碳茵調(diào)控對(duì)蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)微生物群落功能多樣性的影響

李杰　田相利　董雙林　張凱　王文君　宋嬌嬌　張慶起

摘要：利用Biolog生態(tài)板方法和冗余分析（RDA）等方法，分析了菌碳調(diào)控對(duì)蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體細(xì)菌群落功能多樣性的影響，探討了水體微生物群落多樣性與不同環(huán)境因子間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加益生菌制劑和糖蜜調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體中菌群結(jié)構(gòu)，共設(shè)6個(gè)處理，分別是為短小芽孢桿菌（C2）、蠟樣芽孢桿菌（C3）、硝化細(xì)菌制劑（C4）、EM制劑（C5），以未添加菌制劑的處理為對(duì)照組（C1），另外以未添加碳源和菌制劑的處理為對(duì)照組（C0）。研究結(jié)果表明，不同菌碳下細(xì)菌群落對(duì)底物碳的利用數(shù)量和代謝強(qiáng)度存在較大差異。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組C3的碳代謝活性和對(duì)碳源的利用強(qiáng)度總體上高于其它處理組，而處理組C4較低和對(duì)照組CO相差不大。PCA分析結(jié)果表明，不同處理的細(xì)菌群落處于動(dòng)態(tài)變化之中，反映出細(xì)菌群落的組成和代謝特征出現(xiàn)了顯著差異，其中處理組C3和C4間差異最為顯著。處理組C3的多樣性指數(shù)如Simpson指數(shù)Shannon指數(shù)和S--E均勻度均較高，而處理組C4則較低。RAD分析表明，碳菌調(diào)控條件下，影響細(xì)菌群落碳代謝功能的主要環(huán)境因子7月為：Chl a、PO4--P、NO2-N、NH4+-N；8月為：NO3--N、NO2-N、TP、TN和PO4-一P；9月為：TP、Chl a、PO4-一P和NO2--N。綜合水質(zhì)指標(biāo)和細(xì)菌群落對(duì)碳源的代謝功能的分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)初步表明在C/N為15的蝦、蟹混養(yǎng)水體中添加蠟樣芽孢桿菌，細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)及對(duì)碳源的代謝功能為最佳。

關(guān)鍵詞：碳氮比；細(xì)菌群落；BIOLOG；多樣性指數(shù)；RDA分析

蝦、蟹混養(yǎng)是一種重要的人工養(yǎng)殖模式，該模式具有充分利用養(yǎng)殖系統(tǒng)時(shí)間和空間資源、降低餌料系數(shù)和預(yù)防相關(guān)動(dòng)物疾病的發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)，能夠提供較高的養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。人工養(yǎng)殖系統(tǒng)中，生物鏈短，營(yíng)養(yǎng)級(jí)少，水體中通常會(huì)殘留大量的殘餌、糞便和生物殘?bào)w等，從而導(dǎo)致氨氮、亞硝氮、硫化氫、胺類等有害物質(zhì)積累增加，當(dāng)其超過(guò)養(yǎng)殖系統(tǒng)自凈能力時(shí)，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的惡化以及養(yǎng)殖生物疾病的暴發(fā)。

微生物在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)以及凈化水環(huán)境中具有重要作用。異養(yǎng)細(xì)菌可以分解系統(tǒng)中的有機(jī)物，加速氮循環(huán)，從而降低養(yǎng)殖水體中的碳氮比。然而異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖與水體中碳和氮含量密切相關(guān)，根據(jù)生物絮團(tuán)原理，改變水體C/N比可以促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖，從而降低水體氨氮濃度進(jìn)而對(duì)穩(wěn)定養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)揮調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道，施加微生態(tài)制劑可對(duì)弧菌等致病菌產(chǎn)生拮抗作用，從而有利于芽孢桿菌和硝化細(xì)菌等益生菌對(duì)養(yǎng)殖水體凈化作用及對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)改善作用的發(fā)揮，進(jìn)而促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)。李卓佳等在蝦池中添加芽孢桿菌，降低養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝氮濃度，穩(wěn)定了養(yǎng)殖環(huán)境。張曉陽(yáng)等通過(guò)菌碳調(diào)控，降低養(yǎng)殖系統(tǒng)中氨氮、亞硝氮濃度和餌料系數(shù)，提高了凡納濱對(duì)蝦的成活率及產(chǎn)量。

