DNA分析技術(shù)在動物纖維鑒別領(lǐng)域的研究進展

董曉東++++楊素英++++丁楠++++俞艷彬

摘要：動物纖維的鑒別屬于紡織品檢測行業(yè)的難題之一，DNA分析技術(shù)因其客觀準(zhǔn)確性而給動物纖維檢測客觀法帶來了曙光。本文主要綜述了DNA分析技術(shù)鑒別動物纖維的研究現(xiàn)狀，介紹了DNA分析技術(shù)的原理，并對其應(yīng)用前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：DNA技術(shù)；動物纖維；PCR擴增；PCR-RFLP技術(shù)；real-time PCR技術(shù)

1 引言

近幾年來，隨著人們生活水平的提高，天然動物纖維及皮革制品越來越受到消費者的青睞。目前，動物纖維檢測方法主要包括顯微鏡法 [1]和掃描電鏡法[2]，二者均通過纖維鱗片形態(tài)特征來對纖維種類進行鑒別。但是，動物纖維的形態(tài)特征會因加工條件、氣候條件及膳食結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生變化[3]，這就給顯微鏡法的鑒別帶來了困難，而且顯微鏡法對試驗人員的經(jīng)驗要求較高，主觀干擾大，所以相關(guān)行業(yè)對客觀性高的檢測方法的需求越來越大。

近年來，隨著DNA分子技術(shù)的逐步成熟，研究人員通過鑒別不同動物的DNA序列信息，實現(xiàn)了動物纖維及其混合物的定性定量，并在逐步完善此技術(shù)。DNA分子技術(shù)由于其檢測結(jié)果的客觀性而廣泛應(yīng)用于司法、醫(yī)學(xué)研究及診斷領(lǐng)域，同以上兩種方法相比，DNA法的檢測結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確。

2 DNA定性定量原理

DNA分子，即脫氧核糖核酸，是由堿基、脫氧核糖和磷酸組成的長鏈多聚物。不同的生物所具備的DNA分子在長短和結(jié)構(gòu)上有一定的差異，堿基的排列順序也不盡相同[4]。通過對DNA分子的核苷酸排列順序進行測定即可實現(xiàn)對動物纖維的定性定量檢測。DNA分析檢測技術(shù)一般包括以下幾個步驟：

（1）DNA的提取。動物毛纖維的基因組DNA主要存在于毛囊部分，而紡織類動物纖維一般只取毛干部分，故只能提取毛干線粒體中的DNA。DNA的提取主要包括前處理、分離、純化和濃縮階段。此階段所提取的樣品將直接影響到后續(xù)的擴增及DNA序列的測定，高質(zhì)量的DNA是實現(xiàn)DNA檢測的第一步，因此，提取的DNA樣品應(yīng)防止其他因素的干擾與污染。

（2）PCR擴增。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是生物體外特殊的DNA復(fù)制反應(yīng)，能將微量的DNA大幅增加。目標(biāo)DNA片段經(jīng)過變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟，在數(shù)小時內(nèi)即可擴增放大數(shù)百萬倍。

（3）DNA序列的測定。DNA序列測定是檢測結(jié)果的關(guān)鍵所在。通過不同纖維所具備的特異堿基對排列即可實現(xiàn)對纖維的鑒別。目前，Sanger雙脫氧末端終止法在此領(lǐng)域應(yīng)用較廣，通過電泳和放射自顯影技術(shù)對所提取的DNA片段進行測定，即可對纖維品種進行鑒別。

3 DNA檢測技術(shù)在動物纖維鑒別中的研究進展

隨著DNA分子技術(shù)的不斷發(fā)展，其在動物纖維鑒別領(lǐng)域的研究越來越廣。Hamlym P.F.等人在1992年首次制作了綿羊特性DNA探針，實現(xiàn)了對綿羊毛、山羊絨和馬海毛的鑒別[5]。由于當(dāng)時DNA分子技術(shù)水平較低，極大地限制了DNA技術(shù)在動物纖維鑒別上的應(yīng)用。

