹽為限制性營養(yǎng)鹽，探討不同溫度和光照強(qiáng)度下不同脈沖方式添加磷酸鹽對(duì)三角褐指藻生長的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選取我國近岸海域的典型赤潮藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum.）作為實(shí)驗(yàn)藻種.實(shí)驗(yàn)在3個(gè)溫度水平（10，18，25℃）和2個(gè)光照水平［31.25，125μmol/（m2·s）］正交下進(jìn)行.每一個(gè)水平下磷酸鹽添加方式為4種頻率的脈沖，分別是每天投加1次磷酸鹽、每2d投加1次磷酸鹽、每4d投加1次磷酸鹽和每8d投加1次磷酸鹽.其中在1個(gè)周期內(nèi)（8d）磷酸鹽（NaH2PO4）加入的總量是相同的，添加方式如表1.在每次實(shí)驗(yàn)接種的第1d投加所需磷酸鹽，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為3個(gè)周期，共24d.整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)氮均處于充足狀態(tài)（N/P＞16）.

表1 四種脈沖輸入模式下磷酸鹽的供給量Table 1 The supply amount of phosphate in four pulse modes

1.2 藻種接種及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用藻種為三角褐指藻（硅藻門，羽紋綱，褐指藻目，褐指藻屬），由中科院海洋研究所提供，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為（23±1）℃，光照強(qiáng)度為93.75μmol/（m2·s），周期為L:D = 12:12.采用f/2改良培養(yǎng)基［19］，人工海水（AW）的配制參考人工海水介質(zhì)［20］.

三角褐指藻保存在f/2AW培養(yǎng)基中，每5d轉(zhuǎn)接種一次，重復(fù)2次，所得三角褐指藻濃度經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)均超過5×106cells/mL時(shí)，便可作為實(shí)驗(yàn)藻種.實(shí)驗(yàn)前，將處于指數(shù)增長期的藻液進(jìn)行離心（3000r/min），將離心后的藻種轉(zhuǎn)入無磷培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)3d.經(jīng)過饑餓培養(yǎng)后取一定體積（約20mL）的藻種以3000r/min的速度離心10min，棄掉上清液，用無菌人工海水洗滌后再離心，重復(fù)3次，稀釋后接種至實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基.實(shí)驗(yàn)在添加了100mL培養(yǎng)基的體積為250mL錐形瓶中進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，每天人工搖動(dòng)3～4次［21］，每天在同一時(shí)間取樣，用生物顯微鏡測定藻細(xì)胞密度，并且按照不同脈沖方式添加營養(yǎng)鹽.

1.3 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的方法，每天取樣在生物顯微鏡下檢測細(xì)胞數(shù)量（誤差在5%以內(nèi)）.接種的當(dāng)日起為第1d，三角褐指藻的初始接種密度2×104cells/mL.將每天的細(xì)胞數(shù)量相加，得到實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的細(xì)胞總量.

1.4 比生長率計(jì)算

式中:X2為某一時(shí)間間隔終結(jié)時(shí)的藻類現(xiàn)存量；X1為某一時(shí)間間隔開始時(shí)的藻類現(xiàn)存量；T2-T1為某一時(shí)間間隔.

由于磷酸鹽的脈沖式添加導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)濃度在短時(shí)間內(nèi)急劇變化會(huì)直接影響藻類的生長，即生長率的變化.而三角褐指藻在適合的條件下可以迅速繁殖（生長率＞1d-1）.因此比生長率的短期變化（比如2～3d）更能體現(xiàn)三角褐指藻對(duì)營養(yǎng)鹽脈沖輸入的響應(yīng).本實(shí)驗(yàn)為24d，分為了3個(gè)周期（1～8d、9～16d、17～24d），這3個(gè)周期大致對(duì)應(yīng)了藻類生長的3個(gè)階段:生長延緩期、指數(shù)增長期及穩(wěn)定增長期.相比于每個(gè)周期內(nèi)比生長率的平均值，每個(gè)周期內(nèi)比生長率的最大值（μmax）更能反映微藻對(duì)營養(yǎng)鹽脈沖輸入的短期響應(yīng).本文選擇μmax作為微藻的短期響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行研究.首先通過公式（1）計(jì)算每天的比生長率μ，然后按周期分別得到每個(gè)周期內(nèi)比生長率的最大值μmax.分析溫度、光照和脈沖對(duì)三角褐指藻μmax的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度和光照條件下磷酸鹽脈沖輸入頻率對(duì)三角褐指藻μmax的影響

在第1周期內(nèi)，無論單因子還是多因子對(duì)三角褐指藻μmax的影響均不顯著.在指數(shù)增長期內(nèi)（第2個(gè)周期）脈沖輸入方式在不同溫度和光照條件下對(duì)三角褐指藻μmax的影響如圖1.