Biolog-Eco板技術(shù)可以反映環(huán)境微生物群落特征，主要是根據(jù)細(xì)菌群落對(duì)不同碳源利用程度的差異來(lái)表征其功能多樣性，現(xiàn)已被廣泛用于微生物群落功能多樣性的研究。鑒于異樣細(xì)菌對(duì)水體環(huán)境的凈化作用及弧菌致病作用，本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分析了碳氮比調(diào)控對(duì)蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量的變動(dòng)，利用Biolog-Eco微平板法探討了不同處理水體中細(xì)菌群落功能多樣性的變化，并結(jié)合RDA分析研究了水體細(xì)菌群落碳代謝功能與環(huán)境因子之間的關(guān)系，以期在微生物群落功能方面為蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)中應(yīng)用菌碳調(diào)控技術(shù)提供一定的參考。

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)池塘與圍隔

本研究于2014年7-10月在江蘇省贛榆縣佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司海水養(yǎng)殖池塘中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)利用海水池塘陸基圍隔進(jìn)行，面積5m×5m，水深1.2～1.5m，底質(zhì)為泥沙質(zhì)。實(shí)驗(yàn)圍隔結(jié)構(gòu)參見文獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)期間，養(yǎng)殖水體利用充氣泵進(jìn)行連續(xù)充氣。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理組，每組設(shè)3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加菌制劑和糖蜜調(diào)節(jié)養(yǎng)殖系統(tǒng)，分別命名為C2（短小芽孢桿菌，1×10⁴cfu/mL）、C3（蠟樣芽孢桿菌，1×10⁴cfu/mL）、C4（硝化細(xì)菌，2×10⁴cfu/mL）、C5（EM菌，1×10⁴cfu/mL），以未潑灑菌制劑的處理為對(duì)照組C1，另外設(shè)未添加糖蜜和菌制劑的處理為對(duì)照組CO。其中，所用短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌均由中國(guó)海洋大學(xué)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離于蝦蟹養(yǎng)殖池塘；硝化細(xì)菌為德國(guó)某品牌氨硝凈；EM菌來(lái)源于日本某品牌EM菌。

實(shí)驗(yàn)圍隔中均放養(yǎng)三疣梭子蟹密度為6ind/m²，放養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦密度為45ind/m²。實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹苗及凡納濱對(duì)蝦皆購(gòu)自連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司。三疣梭子蟹于7月15日放苗，放苗時(shí)平均甲寬（7.27±1.91）cm，平均甲長(zhǎng)（3.50±0.29）cm，平均體重（19.80±3.27）g；凡納濱對(duì)蝦經(jīng)暫養(yǎng)后于7月20日放苗，放苗時(shí)體長(zhǎng)（1.37±0.20）cm，平均體重（0.05±0.01）g。于10月5日收獲完畢。

根據(jù)Avnimelech與盧炳國(guó)等總結(jié)的生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的C/N公式，根據(jù)餌料投喂量調(diào)整糖蜜的添加量，通過(guò)添加糖蜜調(diào)控C/N水平為15。三疣梭子蟹餌料選用鮮活藍(lán)蛤（殼肉比為3.27，含水率為78.29%，含碳量32.78%，含氮量9.76%）；凡納濱對(duì)蝦選用連云港正大農(nóng)牧有限公司生產(chǎn)的對(duì)蝦配合飼料（含水率7.00%，含碳量34.65%，含氮量6.72%）。添加碳源為購(gòu)于山東壽光某公司的糖蜜（總有機(jī)碳含量28.91%）。

1.2.2實(shí)驗(yàn)管理鮮活藍(lán)蛤每日18：00-19：00投喂1次，投喂量參照周演根等。對(duì)蝦餌料每天7：00-8：00與18：00-19：00投喂2次。每7天檢查生長(zhǎng)，根據(jù)蝦蟹生長(zhǎng)情況調(diào)整餌料投喂量。

