苯并［a］芘在兩種海洋生物體內的富集動力學比較

李 磊，蔣 玫*，沈新強，王云龍，吳慶元，?？∠?，許高鵬（.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 00090；.上海海洋大學海洋科學學院，上海 0306）

苯并［a］芘在兩種海洋生物體內的富集動力學比較

李 磊1，蔣 玫1*，沈新強1，王云龍1，吳慶元2，?？∠?，許高鵬2（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306）

應用半靜態(tài)雙箱動力學模型在室內模擬了脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）對苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，BaP）的生物富集實驗，通過對富集與釋放過程中兩種海洋生物體內BaP的非線性曲線擬合，獲得兩種海洋生物對BaP的吸收速率常數(shù)k1、釋放速率常數(shù)k2、生物富集因子BCF、平衡狀態(tài)下生物體內BaP含量CAmax、生物學半衰期B1/2等動力學參數(shù).擬合結果顯示:脊尾白蝦k1的平均值為18.80，k2的平均值為0.08，BCF的平均值為228.02，CAmax的平均值為46.78ng/g，B1/2的平均值為8.95d；三疣梭子蟹k1的平均值為22.55，k2的平均值為0.14，BCF的平均值為158.11，CAmax的平均值為32.70ng/g，B1/2的平均值為5.43d.兩種海洋生物對BaP的k1、k2、BCF均隨BaP暴露濃度的增大而減少，CAmax、B1/2隨BaP暴露濃度的增大而增大.表明BaP容易在兩種海洋生物體內富集，脊尾白蝦對BaP的最高富集量高于三疣梭子蟹，前期富集速率高于后期，對BaP的釋放主要集中在前期，后期釋放速率放緩.

脊尾白蝦；三疣梭子蟹；苯并［a］芘；生物富集；動力學

多環(huán)芳烴（PAHs）是指是指2個或2個以上苯環(huán)以稠環(huán)的形式連接形成的一類典型持久性有機污染物（POPs），包括萘、蒽、菲、芘等及其衍生物達400多種［1］.PAHs的來源廣泛，化石燃料（煤、石油）的不完全燃燒等人類活動是其來源的主要途徑［2］.在世界范圍內每年約有23萬t進入海洋環(huán)境［3］.大部分PAHs具有潛在的致癌性、致突變性和其他毒理效應，是環(huán)境中致癌化學物質中最大的一類，其中16種被美國環(huán)保署（EPA）確定為優(yōu)先控制的有機污染物質，中國將其中7種列為優(yōu)先控制的有機污染物質［4-5］.這其中，苯并［a］芘（BaP）

是致癌性最強的PAHs，常被視為PAHs研究的指示物，通過研究它在環(huán)境中的產(chǎn)生、遷移、轉化、降解及毒理作用來判斷PAHs的污染情況，已成為國內外環(huán)境監(jiān)測的重要指標之一［6-7］.BaP在生物體內的富集動力學參數(shù)的獲得則是研究BaP在海洋生物體內長期生物生物富集效應的前提，同時也是研究BaP污染對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響和建立多介質環(huán)境模型的基礎，對研究BaP在海洋環(huán)境中的遷移、變化和歸宿以及環(huán)境評價等也具有重要意義，目前國內外對與BaP關系密切的PAHs污染在海洋生物體內的富集規(guī)律研究［8-9］較多，而單獨針對BaP僅見BaP在河口貝類（Rangia Cuneata）體內累積、釋放規(guī)律研究［10］，海洋貝類（Chlamys farreri）體內的毒代動力研究［11］，而缺乏BaP在海洋甲殼類生物富集過程的動力學描述.因此本文以半靜態(tài)雙箱動力學模型［12］為基礎，脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）為研究對象，通過對富集與釋放過兩種海洋生物體內BaP含量的動態(tài)檢測以及對檢測結果的非線性曲線擬合，結合對模型的擬合優(yōu)度檢驗，量化BaP在兩種海洋生物體內的生物富集系數(shù)，系統(tǒng)地認識其動力學參數(shù)特性，比較不同濃度BaP在兩種海洋生物體內的生物富集特征，探討B(tài)aP在兩種海洋生物內的富集機理，為研究、預測生物體對BaP污染的響應，同時為BaP生態(tài)風險的預測提供基礎數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海水為自然海區(qū)海水，鹽度為21，pH值為8.2，進行沉淀、砂濾，充分曝氣（24h以上）后備用，受試脊尾白蝦為自然海區(qū)捕獲、三疣梭子蟹為土塘養(yǎng)殖，實驗前將兩種海洋生物馴養(yǎng)15d后挑選健康個體進行實驗.脊尾白蝦的個體體重平均為（2.71±0.43）g，三疣梭子蟹的個體體重平均為（10.89±2.20）g.實驗使用150L的特制玻璃容器（經(jīng)檢測，空白組24h內BaP含量無顯著性差異（P＞0.05））.BaP購自Sigma公司（Sigma-Aldrich Corporation， USA），使用丙酮作為助溶劑配置母液.

