城市廢水暴露致食蚊魚(yú)形態(tài)雌/雄性化的生物學(xué)效應(yīng)

謝勇平，方展強(qiáng)

（華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展、現(xiàn)代工業(yè)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的不斷進(jìn)步，我國(guó)江河湖泊等地表水的污染日趨突 出，導(dǎo)致污染程度嚴(yán)重，不僅影響城市生態(tài)環(huán)境，灌溉后也影響農(nóng)田生態(tài)和作物生產(chǎn)。有關(guān)廢水監(jiān)測(cè)及 治理方法也越來(lái)越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。廢水中含有大量有毒有害的污染物，目前國(guó)家檢測(cè)廢水的排放 標(biāo)準(zhǔn)主要為色度、濁度、化學(xué)需氧量(COD)、pH等理化指標(biāo)，缺少對(duì)城市工業(yè)廢水與城市生活污水中污 染物的毒性指標(biāo)等進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)，而理化指標(biāo)只能反映污染物的瞬時(shí)濃度，無(wú)法反映污染物作用于環(huán)境的綜合毒性效應(yīng)和長(zhǎng)期效應(yīng)[1]。為解決這些問(wèn)題，近 10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已廣泛運(yùn)用一些小型魚(yú)類作為指示 生物進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)。如使用斑馬魚(yú)（Danio rerio）研究城市污水對(duì)其鰓和肝臟組織的毒性作用、對(duì)胚胎 和仔魚(yú)的發(fā)育毒性影響等[2-6]； 也研究了生活污水對(duì)稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）的毒性效應(yīng)等[7]，但這些研究主要以采集生活污水進(jìn)行室內(nèi)暴露為主，原因是斑馬魚(yú)或稀有鮈鯽都不能在城市周邊受污染的溪 流或河涌中存活，而 不能直接投放到野外受污染的水域中進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)的研究。食 蚊魚(yú)（Gambusia affinis)是一種原產(chǎn)北美洲的熱帶性卵胎生小魚(yú)[8]，其入侵性非常強(qiáng)，因體形小、食性雜、繁殖周期短、產(chǎn)仔量 大，已廣泛分布于國(guó)內(nèi)各地水域，尤其受污染的城市河涌中也可以生存，因此探討利用食蚊魚(yú)作為指示 生物，開(kāi)發(fā)其在器官、組織、細(xì)胞及基因各級(jí)水平作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)城市水環(huán)境中可能存在的環(huán)境激 素類物質(zhì)污染的研究具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

