鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細胞氧化損傷的影響

杜學柯，潘靈輝，裴圣林，葛萬運

鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細胞氧化損傷的影響

杜學柯，潘靈輝，裴圣林，葛萬運

目的探討鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細胞氧化損傷的保護作用。方法用過氧化氫（H2O2）加入A549細胞培養(yǎng)液中制成A549細胞氧化損傷模型，實驗分為空白對照組（C組）、H2O2處理組（H組）和鹽酸戊乙奎醚-過氧化氫處理組（P組）。用MTT方法測A549細胞存活率，用TUNEL方法測定細胞凋亡指數(shù)，并測定細胞內(nèi)的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）含量。結果與C組比較，H組的細胞存活率下降，凋亡指數(shù)增加，MDA含量上升，SOD、GSH、NADPH的含量下降（P＜0.05）。與H組比較，P組的細胞存活率增加，凋亡指數(shù)下降，MDA含量下降，SOD、GSH、NADPH的含量增加（P＜0.05）。結論鹽酸戊乙奎醚對A549細胞過氧化損傷具有保護作用。

鹽酸戊乙奎醚；肺泡Ⅱ型上皮細胞；A549細胞；氧化損傷

肺泡上皮屏障功能損傷是肺損傷發(fā)生的關鍵，而肺泡Ⅱ型上皮細胞是肺泡上皮屏障的重要組成部分，其損傷及修復過程，是急性肺損傷發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。鹽酸戊乙奎醚具有抗炎、抗凋亡的作用，對膿毒血癥造成的臟器損傷具有保護作用［1］。研究表明鹽酸戊乙奎醚能改善已有肺疾病患者的呼吸力學指標［2］，對肺功能具有保護作用，其機制可能是下調(diào)肺內(nèi)Toll樣受體4（TLR4）的表達，抑制與TLR4信號傳導通路有關的下游炎癥細胞因子。但鹽酸戊乙奎醚在體外對肺泡Ⅱ型上皮細胞是否具有保護作用尚少見報道。本研究在過氧化氫（H2O2）攻擊損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞基礎上，觀察鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細胞的氧化損傷是否具有保護作用，探討抗膽堿藥物防治急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）潛在的可能性。

1 材料與方法

1.1實驗材料肺泡Ⅱ型上皮細胞A549細胞株，由廣西醫(yī)科大學實驗中心提供；高糖DMEM培養(yǎng)液、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；小牛血清和胰蛋白酶購自武漢飛羿科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自華美生物公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物制品所；實驗儀器由廣西醫(yī)科大學實驗中心提供。

1.2細胞培養(yǎng)、氧化應激處理和分組人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549細胞在含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天更換培養(yǎng)基，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗處理。氧化應激處理方法：將細胞分為空白對照組（C組）；H2O2處理組（H組），用500 μmol/L H2O2處理A549細胞；鹽酸戊乙奎醚-過氧化氫處理組（P組），預先20 min給予2 mg/L鹽酸戊乙奎醚［3］，然后加入500 μmol/L H2O2處理A549細胞4 h。

1.3MTT法檢測細胞存活率用0.25%胰蛋白酶消化，以1.5×104/L密度的細胞接種到96孔板，每孔100 μL，每孔設3個復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h后，棄培養(yǎng)液。以不含細胞的培養(yǎng)液作空白對照，按上述方法處理各組后，加入無血清培養(yǎng)基100 μL和MTT溶液20 μL（5 g/L）37℃培養(yǎng)4 h顯色。加入DMSO 150 μL，振蕩至結晶物充分溶解后，空白對照調(diào)零，用酶聯(lián)免疫儀測各孔波長在490 nm處的光密度值（OD490）。細胞存活率計算公式：細胞存活率=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.4細胞凋亡指數(shù)的測定采用TUNEL方法測定，在光鏡下細胞核呈棕褐色視為陽性凋亡細胞，此外部分細胞漿也可因核內(nèi)DNA碎片的逸出呈棕褐色。高倍鏡（400倍）下，任選3個視野，每個視野中計100個細胞中的陽性細胞數(shù)為凋亡指數(shù)。

1.5各組細胞內(nèi)NADPH、還原型谷胱甘肽（GSH）、SOD、MDA水平的監(jiān)測以1×105/L密度的細胞接種到24孔板上，每孔0.5 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h后。按上述方法處理各組，每組設3個復孔。處理后，棄培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化，等量PBS液收集細胞。超聲細胞破碎儀破碎后，按照相關試劑盒說明進行測定。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1MTT結果和凋亡指數(shù)與C組比較，H組和P組細胞存活率下降，凋亡指數(shù)增加，與H組比較，P組的細胞存活率增加，凋亡指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1Comparison of viability and apoptotic rate of A549 cells between three groups表1 3組細胞的存活率和凋亡指數(shù)（n=3，%，）

Tab.1Comparison of viability and apoptotic rate of A549 cells between three groups表1 3組細胞的存活率和凋亡指數(shù)（n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與H組比較，P＜0.05；表2同

細胞存活率93.3±0.4 66.5±3.9a86.6±1.8ab69.420＊＊組別C組H組P組F凋亡指數(shù)6.6±0.6 32.9±3.9a21.4±2.3ab74.534＊＊

2.2鹽酸戊乙奎醚對H2O2損傷的549細胞抗氧化指標的影響與C組比較，H組MDA水平明顯增高，SOD、GSH和NADPH含量下降；與H組比較，P組MDA水平明顯降低，SOD、GSH和NADPH含量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of MDA，SOD，GSH and NADPH contents between three groups表2 3組細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH和NADPH含量的比較（n=3，）