1.2 富集、釋放實驗

實驗分為富集和釋放兩個階段，分別各進行15d，濃度梯度設為5組，其中3組為實驗組，1組為海水對照組，1組為丙酮對照組（丙酮體積比＜0.01%），每組設3個重復.為了增加兩種海洋生物實驗組之間的可比性，根據(jù)預實驗結果，在預實驗的安全濃度范圍內，將兩種海洋生物實驗組濃度梯度均設為:0.45，0.15，0.05μg/L.每個容器內分別放入70尾脊尾白蝦，40只三疣梭子蟹.24h保持充氧，溶氧量＞5mg/L，實驗期間水溫為23.6～24.4℃.

富集階段:整個實驗過程中加入海水量為100L，每24h 100%換水1次.脊尾白蝦、三疣梭子蟹餌料均為配合飼料（青島六合飼料有限公司），每天定時定量喂食（8:00和18:00投喂一次，投喂量為受試生物體質量的2%）.分別于第0，3，5，10，15d采集5尾脊尾白蝦，2只三疣梭子蟹樣品，剝殼取肌肉組織，勻漿，迅速冷凍，以備分析.

釋放階段:富集階段結束后將容器中的溶液全部排出，在流水條件下（流速3.6L/h）進行BaP的釋放實驗.分別于第18，20，25，30d采集5尾脊尾白蝦、2只三疣梭子蟹樣品，投喂、取樣方法與富集階段一致.

1.3 樣品分析

脊尾白蝦、三疣梭子蟹體內BaP的含量參照吳文婧等［13］的方法測定，取樣品5g，加適量無水硫酸鈉研磨，用100mL二氯甲烷和正己烷的混合溶劑（體積比4:1）索式提取24h（60℃水?。?提取完畢將混合溶劑轉換至正己烷溶劑，并濃縮至3mL，利用乙腈和正己烷進行液液萃取，萃取后樣品經(jīng)硅膠柱凈化，以正己烷為固定相，50mL二氯甲烷和正己烷混合溶劑（體積比2:3）為流動相，濃縮凈化后的樣品至0.2mL，加內標檢測.采用GC6890（HP-5MS毛細管色譜柱，30m×0.25mm× 0.25μm）分離，MSD檢測器（Agilent 5973）檢測BaP含量，檢出限為0.1ng/g.每批樣品的處理過程中，進行空白實驗，在空白樣品中加標測定回收率，進行質量控制樣品的檢測，回收率在80～120%，相對標準偏差小于10%，以峰面積對質量濃度作線性回歸分析，繪制標準曲線，線性關系良好，其相關系數(shù)（R）大于0.99.

1.4 半靜態(tài)雙箱動力學模型

半靜態(tài)雙箱動力學模型［12］通常假設污染物在生物體內的生物富集可近似看作是污染物在水相和生物體之間的兩相分配過程，同時考慮到了富集和釋放兩個過程，即生物體從環(huán)境中吸收、富集并釋放污染物，富集、釋放過程可用一級動力學過程進行描述.

