淺談蛋白質(zhì)印跡法操作過程中的實驗技巧

宋亮　陳丹丹

摘 要：蛋白質(zhì)印跡法（蛋白免疫印跡）即Western Blot，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。其基本原理是將電泳分離后的細(xì)胞或組織蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性抗體對相應(yīng)抗原進(jìn)行著色，隨后通過分析著色的位置和著色深度來反映蛋白質(zhì)表達(dá)情況。該文通過介紹實驗操作過程中的一些心得體會，簡要闡述如何提高蛋白質(zhì)印跡法的實驗效果。

關(guān)鍵詞：蛋白印跡法 實驗技巧 生物學(xué)

中圖分類號：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）07（c）-0063-02

蛋白質(zhì)印跡法是分子生物學(xué)和生物化學(xué)中常用于分離和識別特異性蛋白的一種實驗方法。這項技術(shù)主要包括三個主要步驟：（1）基于分子重量，利用電泳進(jìn)行蛋白分離。（2）將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持物。（3）利用特異性的一抗和二抗使目的蛋白顯色。隨后通過分析著色的位置和著色深度來反映蛋白質(zhì)表達(dá)情況。Western Blot實驗簡單而又復(fù)雜，簡單在于原理和操作過程，復(fù)雜在于每一步的精細(xì)化操作，常常一個很小環(huán)節(jié)的疏忽就會對最終結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。該文中，作者結(jié)合自身多年的實驗經(jīng)歷，簡要談?wù)勅绾翁岣叩鞍踪|(zhì)印跡法的效果。

1 制膠

市售的成品膠簡單，省時，效果佳，但價格相對昂貴，因此多數(shù)實驗室仍選擇使用聚丙烯酰胺自行配膠。由于凝膠的質(zhì)量會直接影響后續(xù)的實驗，因此要特別注意以下幾點。（1） 液態(tài)的分離膠及濃縮膠均可事先配好，四甲基乙二胺（TEMED）及10% 過硫酸銨（APS）除外，過濾后作為儲存液避光存放于4℃，臨用前取出室溫平衡，否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡。（2）APS的使用比例大約0.7～0.8：100，通常情況下分離膠濃度越高，使用的APS濃度應(yīng)越低。（3） APS一定要新鮮，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放，勿超過兩周。也可將配好的APS分裝后凍存在-20℃，隨時取用。（4）混合好的凝膠要均一沒有氣泡，否則影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。（5） 灌好膠后需等待其完全凝固才可上樣，具體凝固時間與加入的APS及TEMED配比有關(guān)，通常在0.5～1 h內(nèi)凝集最好。過快表示APS和/或TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，而且電泳時容易燒膠。過慢則表明兩種試劑用量不夠。需要注意的是，膠結(jié)構(gòu)的完全形成需要較長時間，肉眼觀察到膠凝時，其內(nèi)部分子的排列實際尚未完成。因此也可提前一天制膠，保濕放置在4℃過夜，次日使用。

2 上樣電泳

制膠完成后，可使用提前變性好的蛋白樣品上樣電泳。上樣前蛋白樣品最好瞬時離心，隨后輕微混勻。加樣時間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散。為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。另外，上樣量不宜過多，以免蛋白條帶過于臃腫，影響美觀。隨后，只需要控制好電流強(qiáng)度，根據(jù)預(yù)染的蛋白Marker判斷目的蛋白的位置，適時終止電泳即可。有觀點認(rèn)為分離膠的下1/3處是最佳分辨區(qū)，個人經(jīng)驗是1/2處至下1/3處區(qū)別不大，考慮到蛋白的區(qū)分主要依靠分離膠的濃度，所以在此區(qū)間可隨時停止電泳，只需注意不要讓目的蛋白過于靠近凝膠的下緣或是移動出凝膠就行。電泳過程中有時會出現(xiàn)一些異常現(xiàn)象，如：（1）條帶呈笑臉狀（︶），這是由于凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。（2）條帶呈皺眉狀（︵），可能是裝置不合適，或是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或兩邊聚合不完全。（3）條帶出現(xiàn)拖尾，提示蛋白樣品溶解不好。（4）條帶出現(xiàn)紋理（縱向條紋）：可能是樣品中含有不溶性顆粒。（5）條帶偏斜，是由于電極不平衡，或加樣位置偏斜。（6）條帶向兩邊擴(kuò)散：提示加樣量過多。