PCR擴增技術(shù)成功解決了動物纖維基因組中DNA量少、難以提取的問題。Subramanian等[6]提取纖維毛干中線粒體DNA，通過PCR擴增線粒體DNA細胞色素b基因的保守區(qū)域，然后選擇合適的酶切位點分析相應(yīng)保守區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，根據(jù)后片段長度的多態(tài)性成功鑒別出了山羊絨與綿羊毛。PCR-RFLP技術(shù)（限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)）是一種基于PCR擴增的技術(shù)，是目前識別山羊絨和綿羊毛的較好方法之一。但是，PCR-PFLP分析較為復(fù)雜，一般只能用來做定性分析，不做定量檢測。在此基礎(chǔ)上，Kirsten等[7]實現(xiàn)了對羊毛、羊絨、駱駝毛、牦牛毛等纖維快速簡便的纖維定性分析，并且比較了清洗、漂白和染色等3步處理工序?qū)NA抽提效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)每增加一步處理工序都會明顯降低DNA的提取率，其中染色工序?qū)NA分析的破壞最為嚴(yán)重。

金美菊等[8]針對多種產(chǎn)地的羊絨和羊毛試驗，利用山羊與綿羊質(zhì)檢特定堿基序列的差別，通過設(shè)計不同的引物成功實現(xiàn)對純羊絨、羊毛以及羊絨羊毛混合纖維定性鑒別。研究發(fā)現(xiàn)對于純羊絨、純羊毛纖維，采用1組引物（CYTBF/CYTBR）對特定位點特征堿基序列組實現(xiàn)對纖維的鑒別。對于羊絨羊毛混合物，采用羊絨引物（YM1_F/C7YGR1）和羊毛引物（YM1_F/W10YGR1）對混合纖維進行定性鑒別。通過對羊毛、羊絨引物的設(shè)計，有效地提高了檢測的靈敏度。

相比DNA直接測序法和PCR-RFLP法，Real-time PCR（實時熒光PCR技術(shù)）具有簡單、準(zhǔn)確、快速的特點[9]。Real-time PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR過程，最終通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。費靜等[10]設(shè)計針對兔和狐線粒體12SrRNA基因的特異性TaqMan探針和引物對，建立了兔毛纖維和狐貍毛纖維的鑒別方法，此方法特異性較好，并且靈敏度達到了1%，并且在驗證實例中得到滿意的結(jié)果。紫山羊絨與牦牛毛在顯微鏡下外觀形態(tài)極其相似，非常難以鑒別，Lu等[11]設(shè)計針對牦牛毛和紫山羊絨12SrRNA基因的TaqMan探針和引物對，建立了牦牛毛纖維和紫山羊絨纖維的鑒別法，分別對染色和漂白樣品分別進行鑒別，鑒別結(jié)果也十分滿意，靈敏度也達到了1%。陳國培等[12]建立羊毛羊絨熒光PCR檢測體系，并對檢測方法特異性和檢出限進行分析，結(jié)果表明此方法特異性好，檢出限為10ngDNA，同時對16個樣品進行驗證檢測，結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定方法具有一致性，靈敏度相較于傳統(tǒng)方法更優(yōu)。

Real-time PCR不僅在動物纖維定性上表現(xiàn)優(yōu)異，而且在定量領(lǐng)域也表現(xiàn)不俗。吉岡陽一郎[13]開發(fā)了一套基于Real-time PCR技術(shù)而用于動物毛纖維混合比率的鑒定方法，方法結(jié)果允差符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29862規(guī)定。國內(nèi)在此動物纖維定量領(lǐng)域也有一定的研究，Tang等[14]采用Real-time PCR技術(shù)，設(shè)計了兩套針對羊絨和羊毛的探針與引物對，驗證了線粒體12sRNA適合羊毛/羊絨混合物的定性試驗，同時也對不同比例的樣品及經(jīng)染色整理的樣品的定量進行了研究，試驗結(jié)果與標(biāo)稱值一致性很好。