近年已經(jīng)陸續(xù)報(bào)道關(guān)于不同種類的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物室內(nèi)暴露對(duì)食蚊魚(yú)的毒性影響及形態(tài)性逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)效應(yīng)等方面的研究[9-16]結(jié) 果，并開(kāi)展了野外觀察實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)生存在受城市污水污染的廣東東莞寒 溪河的雌性食蚊魚(yú)出現(xiàn)形態(tài)雄性化現(xiàn)象，而雄性食蚊魚(yú)則出現(xiàn)形態(tài)雌性化趨勢(shì)[11,17]。由于野外水環(huán)境復(fù) 雜多變，而且能引起食蚊魚(yú)形態(tài)雄性化和雌性化的原因也是多種多樣的，例如環(huán)境溫度的突變[18]，溶解 氧改變[19]，種群密度變化[20]，以及與其他魚(yú)種之間的生存競(jìng)爭(zhēng)等因素，都可能造成所觀察到的性別比例 變化和形態(tài)性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。所以要正確評(píng)價(jià)與證實(shí)東莞寒溪河水中污染物造成食蚊魚(yú)的雌性化和雄性化變 異，在野外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，還需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)的室內(nèi)模擬暴露的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。因此，本課題擬在實(shí)驗(yàn) 室條件下控制統(tǒng)一合理的食物、種群密度、溫度、溶解氧、pH等條件，排除可能引起性別比例失調(diào)和形 態(tài)性逆轉(zhuǎn)的因素，研究城市廢水室內(nèi)暴露對(duì)食蚊魚(yú)目標(biāo)基因表達(dá)及性形態(tài)變異的影響，是否與野外實(shí)驗(yàn) 觀察的結(jié)果相一致，其目的在于探討利用食蚊魚(yú)出現(xiàn)的性形態(tài)逆轉(zhuǎn)及目標(biāo)基因作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)環(huán)境 內(nèi)分泌干擾物的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑低溫高速離心機(jī)（Sigma，德國(guó)），Nanodrap-1000 型分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），PCR 儀（Bio-rad，美國(guó)），7500 Quantitative Realtime-PCR 儀（ABI，美國(guó)），水平 電泳儀（北京六一）。RNAisoPlus（TAKARA，Dalian，China），DNase（RQ1 RNase-Free DNase，Promega，Madison，WI，USA），TAKARA First Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA，Dalian，China），SYBRPremix Ex TaqKit（TAKARA，Dalian，China）。其他生化試劑均為符合實(shí)驗(yàn)規(guī)格要求國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)實(shí)驗(yàn)所用的食蚊魚(yú)（G.affinis）均購(gòu)買自廣州市芳村區(qū)花地灣花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)。挑選大小 一致、形態(tài)正常的雌、雄性食蚊魚(yú)，在實(shí)驗(yàn)室水族缸中清水馴養(yǎng)1個(gè)月以上，每天死亡率低于0.1%時(shí)適 合進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用廢水暴露實(shí)驗(yàn)用廢水均采集自東莞市樟村污水處理廠出水口。出水污水用25 L塑料桶盛 裝，采集后置于4℃條件下運(yùn)回。在實(shí)驗(yàn)室大冰箱中冷凍處理，以防水中微生物降解化合物，換水之前 先將結(jié)冰的水融化。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中用污水處理廠出水原液800 L左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)分組與暴露方法暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組（C0）采用實(shí)驗(yàn)室去 氯自來(lái)水，實(shí)驗(yàn)組（C1、C2、C3、和C4）設(shè)置含10%、40%、60%和80%樟村污水處理廠出水原液的4個(gè) 暴露組。不同濃度廢水的配制方法以原廢水為100%計(jì)算，用實(shí)驗(yàn)室經(jīng)曝氣的自來(lái)水按體積比例相應(yīng)稀釋 成所需要的濃度。同時(shí)設(shè)置強(qiáng)雄激素組（CMT，甲基睪酮）作為陽(yáng)性對(duì)照。每組設(shè)置3個(gè)魚(yú)缸重復(fù)實(shí)驗(yàn)。魚(yú)缸大小為30cm×40cm×45cm，暴露時(shí)控制體積為30 L。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)每個(gè)缸加入雌魚(yú)20條、雄魚(yú)20 條。同時(shí)設(shè)置平行組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)條件控制嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，實(shí) 驗(yàn)期間利用室內(nèi)空調(diào)控制水溫為25°C左右，用充氣機(jī)供氧，通過(guò)調(diào)節(jié)充氣量以保證不同濃度廢水中的溶解氧一致，溶解氧大于4mg/L，pH在6～8之間。每日早晨、中午、晚上各喂食1次，食料為商業(yè)購(gòu)買的紅蟲(chóng)。實(shí)驗(yàn)期間用Thermo多道水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀(Thermo Orion,520M-01,Guangzhou,China)監(jiān)測(cè)水質(zhì)，隔3d換一次水，每次換總體積的1/2，若水質(zhì)出現(xiàn)異常波動(dòng)，則 立即換水。

1.2.3 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)采集暴露期間進(jìn)行雌魚(yú)臀鰭形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)采集，先將食蚊魚(yú)冰浴麻醉，拍照之后將食 蚊魚(yú)放回魚(yú)缸繼續(xù)暴露。

（1）骨骼處理。將實(shí)驗(yàn)魚(yú)處死后拍照，再用1%的KOH處理3d，隔天換液，然后仔細(xì)地剝?nèi)ヴ~(yú)皮及 肉質(zhì)部分使其只剩下骨骼，用1%的茜素紅S染色20min左右，取出清理好骨骼標(biāo)本，并在萊卡體式顯微 鏡下拍照[17]。