養(yǎng)殖期間圍隔不換水，僅補(bǔ)充因蒸發(fā)與滲漏造成的損失，水深保持在1.2～1.4 m之間。7月底開始使用增氧機(jī)充氧。每晚10：00至次日清晨6：00充氣，晴天下午2：00到4：00充氣，并根據(jù)天氣狀況調(diào)整。隨著餌料投喂量與糖蜜添加量的增加，生物絮團(tuán)逐步形成后調(diào)整成全天24 h連續(xù)充氧。糖蜜根據(jù)投餌量隨時(shí)調(diào)整，充分溶解后潑灑，每2天潑灑一次，天氣狀況不好不潑灑。

本實(shí)驗(yàn)所用蠟樣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和硝化細(xì)菌活化后，每7～10d潑灑一次，選擇在有風(fēng)的晴天上午，潑灑糖蜜后施用。從2014年7月25日到9月30日，菌劑共潑灑7次。

1.3樣品采集與預(yù)處理

本實(shí)驗(yàn)于2014年7-9月開展。每月下旬，用采水器在實(shí)驗(yàn)圍隔的3個(gè)固定點(diǎn)采集中層水樣，混合每個(gè)處理的3個(gè)重復(fù)水樣，然后經(jīng)800目篩絹過(guò)濾，取適量混勻水樣置于無(wú)菌的聚乙烯瓶中，將采集水樣于4℃保溫箱迅速帶回實(shí)驗(yàn)室待分析。

1.4日常水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

每天上午6：00-7：00用溫度計(jì)測(cè)定水溫（T），用便攜式溶氧儀（SX716，上海三信儀表廠）測(cè)定溶氧（DO），每7天用便攜式pH計(jì)（pH-033，ATC）測(cè)pH，手持式折光儀（Reef Octopus）測(cè)鹽度（S）。

按照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB/T12763.4-2007）中推薦的方法測(cè)定的水體中總氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽（NO-一N）、硝酸鹽（NOa—N）、總氮（TN）、活性磷（PO4-P）、總磷（TP）。NH4+-N測(cè)定采用靛酚藍(lán)法，NO2-N測(cè)定采用重氮一偶氮法，NO2-N測(cè)定使用鋅鎘還原法，PO4-P測(cè)定采用鉬藍(lán)法，TN和TP采用過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）氧化法。葉綠素a采用金相燦等的方法測(cè)定。

1.5Biolog-ECO板反應(yīng)

Biolog-ECO板含6類碳源共31種底物碳（3個(gè)重復(fù)）的96孔板。板上含有三個(gè)對(duì)照孔，根據(jù)微生物對(duì)碳源底物的利用情況來(lái)分析微生物群落碳代謝特征（功能多樣性）。本實(shí)驗(yàn)將150μL的樣品原液或者經(jīng)無(wú)菌0.85 9/6NaCl溶液進(jìn)行10倍稀釋的水樣加人ECO板的孔內(nèi)，避光條件下恒溫（28℃）培養(yǎng)，酶標(biāo)儀分別測(cè)點(diǎn)樣后7d（0、24、48、72、96、120、144、168h）內(nèi)590 nm和750nm下的光密度值。

1.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

平均顏色變化率（average well color devel-opment，AWCD）主要用于檢測(cè)微生物對(duì)單一碳底物的利用能力計(jì)算方法l_1。]如下：

AWCD=∑[（C1—R）—（Ci—R）750]/n

式中：Ci為i孔碳底物光密度值；R為對(duì)照孔碳底物光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)（取值隨碳源種類數(shù)的變化而變化）。每個(gè)單孔的實(shí)際光密度值為該碳底物在590nm與750nm的光密度差值，其中數(shù)值取值>0.06。

本研究用培養(yǎng)72h的測(cè)定的Biolog數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算細(xì)菌群落對(duì)六大碳源的利用強(qiáng)度、主成分分析及功能多樣性指數(shù)。其中多樣性指數(shù)主要包括：Shannon指數(shù)（評(píng)估細(xì)菌的豐度和均度），McIntosh指數(shù)（評(píng)估細(xì)菌群落多維空間多樣性），Simpson指數(shù)（評(píng)估最常見種優(yōu)勢(shì)度），S—E均勻度指數(shù)（評(píng)估細(xì)菌均度）。