3 轉(zhuǎn)膜

經(jīng)過電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜”步驟，即從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用后續(xù)方法進(jìn)行蛋白的檢測和顯色。為了防止已經(jīng)分離的蛋白條帶在沒有電場的情況下擴(kuò)散，轉(zhuǎn)膜需要盡快進(jìn)行。不論使用濕轉(zhuǎn)還是半干轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜過程中特別需要注意的是兩個問題：（1）正確放置“三明治”的疊放次序，即：陽極、下層濾紙、膜、膠、上層濾紙、陰極。（2）仔細(xì)排除每層之間的氣泡，尤其是膜與膠之間的氣泡。大的氣泡可能會造成系統(tǒng)短路，小的氣泡則會影響蛋白質(zhì)成功轉(zhuǎn)移至膜上。至于轉(zhuǎn)膜的時間和電流大小，需要根據(jù)目的蛋白的分子量進(jìn)行調(diào)整。為防止轉(zhuǎn)膜過程中過多的熱量產(chǎn)生，可以提前將轉(zhuǎn)膜液放置在4℃預(yù)冷，并且在轉(zhuǎn)膜過程中使用冰盒降溫，從而改善轉(zhuǎn)膜效果。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后可使用麗春紅S對膜直接染色來顯示蛋白條帶，從而檢測轉(zhuǎn)膜效果，它的好處是充分脫色后不會干擾后續(xù)的抗體孵育。

4 封閉、抗體孵育及發(fā)光鑒定

為了減少抗體孵育后的非特異條帶以及雜亂的背景，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后需利用封閉液進(jìn)行處理，以封閉膜上剩余的疏水結(jié)合位點。最常用的封閉液是脫脂奶粉，這是因為脫脂奶粉內(nèi)的非特異性成分豐富，封閉效率高。需要注意的是，由于抗磷酸氨基酸抗體可以與牛奶中的某些成分結(jié)合，所以在檢測這些抗體時，不能使用脫脂奶粉作為封閉液，而需換用牛血清白蛋白 （BSA） 進(jìn)行處理。封閉結(jié)束后就是決定蛋白質(zhì)印跡法成敗的關(guān)鍵――使用針對于目的蛋白的一抗進(jìn)行雜交。對于國內(nèi)的大多數(shù)實驗室來講，選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，進(jìn)口抗體，如Abcam，Cellsignaling和Sigma的一抗雖然效果好，但是價格昂貴。相比之下，Santa Cruz的抗體則量大，價位也便宜些，性價比較高。至于進(jìn)口抗體國內(nèi)分裝，或純國產(chǎn)抗體，質(zhì)量則良莠不齊，購買時需要些勇氣及運氣。因此選擇一抗前最好根據(jù)發(fā)表的文獻(xiàn)來查找有效的抗體，慎重選擇。至于抗體（包括一抗及二抗）濃度一般要參照抗體說明書多次嘗試，選擇最適比例，合適的比例直接影響實驗結(jié)果以及背景。此外，加一抗、二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時間，洗膜要注意盡可能地將一抗、二抗洗凈，有利于降低背景。抗體孵育結(jié)束后，一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法進(jìn)行發(fā)光鑒定。無論什么方法，都需要根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光或者顯色時間，達(dá)到最佳效果。

5 結(jié)語

雖然在蛋白印跡的操作過程中使用相應(yīng)技巧可以改善實驗效果，但一抗的質(zhì)量，以及待檢測蛋白的提取質(zhì)量才是實驗成功的決定性環(huán)節(jié)，應(yīng)受到充分重視。

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