（2）骨骼形態(tài)參數(shù)計(jì)算。骨骼照片采用圖像處理軟件“Adobe Photoshop CS4”中的“距離測(cè)量工具” 進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。所測(cè)量的指標(biāo)包括第14/15/16椎肋骨總長(zhǎng)（14L/15L/16L）、第14/15/16椎肋骨的投 影長(zhǎng)度（14P/15P/16P）、第14/15/16椎肋骨尾部尖端到脊柱的高度（14D/15D/16D）。根據(jù)測(cè)量的指標(biāo)計(jì) 算P:D的比值（14P:14D / 15P:15D / 16P:16D）。一些研究已經(jīng)證明，L/P/D值的大小與魚(yú)相應(yīng)的體長(zhǎng)成顯 著的正相關(guān)關(guān)系，所 以在數(shù)據(jù)處理判定不同采樣點(diǎn)樣本指標(biāo)的顯著水平時(shí)，采 用協(xié)方差分析(CO-ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.[21]。測(cè)量和處理的方法如圖1所示。

圖1 骨骼形態(tài)各個(gè)參數(shù)的測(cè)量和計(jì)算方法示意圖[17]

（3）雌魚(yú)鰭條數(shù)據(jù)采集的方法 將魚(yú)冰浴麻醉，在萊卡體式顯微鏡下拍照，用圖像處理軟件AdobePhotoshop CS4中的距離測(cè)量工具進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定（圖2）。雌魚(yú)的臀鰭總共有10根鰭條，從左到右 依次為第1～10鰭條，在測(cè)量鰭條長(zhǎng)度時(shí)，為了精細(xì)統(tǒng)計(jì)，將鰭條長(zhǎng)度分為(a+b+c)3段。每一根鰭條的分節(jié)數(shù)也在圖片作處理，以方便肉眼計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

圖2 雌魚(yú)雄性化特征之臀鰭延長(zhǎng)程度的測(cè)量與計(jì)算方法示意圖[17]

（4）數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS16.0 處理，檢驗(yàn)顯著差異度設(shè)置為P＜0.05。由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 參數(shù)（雌魚(yú)臀鰭第 3 鰭條分節(jié)數(shù)，14～16P，14～16D，14～16L）與魚(yú)體長(zhǎng)有高度相關(guān)性。因此這些參數(shù)將結(jié)合與之高度相關(guān)的體長(zhǎng)，利用協(xié)方差分析方法（CO-ANOVA）檢驗(yàn)不同位點(diǎn)之間的差異性。所有數(shù)據(jù)表示為：平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± standard deviation）。

1.2.4 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集解剖食蚊魚(yú)小心剪下完整的雌魚(yú)鰭條、取出肝臟等目標(biāo)器官裝入有標(biāo) 簽的離心管，迅速放入液氮中速凍后統(tǒng)一轉(zhuǎn)入-80°C 超低溫冰箱中暫存直至RNA 提取試驗(yàn)。提取肝臟 RNA時(shí)每個(gè)暴露濃度每次至少取出 9 條食蚊魚(yú)，每3條食蚊魚(yú)肝臟合裝一個(gè)離心管，提取臀鰭 RNA時(shí)每個(gè)暴露濃度組至少取出 12 條食蚊魚(yú)，每4 條食蚊魚(yú)臀鰭合裝一個(gè)離心管。RNA 提取、RNA 反轉(zhuǎn)錄 cDNA、QRT-PCR 分析方法如下。

（1）引物設(shè)計(jì)。登錄 NCBI網(wǎng)站，找到西部食蚊魚(yú)(Gambusia affinis)的VTGαcDNA、ERαcDNA、ARαcDNA的序列，用Primer primer5 設(shè)計(jì)與之匹配的Real-time PCR 擴(kuò)增引物，校對(duì)后最終選取的引物 如表1 所示。