本研究利用PCA分析和單因子方差分析（One-way ANOVA）來(lái)探討不同處理在相同時(shí)間內(nèi)細(xì)菌群落碳代謝特征的差異性。利用Ex-cel2013、SigmaPlotl2.5、SPSSl7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，以P

2.結(jié)果

2.1碳氦比調(diào)控對(duì)蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中環(huán)境因子指標(biāo)

表1結(jié)果顯示，除T、pH和S外，不同處理組水體環(huán)境因子指標(biāo)均存在顯著差異，但不同指標(biāo)趨勢(shì)有所不同?？傮w上，各菌碳添加組N、P指標(biāo)含量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。其中，NOz—N以C2和C5最低，而除了C2，其它處理組NH4+一N濃度均顯著低于對(duì)照組；各添加菌碳處理組相比，C1和C2中Chl a和TP顯著高于其余處理組（P<0.05）。

2.2碳氮比調(diào)控對(duì)蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落功能多樣性

2.2.1

平均顏色變化率（AWCD）

圖1為不同養(yǎng)殖模式水體中細(xì)菌群落AWCD值隨養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的動(dòng)態(tài)變化。在同一時(shí)期，不同處理水體中細(xì)菌群落利用Biolog板上的碳源總量隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)行總體上呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)，在不同時(shí)期，同一處理細(xì)菌群落對(duì)碳源總量的利用速度和能力均出現(xiàn)差異。7月，對(duì)照組CO的AWCD值最高，顯著高于處理組C1和C2（P<0.05），與其余處理組差異不顯著（P>0.05）。8月，處理組C3的AWCD值最高，明顯高于其它處理組，C2組次之，而對(duì)照組CO則降到最低值。9月，處理組C1、C3和C5的AWCD相差不大，水平較高，均顯著高于其他處理組（P<0.05）。

2.2.2

對(duì)六大碳源的利用變化

圖2為不同養(yǎng)殖模式水體細(xì)菌對(duì)ECO板上不同類型碳源（聚合物、糖、羧酸、酚、胺和氨基酸）的利用情況。根據(jù)AWCD值可以看出，水體細(xì)菌對(duì)碳源利用具有選擇性，主要為聚合物、糖類和氨基酸，且在養(yǎng)殖中后期差異顯著。7月，以利用聚合物、糖類和氨基酸為主，不同處理對(duì)同一類型碳源的利用強(qiáng)度差異不顯著（P>0.05）。8月，不同處理對(duì)六大碳源的利用強(qiáng)度均顯著差異（P<0.05），均主要利用聚合物，糖類和氨基酸，其中處理組C3對(duì)這三類碳源的利用強(qiáng)度最高，顯著高于對(duì)照組CO和C1。9月，不同處理對(duì)六大碳源的利用強(qiáng)度差異顯著（P<0.05），均以聚合物和糖類的利用為主，其中處理組C1、C3和C5對(duì)這兩類碳源的利用強(qiáng)度較高，顯著高于處理組C4和CO（P<0.05）。

2.2.3對(duì)不同碳源利用的主成分分析（PCA分析）

圖3為不同養(yǎng)殖模式水體細(xì)菌對(duì)六大碳源利用的主成分分析結(jié)果。7月，六種碳源中提取的兩個(gè)主成分因子，分別解釋變量方差的29.41%和24.81%，其中PC2的得分系數(shù)差異顯著（P<0.05），表現(xiàn)在對(duì)照組CO與處理組C3之間。8月，PCI和PC2分別解釋36.61%和28.22%的變量方差，PCI和PC2的得分系數(shù)均差異顯著（P<0.05），其中PCI得分系數(shù)差異表現(xiàn)在：處理組C2和C3與對(duì)照組CO和C1之間，PC2表現(xiàn)在：處理組C3與其余處理組之間。9月，PCI和PC2分別解釋變量方差為53.37%和22.18%，PCI和PC2的得分系數(shù)均差異顯著（P<0.05），PCI得分系數(shù)差異表現(xiàn)在：各處理間均差異顯著（P<0.05），PC2表現(xiàn)在：處理組CO、C4和C5與其余處理組間。