圖1 指數(shù)增長期脈沖輸入對(duì)三角褐指藻μmax的影響Fig.1 The effects of phosphate pulse on μmaxtricornutum in exponential growth phase

低光照時(shí)，在低溫（10℃）下隨脈沖頻率的降低μmax先降低后升高，中等頻率脈沖的μmax較小，低頻和連續(xù)添加方式下μmax值較大；而在中溫（18℃）和高溫條件下（25℃）變化趨勢(shì)均不明顯.在高光照下，中溫（18℃）和高溫（25℃）下μmax均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，中等頻率脈沖下μmax值小于低頻和連續(xù)添加方式.低溫條件下（10℃）μmax變化趨勢(shì)不明顯.

低溫下（10℃），脈沖輸入對(duì)μmax在低光照強(qiáng)度下有顯著影響，而高光照下影響不顯著；中溫（18℃）及高溫下（25℃），脈沖輸入對(duì)μmax在高光照強(qiáng)度下有顯著影響，而低光照下影響不顯著.

圖2 穩(wěn)定增長期脈沖輸入對(duì)三角褐指藻μmax的影響Fig.2 The effects of phosphate pulse on μmax（Phaeodactylum tricornutum.） in stable growth phase

在穩(wěn)定增長期內(nèi)（第3周期），低光照時(shí)，中溫（18℃）和高溫下（25℃）下，μmax隨著脈沖頻率的降低整體呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)（圖2a），低頻脈沖（8d）下μmax值大于另外3種脈沖.高光照時(shí)， 中等溫度（18℃）下μmax隨著脈沖頻率降低而增大.高溫（25℃）下曲線呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢(shì)，中等頻率脈沖下μmax值大于低頻脈沖和連續(xù)添加方式.

低溫下（10℃），脈沖輸入頻率對(duì)三角褐指藻的μmax的影響均不顯著；中溫下（18℃），隨著光照增強(qiáng)，μmax隨著脈沖頻率的降低整體呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)；高溫下（25℃），μmax曲線變化基本一致，但在高光照強(qiáng)度下，低頻脈沖（8d1次）下μmax顯著下降.

2.2 不同溫度和光照條件下磷酸鹽脈沖輸入頻率對(duì)三角褐指藻細(xì)胞數(shù)量的影響

低溫低光照下（圖3a），三角褐指藻在第12d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，8d脈沖下波動(dòng)較大.藻細(xì)胞平均密度最大值分別為6.34×106， 6.88×106，6.74×106， 6.97×106cells/mL.高光照下（圖3b），第9d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，連續(xù)添加方式下藻生長比較平穩(wěn)，其余3種脈沖方式下藻密度波動(dòng)較大.藻細(xì)胞平均密度最大值分別為6.35×106， 6.85×106，5.63×106， 6.0×106cells/mL.

圖3 10℃磷酸鹽脈沖式輸入對(duì)三角褐指藻生長的影響Fig.3 Effects of phosphate pulse on Phaeodactylum tricornutum under 10℃

溫度為18℃光照為31.25μmol/（m2·s）（圖4a）下，三角褐指藻在第6d左右進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期.1d脈沖頻率下藻平均密度穩(wěn)定上升，在16d以后占據(jù)較大的優(yōu)勢(shì)，在21d后趨于穩(wěn)定，藻平均密度最大值出現(xiàn)在23d，為9.47×106cells/mL.而2d和4d脈沖藻密度最大峰值分別為8.34×106cells/mL和7.99×106cells/mL，2d脈沖藻密度變化呈現(xiàn)出波動(dòng)性.8d脈沖下的藻密度曲線波動(dòng)更大，在第19d出現(xiàn)了最大峰值，為8.29×106cells/mL，隨后由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，藻細(xì)胞平均數(shù)量開始下降. 在光照為125μmol/（m2.s）條件（圖4b）下，藻細(xì)胞平均數(shù)量整體大于低光照條件下.在第6d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期.8d脈沖下，有一些波動(dòng)，在第15d達(dá)到第一個(gè)峰值，為5.66×106cells/mL，隨后稍有下降，在17d后繼續(xù)增加，最大值出現(xiàn)在24d，為1.21× 107cells/mL.1d脈沖下藻密度最大值為1.12× 107cells/mL.2d脈沖和4d脈沖最大值分別為1.25×107，1.1×107cells/mL.