Tab.2Comparison of MDA，SOD，GSH and NADPH contents between three groups表2 3組細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH和NADPH含量的比較（n=3，）

SOD（U/mg）19.663±0.614 15.559±0.612a 17.372±0.451ab 39.849＊＊組別C組H組P組F MDA（nmol/L）8.167±0.315 11.963±0.745a 9.422±0.407ab 41.054＊＊GSH（U/mL）34.230±0.543 27.401±0.713a 30.633±0.556ab 94.348＊＊NADPH（μmol/L）10.701±0.797 6.387±0.595a 8.486±0.395ab 36.565＊＊

3 討論

肺泡Ⅱ型上皮細胞具有修復功能，通過其自身的鈉通道和鈉泵來維持肺泡的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。同時具有自然免疫功能，在細胞受損或者感染時，肺泡Ⅱ型上皮細胞可以分泌趨化因子和細胞因子而顯著增強肺臟的防御能力。肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷必然導致肺泡屏障功能的破壞，引起細菌和病毒的入侵，同時啟動肺內(nèi)局部及全身炎癥免疫反應，導致ARDS的發(fā)生。因此減輕肺泡Ⅱ型上皮細胞的損害，維持其正常結構和功能在治療ARDS過程中起著重要作用。

非神經(jīng)性乙酰膽堿及其受體表達于肺泡上皮細胞，其作用是調(diào)節(jié)這些非神經(jīng)依賴細胞的基本生物學功能：增殖、凋亡、細胞因子的釋放等。鹽酸戊乙奎醚具有選擇性M1、M3和N1、N2受體拮抗作用，對外周有很強的抗膽堿作用［4］。研究表明在心肺轉流術中鹽酸戊乙奎醚可能通過調(diào)節(jié)腸內(nèi)微循環(huán)，保護腸黏膜屏障，抑制全身炎癥反應［5］。動物研究結果顯示鹽酸戊乙奎醚抑制P38MAPK和NF-kappaB的激活，減輕氧化應激反應、炎癥反應和凋亡，從而對腎臟缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用［6］。此外也可上調(diào)肺組織內(nèi)的水通道蛋白5（AQP5）的表達，減輕肺水腫，減輕肺臟氣體交換損害和肺組織形態(tài)學變化。鹽酸戊乙奎醚的應用可以上調(diào)實驗動物肺內(nèi)β-arrestins的表達從而減輕肺毛細血管的通透性，同時使肺內(nèi)髓過氧化物酶（MPO）活性顯著下降、降低血管黏附分子-1的表達［7］。而抗膽堿能藥物鹽酸戊乙奎醚對肺泡上皮細胞是否具有保護作用尚少見報道。

本研究設想鹽酸戊乙奎醚對肺泡上皮細胞通過氧化應激具有保護作用。氧化應激損傷是導致肺部疾病的重要病理生理基礎，因此通過氧化應激建立肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷模型，檢測MDA、SOD、GSH和NADPH含量來證實。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化反應最重要的代謝產(chǎn)物之一，其含量水平反映了組織中氧自由基含量及細胞損傷程度的水平。SOD、GSH是體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，NADPH作為體內(nèi)重要的供氫體，主要參與多種活性物質(zhì)的合成與轉化，它的耗竭使得細胞內(nèi)多種物質(zhì)的生物合成受到障礙，其水平可間接反映細胞抗氧化損傷的能力。本研究結果顯示預先給予鹽酸戊乙奎醚可減輕過氧化氫對肺泡Ⅱ型細胞的損傷作用，抑制MDA的形成，增加SOD、GSH和NADPH含量，減輕氧化損傷，提高細胞存活率，減低細胞凋亡指數(shù)。從細胞水平證實體外氧化應激損傷時，鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型細胞具有保護作用。此外，與對照組比較，P組的MDA水平明顯增高，SOD、GSH和NADPH含量下降，說明鹽酸戊乙奎醚僅能部分減輕氧化損傷，不能完全阻斷損傷。但其機制還不是很清楚，有待進一步研究。

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（2014-08-21收稿 2015-02-12修回）

（本文編輯 魏杰）

Protective effects of penehyclidine hydrochloride on A549 cells against oxidative injury

DU Xueke，PAN Linghui，PEI Shenglin，GE Wanyun
Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

ObjectiveTo explore the effects of penehyclidine hydrochloride（PHC）on lung epithelial typeⅡcells against oxidative stress damage.MethodsA549 cells treated with H2O2were used as oxidative stress damage cell model. A549 cells were divided into 3 groups:control group（C group），H2O2treated group（H group）and PHC treated group（P group）.The viability of A549 cells was measured by MTT assay.The apoptotic rate was measured by TUNEL assay.The lev?els of malonicdialed（MDA），reactive oxygen species（SOD），reduced glutathione hormone（GSH）and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）of cells were detected by biochemistry colorimetry.ResultsCompared with group C，the viability of A549 and the contents of SOD，GSH and NADPH were significantly decreased in group H，while MDA content and apoptotic rate were increased（P＜0.05）.Compared with group H，the viability of A549，the contents of SOD，GSH and NADPH were significantly increased in group P，while MDA content and apoptotic rate were reduced（P＜0.05）.Conclu?sionPenehyclidine hydrochloride shows protective effects on A549 cells through reducing the oxidative damage induced by H2O2.

penehyclidine hydrochloride；lung epithelial typeⅡcells；A549；oxidative stress damage

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.005

廣西壯族自治區(qū)自然科學基金青年基金項目（2013GXNSFBA019182）

廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科（郵編530021）

杜學柯（1981），男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸急救方面研究