與主成分PCI、PC2具有較高相關(guān)系數(shù)的碳源（r>0.06）見表2-7月，胺、糖類和氨基酸對(duì)PCI起分異作用，表明不同處理水體細(xì)菌群落對(duì)底物碳的利用在PCI上的顯著差異是由這三類碳源導(dǎo)致的。對(duì)PC2起分異作用的碳源類型為：聚合物和羧酸。8月，對(duì)PCI起分異作用的主要碳源類型為：聚合物、糖類和氨基酸，而對(duì)PC2起分異作用的主要碳源類型為：羧酸和胺。9月，聚合物、糖類、羧酸和胺這四類碳源對(duì)PCI起分異作用，而酚和氨基酸對(duì)這兩類碳源PC2起分異作用。

2.2.4利用碳源的多樣性指數(shù)變化

表3為不同養(yǎng)殖時(shí)間各養(yǎng)殖模式水體細(xì)菌在培養(yǎng)72 h后利用碳源的多樣性指數(shù)。結(jié)果顯示，不同處理水體細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)在不同養(yǎng)殖時(shí)間呈現(xiàn)不同程度的差異。7月，不同處理水體細(xì)菌群落各類多樣性指數(shù)均無(wú)顯著差異（P>0.05）。8月，McIntosh指數(shù)在各處理間差異顯著（P<0.05），且以處理組C3為最高，顯著高于其它處理組（P<0.05），而對(duì)于Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和S-E均勻度指數(shù)，各處理間均無(wú)顯著差異（P>0.05）。9月，各多樣性指數(shù)在不同處理間均差異顯著（P<0.05），其中處理組C3的各多樣性指數(shù)均為最高，顯著高于處理組CO和C4（P<0.05），而Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和S-E均勻度指數(shù)與處理組C1差異不顯著。

2.3碳氦比調(diào)控下蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落的碳代謝功能與環(huán)境因子之間的RDA分析

圖4為不同模式水體細(xì)菌群落的碳代謝功能的時(shí)間變化與10種不同環(huán)境因子之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)，不同種類的環(huán)境因子影響了水體細(xì)菌群落的碳代謝功能，且代表不同處理的點(diǎn)分布在排序圖的不同空間，說(shuō)明不同處理組細(xì)菌群落存在不同程度的差異。7月，第一排序軸的特征值為53.1%，第二排序軸的特征值為21%，共能解釋74.1%的變異信息。第一排序軸與環(huán)境因子變量NO3-N（-0.3078）負(fù)相關(guān)，與P04-P（O.741 1）、NH4+-N（0.684 3）、TN（0.6266）、TP（0.546 6）、Chl a（0.385 4）和NO2-—N（0.085 2）和正相關(guān)，第二排序軸與環(huán)境因子變量Chl a（-0.7624）、NO2—N（-O.697 8）、NH4+一N（-0.633 4）、POt—P（-0.512 9）和TN（-0.464 9）負(fù)相關(guān)，與TP（0.653 3）和NO3一N（0.229 6）和正相關(guān)。說(shuō)明影響7月份水體細(xì)菌群落碳源代謝功能環(huán)境因子主要是：Chl a、PO4-P、NO2-N、NH4+-N和TP，其中Chl a主要對(duì)AWCD（正相關(guān)）、phen（正相關(guān)）和carh（負(fù)相關(guān)）等產(chǎn)生影響，PO4-P和NH4+一N主要對(duì)AWCD（正相關(guān)）和poly（正相關(guān)）等產(chǎn)生影響，N02一N主要對(duì)Shannon（正相關(guān)）和phen（正相關(guān)）等產(chǎn)生影響，TP主要對(duì)S-E（正相關(guān)）、McIntosh（正相關(guān)）、Simpson（正相關(guān)）、carx（正相關(guān)）和phen（負(fù)相關(guān)）等產(chǎn)生影響。

8月，前兩個(gè)排序軸的特征值為55%和25.1%，共能解釋80.1%的變異信息，第一排序軸與環(huán)境因子變量NH4+-N（-0.1984）負(fù)相關(guān)，與NO3-N（O.935 5）、NO2