其主要描述如下圖所示:

圖1 生物富集雙箱動力學模型Fig.1 Two-compartment kinetic model of accumulation

式中:k1為生物吸收速率常數(shù)；k2為生物釋放速率常數(shù)；kv為揮發(fā)速率常數(shù)；kM為生物體的代謝速率常數(shù)；CW為水體污染物濃度，μg/L；CA為生物體內污染物濃度，ng/g.在公式的推導過程中，忽略水體中污染物的自然揮發(fā)及生物體的代謝.

由式（2）得出富集過程（0＜t＜t*），其中t*為富集階段結束的天數(shù)（d）:

式中:C0為實驗開始前生物體中的污染物含量，ng/g，釋放過程（t＞t*）:

由式（3）和（4），通過非線性擬合得到k1、k2.理論中，平衡狀態(tài)下，BCF用以下公式得到:

生物的半衰期指的是生物因生命活動過程的結果，體內累積的污染物釋放一半所需的時間，用公式表示為:

富集達到平衡時，生物體內污染物含量CAmax用式表示為:

即使沒有達到濃度平衡，雙箱動力學模型也可以用來計算理論中平衡狀態(tài)下的動力學參數(shù).

1.5 數(shù)據(jù)處理及模型的擬合優(yōu)度檢驗

使用OriginPro 8軟件對富集和釋放過程中兩種海洋生物體內BaP含量進行非線性曲線擬合，通過判定系數(shù)R2來評價雙箱動力學模型的擬合優(yōu)度，采用F檢驗對模型整體的顯著性進行檢驗，并對模型的輸出值和實際值進行配對t檢驗，同時利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗對各處理組兩種海洋生物體內BaP含量進行統(tǒng)計比較，當P＜0.05時，差異顯著.

2 結果與討論

2.1 丙酮作為BaP助溶劑的可行性及配合飼料的影響

在本實驗中使用丙酮作為助溶劑來溶解BaP，使用配合飼料投喂受試生物，經(jīng)檢驗，在整個實驗過程中，丙酮處理組與海水對照組中脊尾白蝦、三疣梭子蟹體內的BaP含量分別為（6.71± 0.34），（6.69±0.17）ng/g，無顯著性差異（P＞0.05），可見用丙酮作為BaP助溶劑是可行的，同時也說明投喂配合飼料對實驗結果沒有影響.

2.2 兩種海洋生物對BaP的生物富集擬合結果

通過對富集和釋放過程中兩種海洋生物體內BaP的動態(tài)檢測，并采用式（3）和式（4）對檢測結果進行非線性曲線擬合，得到不同暴露濃度下兩種海洋生物對BaP的富集與釋放曲線，兩種海洋生物的生物富集變化趨勢基本一致（圖2）.

圖2 不同濃度BaP濃度條件下脊尾白、三疣梭子蟹體內BaP的生物富集曲線Fig.2 Bioccumulation and elimination curves of BaP in E. carinicauda and P. trituberculatus at different concentration

在脊尾白蝦、三疣梭子蟹對BaP的富集階段，BaP富集量隨水體BaP濃度的增加而增加，脊尾白蝦體內BaP富集量增加幅度分別為15.53（0.45μg/L），7.02（0.15μg/L），3.78ng/（g·d）（0.05μg/L）；三疣梭子蟹體內BaP富集量增加幅度分別為9.98（0.45μg/L）， 6.13（0.15μg/L）， 3.66ng/（g·d）（0.05μg/L）.在富集前期兩種海洋生物體內BaP含量快速增加，脊尾白蝦、三疣梭子蟹體內BaP含量在富集的前3d增加幅度最高均為0.45μg/L實驗組，增加幅度分別為14.61，11.52ng/（g·d）.隨著富集時間的延長，兩種海洋生物體內BaP含量增加速度減慢，在富集的最后5d，盡管富集時間較長，但前期脊尾白蝦、三疣梭子蟹BaP增加量最高的0.45μg/L實驗組增加幅度僅分別為8.59，4.27ng/（g·d）.在兩種海洋生物對BaP的釋放階段，BaP的釋放量均隨水體BaP濃度的增加而降低，脊尾白蝦體內BaP釋放量分別為73.62%（0.45μg/L）、82.55%（0.15μg/L）、87.67%（0.05μg/L）；三疣梭子蟹體內BaP釋放量分別為74.47%（0.45μg/L）、86.25%（0.15μg/L）、92.67%（0.05μg/L）.在釋放前期兩種海洋生物體內BaP含量急劇下降，脊尾白蝦、三疣梭子蟹體內BaP在釋放的前3d下降幅度最高均為0.05μg/L實驗組，下降幅度分別為45.56%、52.06%.隨著釋放時間的延長，兩種海洋生物體內BaP濃度釋放速度減慢，在釋放的最后5d，盡管釋放時間較長，脊尾白蝦、三疣梭子蟹體內前期BaP釋放量最高0.05μg/L實驗組下降幅度僅分別為34.87%、42.06%.