圖4 18℃磷酸鹽脈沖式輸入對(duì)三角褐指藻生長的影響Fig.4 Effects of phosphate pulse on Phaeodactylum tricornutum under 18℃

由圖5發(fā)現(xiàn)， 25℃、125μmol/（m2·s）時(shí)最大藻平均密度值明顯大于31.25μmol/（m2·s）條件下的，4種脈沖生長曲線也有較大差別.在溫度為25℃光照為31.25μmol/（m2·s）條件下，第7d左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，1d脈沖下藻細(xì)胞穩(wěn)定的上升，占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì)，藻平均密度最大值為6.09×106cells/mL.其余3種脈沖有較大的波動(dòng)，并且波動(dòng)周期與磷酸鹽添加周期大致相關(guān)，藻平均密度最大值分別為6.01×106，6.20×106，6.99×106cells/mL.光照為125μmol/（m2·s）時(shí)，藻平均密度值達(dá)到了所有條件下最大值，明顯大于其它溫度、光照條件下的最大藻密度.第6d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，在初始階段也是1d脈沖稍占優(yōu)勢(shì)，藻平均密度值大于其余3種.8d脈沖在實(shí)驗(yàn)的第10d才開始快速增長，生長曲線與脈沖添加頻率基本一致.4種脈沖下藻平均密度最大值分別為1.07×107，1.62×107，1.44×107，1.24×107cells/mL.

圖5 25℃磷酸鹽脈沖式輸入對(duì)三角褐指藻生長的影響Fig.5 Effects of phosphate pulse on Phaeodactylum tricornutum under 25℃

對(duì)于細(xì)胞總量來說，在低光照條件下（圖6a，c，e），無論低溫、中溫或高溫，連續(xù)添加磷酸鹽脈沖方式下的藻細(xì)胞總量始終占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì)，而低頻率脈沖（8d脈沖）隨著溫度的升高，藻細(xì)胞總量逐漸顯現(xiàn)優(yōu)勢(shì)（圖6c，e），但是整體上仍小于1d脈沖；在高光照條件下（圖6b，d，f），連續(xù)添加磷酸鹽脈沖方式下的藻細(xì)胞總量在低溫和中溫下仍然占據(jù)優(yōu)勢(shì)（圖6b，d），但在高溫條件下（25℃，圖6f），中等添加磷酸鹽脈沖方式（2d和4d）下的藻細(xì)胞總量占據(jù)明顯優(yōu)勢(shì)，而連續(xù)添加（1d）和低頻脈沖（8d）下的藻細(xì)胞總量較低.

2.3 討論

本文采用實(shí)驗(yàn)的研究手段，模擬不同環(huán)境條件（溫度、光照）下磷酸鹽脈沖輸入對(duì)三角褐指藻生長的影響.在三角褐指藻的指數(shù)增長期，低光照低溫（10℃，圖1a）及高光照較高溫度下（18℃，25℃，圖1b），最大生長率μmax隨磷酸鹽輸入頻率的降低，均呈現(xiàn)出先降低后升高的顯著變化趨勢(shì)（圖1，P＜0.01）.中等頻率的磷酸鹽脈沖下，三角褐指藻具有相對(duì)較小的最大生長率μmax.也就是說，對(duì)于處于指數(shù)增長期的三角褐指藻，連續(xù)性的脈沖輸入和低頻率的脈沖輸入都可能促進(jìn)藻類生長率在短期內(nèi)升高.而低頻率脈沖（8d1次）相對(duì)于連續(xù)性的脈沖輸入（1d1次），三角褐指藻具有更大的μmax.在三角褐指藻的穩(wěn)定增長期內(nèi)，只有低溫下（10℃）磷酸鹽輸入頻率的變化影響不明顯. 在較高溫度下（18℃，25℃），最大生長率μmax隨磷酸鹽輸入頻率的降低，基本均呈現(xiàn)出升高的顯著變化趨勢(shì)（圖2，P＜0.01）.與指數(shù)增長期類似，三角褐指藻在磷酸鹽低頻脈沖下（8d1次）均具有較大的μmax.對(duì)于細(xì)胞數(shù)量而言，本文的結(jié)果也表明，連續(xù)脈沖（1d1次）和低頻脈沖輸入下，三角褐指藻整體上具有較大的細(xì)胞總量（圖6a，c，d，e），這與三角褐指藻的μmax的變化趨勢(shì)基本一致（圖1，2）.