一N（0.925 0）、TP（0.7290）、TN（0.5475）、P04一P（0.5353）和Chla（0.0236）正相關(guān)。第二排序軸與環(huán)境因子變量Chl a（-0.011 6）負(fù)相關(guān)，與NH4+-N（0.3986）、PO4-P（0.2761）、TN（0.0876）、NO3-N（0.0760）、TP（0.0527）和NO2-N（0.0278）正相關(guān)。說(shuō)明影響8月份水體水體細(xì)菌群落碳源代謝功能的環(huán)境因子主要是：NO3-N、NO2-N、TP、TN和PO4-P。其中這些環(huán)境因子主要是對(duì)：Shannon（正相關(guān)）、S-E（正相關(guān)）、phen（正相關(guān)）和carx（負(fù)相關(guān)）等產(chǎn)生影響。

9月，前兩個(gè)排序軸的特征值為63.6%和25.1%，共能解釋88.7%的變異信息，第一排序軸與環(huán)境因子變量NO3-N（-0.0719）負(fù)相關(guān)，與PO4-P（0.3897）、NH4+-N（0.2790）、TP（0.2430）、NO2--N（0.1516）、TN（0.058 4）和Chl a（0.024 9）正相關(guān)。第二排序軸與環(huán)境因子變量TP（一0.688 3）、Chl a（-0.5295）、NO2--N（-0.3724）、TN（-0.3344）、NO3--N（-0.2877）、PO4--P（-0.1732）和NH4+-N（-0.0824）負(fù)相關(guān)。說(shuō)明影響9月份水體水體細(xì)菌群落碳代謝功能的環(huán)境因子主要是：TP、Chl a、PO4-P和NO2-N。其中TP和Chl a主要對(duì)phen（正相關(guān)）、Simpson（正相關(guān)）、Shannon（正相關(guān)）、S-E（正相關(guān)）amin（負(fù)相關(guān)）和carx（負(fù)相關(guān)）等產(chǎn)生影響，PO4-P和NO2-N主要對(duì)carx（負(fù)相關(guān)）、poly（負(fù)相關(guān)）、amin（負(fù)相關(guān)）和AWCD（負(fù)相關(guān)）等產(chǎn)生影響。

3.討論

3.1碳氦比調(diào)控下蝦、蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落的Biolog分析

Biolog方法對(duì)細(xì)菌群落多樣性的檢測(cè)是基于養(yǎng)殖環(huán)境內(nèi)細(xì)菌對(duì)不同碳源利用程度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)檢測(cè)ECO板吸光度的變化來(lái)評(píng)價(jià)不同環(huán)境區(qū)系細(xì)菌群落的生理特性和結(jié)構(gòu)特征，還可以在空間及時(shí)間尺度上研究細(xì)菌群落的變化，具有易操作、靈敏度高、分辨能力強(qiáng)、數(shù)據(jù)豐富其可以直觀的反應(yīng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的總體活性的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用該方法研究發(fā)現(xiàn)蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)不同處理水體中細(xì)菌群落對(duì)碳源總量和不同類型碳源的利用隨養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的延長(zhǎng)差異越來(lái)越顯著，這說(shuō)明細(xì)菌群落對(duì)不同類型碳源利用喜好和對(duì)總碳源的代謝能力存在差異，反映了碳源和菌制劑的添加促使養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生差異。這可能是：在養(yǎng)殖水體中添加碳源，調(diào)節(jié)碳氮比可以促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)引，添加芽孢桿菌可以提高水體對(duì)碳源代謝活性和利用能力，添加硝化細(xì)菌或EM菌可以凈化水質(zhì)，但硝化細(xì)菌在添加一段時(shí)間后，會(huì)抑制了環(huán)境水體中異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，影響對(duì)碳源的代謝活性，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似，說(shuō)明養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加碳源和菌制劑，影響了養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌群落的多樣性。