BaP作為PAHs的典型代表，具有很強的脂溶性，可以通過呼吸、體表滲透和食物鏈傳遞的方式進入海洋生物體內［14］.被吸收的BaP迅速溶于脂肪，由于其性質穩(wěn)定，難以被生物體分解排泄，隨著攝入量的增加，在海洋生物體內含量會逐漸增大，因此在BaP污染水體中生物體具有很高的生物富集系數(shù)，即使水體中BaP濃度很低，生物體中富集量也能達到很高水平［11］.本實驗研究發(fā)現(xiàn)，水體中的BaP能在兩種海洋生物體內快速富集并達到很高的濃度，脊尾白蝦體內最高富集量達到了239.58ng/g（0.45μg/L），增加幅度為15.53ng/（g·d），三疣梭子蟹體內最高富集量達到了152.98ng/g（0.45μg/L），增加幅度為9.98ng/（g·d），但在同等濃度（0.05μg/L）條件下與貝類相比，兩種海洋生物的富集量依然較低［11］.

2.3 不同濃度BaP在兩種海洋生物體內的富集動力學參數(shù)

根據(jù)兩種海洋生物體內BaP的富集與釋放過程的非線性曲線擬合，得到吸收速率k1，釋放速率常數(shù)k2，然后根據(jù)式（5）～（7），得到BCF、CAmax、B1/2的動力學參數(shù)（表1），脊尾白蝦、三疣梭子蟹對BaP的吸收速率常數(shù)k1范圍分別為12.34～24.96、13.24～32.64，平均值分別為18.80、22.55，均隨外部水體中BaP濃度的增大而減少；對BaP的釋放速率常數(shù)k2范圍分別為0.06～0.10、0.09～0.19，平均值分別為0.08、0.14，均隨外部水體中BaP濃度的增大而減少；對BaP的生物富集系數(shù)BCF范圍分別為208.41～248.03、147.11～ 171.79，平均值分別為228.02、158.11，均隨著外部水體BaP濃度的增大而減少；平衡狀態(tài)下BaP含量CAmax的范圍分別為12.40～93.79，8.59～66.20ng/g，平均值分別為46.78，32.70ng/g，均隨著外部水體BaP濃度的增大而增大；生物學半衰期B1/2范圍分別為6.89～11.71，3.65～7.70d，平均分別為8.95，5.43d，均隨著外部水體BaP濃度的增大而增大.

生物體的脂肪組織是有機化合物生物富集的主要位點［15］，而三疣梭子蟹肌肉組織中脂肪含量高于脊尾白蝦［16-17］，但三疣梭子蟹對BaP的吸收速率（k1）高于脊尾白蝦（表1），這似乎與上述脊尾白蝦體內BaP富集量增加幅度高于三疣梭子蟹結果矛盾，但從表1可以看出，三疣梭子蟹對BaP的釋放速率（k2）高于脊尾白蝦，吸收速率（k1）、釋放速率（k2）的共同作用是最終控制脊尾白蝦BaP富集量增加幅度高于三疣梭子蟹的主要因素.因此，不同海洋生物的生理、生態(tài)等特征的差異對BaP的生物富集有著密切的關系［15，19］.同時，研究表明［18］，如果有機化合物在生物體內的BCF值小于100，則可認為該化合物對環(huán)境的影響較小，不易在水生生物體內富集，在本研究中，兩種海洋生物三組不同濃度BaP實驗組的BCF均高于100，表明BaP容易在兩種海洋生物體內富集.