隨著DNA檢測技術(shù)的不斷成熟，將可以對更多的動物纖維進行準(zhǔn)確的定性和定量檢測分析。

4 難點及展望

DNA檢測技術(shù)是基于物種DNA序列的特異性，不依賴檢測人員主觀性，檢測結(jié)果更加客觀。但目前，DNA技術(shù)在動物纖維鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用依然存在一系列問題：

（1）高質(zhì)量DNA的獲取。紡織品一般經(jīng)過較多的前處理及后整理，比如堿處理、染色等，在一定程度上破壞了纖維的DNA結(jié)構(gòu)。

（2）動物纖維自身的色素。天然動物纖維中所含的色素會抑制PCR擴增的進行。

（3）目前DNA定量研究多為二組分混紡產(chǎn)品，正處于起步階段。多組分混紡產(chǎn)品的DNA定量技術(shù)還有待進一步研究[15]。

DNA分析檢測技術(shù)具有非常廣闊的發(fā)展前景，目前已在多領(lǐng)域得到廣泛引用，我們應(yīng)加大在這方面的研究和開發(fā)力度，以提高我國紡織領(lǐng)域的檢驗檢測水平。

參考文獻：

[1]GB/T 16988—2013 特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定[S].

[2]GB/T 14593—2008 山羊絨、綿羊毛及其混合纖維定量分析方法 掃描電鏡法[S].

[3]陳啟龍， 唐鑫省.生物芯片技術(shù)及其應(yīng)用前景[J].資源開發(fā)與市場，2007，23（8）： 725-727.

[4]陳永青， 謝建平， 謝君，等. DNA科學(xué)導(dǎo)論[M]. 北京：科學(xué)出版社，2005： 29.

[5]P.F.Hamlyn， G. Nelson，and B.J. McCarthy. Wool-fiber Identification by means of Novel Species-specific DNA probes[J]. J.Text.Inst.，1992，83： 97-103.

[6]Selvis Subramanian，T Karthik，N N Vijayaraaghavan. Single nucleotide polymorphism for animal fiber identification[J]. Journal of biotechnology， 2005， 116（2）： 153-158.

[7]Kirsten Kerkhoff，Gabriel Cescutti，Lothar Kruse，et al..Development of a DNA-analytical method for the identification of animal hair fibers in textiles[J].Textile research journal，2009，79（1）：69-75.

[8]金美菊， 阮勇， 李翔，等. 基于基因技術(shù)的羊絨與羊毛纖維定性鑒別方法[J].紡織學(xué)報， 2012， 33（8）： 19-23.

[9]賈興旺，田亞平. 雙重實時熒光PCR與DNA測序分析及PCR-RFLP方法檢測白細胞介素-6基因啟動子區(qū)多態(tài)性方法的比較研究[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008， 23（5）： 6-8.

[10]費靜， 董正廉， 周輝，等. 基于熒光定量PCR的兔毛、狐貍毛纖維定性檢測方法[J]. 標(biāo)準(zhǔn)與測試， 2012， 40（11）： 56-58.

[11]W.m. Lu， J. Fei，J. Yang，et al. A novel method to identify yak fiber in textile[J].Textile Research Journal，2012，83（8）： 773-779.

[12]陳國培， 賴心田， 唐富潤，等. 羊毛及羊絨制品實時熒光PCR鑒定方法研究[J]. 紡織導(dǎo)報， 2013，（2）： 88-91.

[13]吉岡陽一郎.動物毛纖維制品中的動物毛纖維混合比率的鑒定方法[P].中國：03824723.2， 2005，11.

[14]M.F. Tang，W.P. Zhang，and H. Zhou. A real-time PCR method for quantifying mixed cashmere and wool based on hair mitochondrial DNA[J].Textile Research Journal，2014，84（15）：1612-1621.

[15]張小莉， 池海濤， 張經(jīng)華，等.羊絨和羊毛纖維檢測技術(shù)研究進展[J].毛紡科技， 2009，37（3）： 56-59.

（作者單位：國家羊絨產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河北省纖維檢驗局）