Biolog的主成分分析可以用來(lái)直觀地表述細(xì)菌群落代謝特征，是表征細(xì)菌群落功能多樣性的重要手段，其分布的空間位置用來(lái)反映細(xì)菌群落對(duì)碳源底物的利用能力。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)不同處理水體中細(xì)菌群落對(duì)碳源的利用能力差異顯著（P<0.05）。7月，在分析圖中分布均勻，說(shuō)明不同處理間差異不顯著，隨著時(shí)間的推移，差異越來(lái)越顯著。9月，不同處理間在分析圖間的位置差異明顯，其中處理組C3和C4在分析圖中的位置與其他處理組顯著不同，處理C3對(duì)六大碳源利用強(qiáng)度在總體上顯著高于其他處理組（P<0.05），而處理組C4則對(duì)六大碳源的吸收水平較低稍高于對(duì)照組CO。這說(shuō)明碳源和菌制劑的添加促使水體細(xì)菌群落不斷發(fā)生動(dòng)態(tài)變化直到達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，最終導(dǎo)致C3組細(xì)菌群落組對(duì)碳源的代謝能力和強(qiáng)度最大，顯著高于其它處理組。

細(xì)菌群落多樣性指數(shù)不僅在總體上可以反應(yīng)群落功能的動(dòng)態(tài)變化，還是反映群落豐富度、均勻度和優(yōu)勢(shì)度的重要手段，但采用不同的多樣性指數(shù)，會(huì)出現(xiàn)不同的研究結(jié)果l_3。。。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同處理水體細(xì)菌群落的McIntosh指數(shù)和Simpson指數(shù)隨著養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但八、九月相差不大，而Shannon指數(shù)和S-E均勻度指數(shù)均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)。7月，處理組C3的Simpson指數(shù)和Shannon指均較低，而McIntosh指數(shù)和S-E均勻度指數(shù)則處于中間水平，處理組C4的McIntosh指數(shù)最低。8月，McIntosh指數(shù)在處理C3組中顯著高于其它處理組，處理組C4組位于中間水平，其它多樣性指數(shù)相差不大。9月，處理組C3中各類多樣性指數(shù)均為最高，而處理組C4的McIntosh指數(shù)最低，Simpson指數(shù)和Shannon與對(duì)照組CO相差不大均顯著低。這表明處理組C3細(xì)菌群落的空間多樣性、物種豐富度和均勻度均較高，而C4組正好相反，這可能是處理組C4中存在明顯的優(yōu)勢(shì)菌群，影響了其細(xì)菌群落的多樣性和均勻度，從而影響了對(duì)底物碳總量和不同類型的利用。

3.2碳氦比調(diào)控下蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落碳代謝功能與環(huán)境因子的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)采用Biolog微平板培養(yǎng)法與冗余分析（RDA）進(jìn)行相關(guān)分析，研究表明菌碳比調(diào)控下蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落碳代謝功能與養(yǎng)殖環(huán)境中理化因子間具有很好的相關(guān)性。結(jié)果顯示，影響細(xì)菌群落碳代謝功能的主要環(huán)境因子7月份為：Chl a、PO4-P、NO2—N、NH4+-N，8月份為：NO3--N、NO2--N、TP、TN和PO4--P，9月份為：TP、Chl a、PO4-P和NO2--N?？梢钥闯?，N元素為養(yǎng)殖期間的主要影響因子，Chl a為養(yǎng)殖初期的主要影響因子，P元素為養(yǎng)殖中、后期的主要影響因子。這可能是在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的初期，水體中碳源含量相對(duì)較低，細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖需要的碳源主要依賴于浮游植物釋放的有機(jī)物；隨著碳源的添加，養(yǎng)殖環(huán)境中含有充足的有機(jī)碳源，這時(shí)期環(huán)境內(nèi)的NH4+-N（提供了55%～99%總氮吸收）等無(wú)機(jī)氮鹽，可以直接影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝，也可以通過(guò)影響浮游細(xì)菌的捕食者來(lái)間接影響細(xì)菌種類的多樣性；養(yǎng)殖水體中P元素（TP和PO4--P）具有溶解性和流動(dòng)性較低的特點(diǎn)，而碳源的添加，使得TP和PO4--P相對(duì)含量進(jìn)一步降低，因此P元素成為養(yǎng)殖中、后期的主要限制因子。