BaP在兩種海洋生物體內的生物富集動力學參數(shù)均呈現(xiàn)規(guī)律性的變化特征，前期富集量快速增加，后期增速逐漸趨緩（圖2），吸收速率（k1）、釋放速率（k2）、BCF隨水體BaP濃度的增加而降低（表1），這可能主要受BaP在水相和脂肪相之間的分配平衡以及BaP誘導的以解毒代謝酶為代表的解毒代謝系統(tǒng)的變化影響［15，20］.在富集初期，由于兩種海洋生物體內BaP含量較低，水體中BaP通過主動或被動吸收迅速分配到生物體內，盡管在CYP450酶、抗氧化酶等解毒代謝酶的轉化脫毒及生物排泄作用下部分BaP以水溶性產(chǎn)物的形式被并釋放到水體中，但此時兩種海洋生物對BaP的吸收速率（k1）依然高于釋放速率（k2），整體依然表現(xiàn)為富集量的快速增加，隨著兩種海洋生物體內BaP富集量趨于飽和，兩種海洋生物吸收BaP速率趨于低水平平穩(wěn)狀態(tài)，吸收、釋放兩個過程漸趨平衡，富集曲線也趨于平緩.同時，與低濃度BaP相比較，高濃度BaP更接近兩種海洋生物的毒性效應閥值，解毒代謝酶更容易受到損傷，對BaP的代謝能力相比也較弱［21］，這種影響直接反應在釋放速率（k2）的變化上，并最終引起B(yǎng)CF隨水體BaP濃度的增加而降低.這種在低濃度有機化合物的條件下所得的BCF比高濃度條件要高的情況與水生生物對苯酚［20］、阿特拉津［22］等有機化合物的生物富集特征一致，具有一定的普遍性.

表1 兩種海洋生物對不同濃度BaP的富集動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of bioaccumulation of BaP in E. carinicauda and P. trituberculatus at different concentration

同樣，這兩種控制因子也體現(xiàn)在兩種海洋生物對BaP的釋放階段，前期，兩種海洋生物體內的BaP被迅速分配到水相中，隨著BaP含量的降低，釋放速率（k2）降低并趨向于平緩.同時，低濃度BaP條件下解毒代謝酶的代謝活動更加活躍，釋放速率（k2）高于高濃度BaP實驗組，這也直接體現(xiàn)在生物半衰期（B1/2）的變化上，低濃度BaP條件下生物半衰期（B1/2）更小，BaP更容易被釋放.但在15d后，脊尾白蝦、三疣梭子蟹體內BaP釋放量最大的實驗組（0.05μg/L）也未能將體內BaP完全排除，殘留量依然均超過了本底值，表明脊尾白蝦對BaP具有一定的排出能力，但依然具有相當?shù)臍埩袅?，這與貝類［11］體內的BaP釋放趨勢類似，表明BaP較難被生物體代謝.

2.4 模型的擬合優(yōu)度檢驗

利用判定系數(shù)R2對對富集和釋放過程中兩種海洋生物體內BaP的非線性曲線擬合結果進行檢驗，兩種海洋生物各組擬合曲線判定系數(shù)R2范圍分別為0.94～0.97、0.72～0.96（表2），擬合程度良好，同時F檢驗結果（表2）表明模型回歸方程是顯著的（P＜0.05），在模型顯著性基礎上，對模型的輸出值和實際值進行配對t檢驗，在α=0.05條件下，所有的P＞α（表2），即模型輸出結果和實際值差異不顯著，上述檢驗結果表明，本實驗條件下半靜態(tài)雙箱動力學模型應用于兩種海洋生物對BaP的生物富集動力學研究是可信的.