低頻脈沖方式下（8d1次）磷酸鹽間歇性的大量供給增加了短期內(nèi)磷酸鹽的可利用量.對(duì)于營養(yǎng)鹽的濃度變化，浮游植物存在三種生理響應(yīng)策略:生長策略、親和策略和儲(chǔ)存策略［24］.由于三角褐指藻具有較高的生長率，是典型的“生長策略”者. 因而在磷酸鹽濃度增加時(shí)，會(huì)快速吸收從而獲得較高的生長率，這種現(xiàn)象在穩(wěn)定增長期表現(xiàn)的更為突出（圖2）.觀察細(xì)胞生物量的變化趨勢(shì)（圖3～圖5），我們發(fā)現(xiàn)，在磷酸鹽脈沖輸入條件下，藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)出與脈沖輸入頻率一致的波動(dòng)性，相關(guān)的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)［22］.這種現(xiàn)象表明，三角褐指藻具有較快的生長速率，并能及時(shí)的反映到細(xì)胞數(shù)量上（細(xì)胞密度）.

圖6 不同溫度和光照下三角褐指藻細(xì)胞總量的變化Fig.6 Changes of the total Phaeodactylum tricornutum biomass in different temperature and light

Sofie等［21］的研究結(jié)果也表明，高濃度營養(yǎng)鹽脈沖可能會(huì)極大的促進(jìn)有害赤潮藻的爆發(fā)性增殖，與本文的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致.但值得注意的是，在穩(wěn)定增長期，高光照和高溫下，三角褐指藻的μmax和細(xì)胞總量均有所降低（圖2b，圖6f）.這種現(xiàn)象表明，三角褐指藻的營養(yǎng)物的吸收能力跟溫度和光照強(qiáng)度均有關(guān)系.較高的光照強(qiáng)度和較高的溫度同時(shí)作用降低了三角褐指藻藻細(xì)胞的磷酸鹽吸收能力，導(dǎo)致μmax有所降低（圖2b）.藻類的光合自養(yǎng)特性和光輻射作為生態(tài)系統(tǒng)的能量來源，決定了光輻射是影響藻類生長的重要因子之一.而溫度則會(huì)直接影響藻類的生長速率乃至種群演替變化.藻華的形成涉及復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物過程，是多種因素共同作用的結(jié)果.本文的研究也表明，只有在一定的溫度和光照條件下，磷酸鹽輸入頻率的變化才會(huì)對(duì)三角褐指藻的生長產(chǎn)生顯著影響（P＜0.01）.證實(shí)了營養(yǎng)鹽、溫度和光照作為影響浮游植物生長的重要環(huán)境因子，具有顯著的交互作用.而其生理生態(tài)學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

3 結(jié)語

隨著溫度的升高，磷酸鹽脈沖輸入頻率對(duì)三角褐指藻生長的影響趨于顯著，整體上呈現(xiàn)出連續(xù)輸入（1d1次）和低頻脈沖（8d1次）更能促進(jìn)三角褐指藻生長的特征.但較高的光照強(qiáng)度和較高的溫度同時(shí)作用將抑制三角褐指藻的磷酸鹽吸收能力，降低其生長率和細(xì)胞數(shù)量.這些結(jié)果表明，溫度、光照和磷酸鹽脈沖輸入頻率對(duì)三角褐指藻的生長存在顯著影響，并且存在交互作用.

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The interactive effects of temperature， light， and pulsed phosphate supply on the growth of Phaeodactylum tricornutum.

ZHOU Hui-min， FENG Jian-feng*， ZHU Lin， LI Wen-jiao （Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria， Ministry of Education， Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control， College of Environmental Science and Engineering， Nankai University， Tianjin 300071， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：244～250

Effect of phosphate pulsed supply on the growth of Phaeodactylum tricornutum under different temperature and light levels wes explored. More significant effects of pulsed phosphate supply on Phaeodactylum tricornutum under higher temperature levels were found. The continuous phosphate supply and low-frequency pulses promoted rapid growth of Phaeodactylum tricornutum. However， the interactions of high temperature （18℃、25℃）and light intensity［125μmol/（m2·s）］would inhibit the absorption ability of Phaeodactylum tricornutum on phosphate. Results confirmed that temperature， light and pulsed phosphate supply had significant interactive influences on the Phaeodactylum tricornutum.

phosphate pulse supply；temperature；light；interaction；phytoplankton

X145

A

1000-6923（2015）01-0244-07

周慧敏（1986-），女，河南淮陽人，南開大學(xué)碩士研究生，主要從事海洋生物學(xué)研究.發(fā)表論文1篇.

2014-04-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41006065）

* 責(zé)任作者， 副教授， fengjf@nankai.edu.cn