表2 半靜態(tài)雙箱動力學模型用于兩種海洋生物對BaP生物富集的擬合優(yōu)度檢驗信息Table 2 Summary of statistical information to assess the goodness-of-fit of the two compartment models applied in the bioaccumulation of BaP in E. carinicauda and P. trituberculatus

3 結論

3.1 脊尾白蝦對BaP的最高富集量高于三疣梭子蟹，分別為239.58，152.98ng/g，最高增加幅度分別為15.53，9.98ng/（g·d），前期富集迅速，后期富集速率逐漸下降，對BaP的釋放主要集中在前期，后期釋放速率放緩，模型擬合結果良好；

3.2 脊尾白蝦、三疣梭子蟹對BaP的吸收速率常數(shù)k1范圍分別為12.34～24.96、13.24～32.64，釋放速率常數(shù)k2范圍分別為0.06～0.10、0.09～0.19，BCF范圍分別為208.41～248.03、147.11～171.79，均隨外部水體中BaP濃度的增大而減少， CAmax范圍分別為12.40～93.79，8.59～66.20ng/g，生物學半衰期B1/2范圍分別為6.89～11.71，3.65～7.70d，隨外部水體中BaP濃度的增大而增大.

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Kinetic study of the bioaccumulation of benzo ［a］pyrene in two sea creature’s tissues.

LI Lei1， JIANG Mei1*， SHEN Xin-qiang1， WANG Yun-long1， WU Qing-yuan2， NIU Jun-xiang2， XU Gao-peng2（1.East China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 200090， China；2.College of Marine Sciences， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：291～297

Benzo ［a］pyrene （BaP） was one of the most important pollutants in the marine environment. To understand the bioaccumulation characteristics of BaP in Exopalaemon carinicauda and Portunus trituberculatus， the kinetic parameters （uptake rate constant （k1）， elimination rate constant （k2）， bioaccumulation factor （BCF）， and biological half-life （B1/2） of the BaP bioaccumulation and elimination in crustaceans E. carinicauda and P. trituberculatus tissues were determined used the semi-static two-compartment kinetic model. The range of k1，k2， BCF， CAmaxand B1/2was 12.34 to 24.96， 0.06 to 0.10， 208.41 to 248.03， 12.40 to 93.79ng/g， 6.89 to 11.71days， respectively， the average value of k1，k2， BCF， CAmaxand B1/2was 18.80， 0.08， 228.02， 129.07ng/g， 8.95days for BaP in the E. carinicauda tissues. And in the P. trituberculatus tissues， the range of k1，k2， BCF， CAmaxand B1/2was 8.59to 66.20， 0.09to 0.19， 147.11to 171.79，8.59 to 66.20ng/g， 3.65 to 7.70 days， respectively， the average value of k1，k2， BCF， CAmaxand B1/2was 22.55， 0.14，158.11， 32.70ng/g， 5.43 days. It was found that the uptake rate constant （k1）， elimination rate constant （k2） and bioaccumulation factor （BCF） in E. carinicauda and P. trituberculatus tissues generally decreased with the increase in BaP exposure concentration in ambient seawater， the CAmax， B1/2was increased with the increase in BaP exposure concentration in ambient seawater. The results showed that BaP could easily cause bioaccumulation in E. carinicauda and P. trituberculatus tissues， the bioaccumulation contents in E. carinicauda tissues was higher than in P. trituberculatus tissues， the bioaccumulation rate in early stage was higher than the bioaccumulation stage in later，where the release rate of BaP become slower in later stage.

Exopalaemon carinicauda；Portunus trituberculatus；benzo ［a］pyrene；bioaccumulation；kinetics

X171

A

1000-6923（2015）01-0291-07

李 磊（1985-），男，安徽亳州人，助理研究員，研究方向為海洋生態(tài)毒理學.發(fā)表論文25篇.

2014-01-28

上海市科學技術委員會項目（12231203403）；農(nóng)業(yè)部應對溢油關鍵技術專項（2012-2014）；中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務費（NO.2014A02XK01）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（2014T06）

* 責任作者， 研究員， jiangrose73@163.com