表1 目標(biāo)基因擴(kuò)增引物名稱及其序列

（2）R NA制備。將肝組織勻漿,臀鰭條則研磨成粉末,分別加入約1 mL的Isoplus RNA(RNAiso Plus)提取液(Takara)進(jìn)行總RNA提取。R NA提取后進(jìn)行基因組DNA的去除,并檢測(cè)RNA濃度及其完整性,保證A260/A280的比值在1.8～2.0(TakaRa)。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA使用TakaRa Code:DRR037 PrimeScript TM RT reagents Kit(Perfect Real Time)產(chǎn)品。RT反應(yīng)液配置如下:5×PrimeScript Buffer(2 μL),PrimeScript PT Enzyme Mix I(0.5 μL),Random 6 mers(100μmol/L,0.5 μL),Oligo dT Primer(50μmol/L,0.5 μL),Total RNA(1μL),Rnase Free dH2O(5.5 μL),總共10μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37℃15min-cDNA 合成),85℃ 5s(酶失活)。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量。使用TakaRa Code:DRR081A SYBR? Premix ExTaq? Ⅱ(2×)10.0μL,正反向 引物(10μmol/L)各0.8 μL,ROX References DyeⅠ(50 ×)or ROX References DyeⅡ(50 ×)0.4 μL,cDNA模板 2.0μL,H2O(滅菌)6.0μL,總共20.0μL。按照兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR擴(kuò)增結(jié) 果數(shù)據(jù)的處理采用相對(duì)定量法,內(nèi)參基因選用β actin。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品待測(cè)樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量,然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。校正值=目的基因定量結(jié)果/管家基因 定量結(jié)果?相對(duì)值=待測(cè)樣品的校正值/對(duì)照樣品的校正值。

（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理。使 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采 用單因素方差分析（one way-ANOVA）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。用Excel 2003做柱形圖。設(shè) 置P＜0.05時(shí)，表示差異顯著；當(dāng)P＜0.01 時(shí)，表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)控制

水質(zhì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為多次測(cè)試的結(jié)果，溫度控制在23.9～25.1℃，pH值嚴(yán)格控制在6.0～7.1，電導(dǎo)值在不 同濃度組有差異，在209.1～352.2μs/cm，溶解氧介于6.99～8.05mg/L（表2）。

表2 水質(zhì)理化指標(biāo)

2.2 污水暴露致食蚊魚(yú)骨骼形態(tài)變異

正常的雌性食蚊魚(yú)骨骼第14～16節(jié)椎肋骨向尾部方向彎曲，椎肋骨細(xì)長(zhǎng)，與臀鰭之間沒(méi)有通過(guò)軟骨 進(jìn)行連接（圖3-A）；正常的雄魚(yú)第14～15根椎肋骨向頭部方向彎曲，肋骨粗大，第14根椎肋骨與臀鰭的骨骼通過(guò)韌帶緊密連接（圖3-B）。雌性食蚊魚(yú)經(jīng)過(guò)強(qiáng)雄激素甲基睪酮（MT）暴露后，第14～16根椎肋 骨出現(xiàn)特化，彎曲方向改變，由原來(lái)向尾部彎曲的改變成為向頭部彎曲，椎肋骨也變厚變粗變硬，甚至增生出與臀鰭骨骼相連接的軟骨。臀鰭的第3～5鰭條也相應(yīng)延長(zhǎng)，直至與雄魚(yú)的生殖足類似（圖3-C）。經(jīng)過(guò)東莞樟村污水處理廠出水暴露35d后，高濃度暴露組雌魚(yú)在一定程度上出現(xiàn)一些微弱變化，第14～16 椎肋骨的中間部位出現(xiàn)骨骼膨大增生，其椎肋骨向尾部彎曲的程度也較之正常雌魚(yú)的有所變小（圖3-D）。至于臀鰭，也出現(xiàn)了第3～5鰭條在一定程度上延長(zhǎng)的現(xiàn)象。

圖3 實(shí)驗(yàn)魚(yú)的骨骼圖

2.3 污水暴露致食蚊魚(yú)目標(biāo)基因mRNA表達(dá)

2.3.1 雌性食蚊魚(yú)目標(biāo)基因mRNA表達(dá)變化暴露實(shí)驗(yàn)雌性食蚊魚(yú)臀鰭的ARαmRNA轉(zhuǎn)錄水平如圖4所 示。以對(duì)照組的ARαmRNA轉(zhuǎn)錄水平設(shè)定為參照值，實(shí)驗(yàn)組中60%和80%濃度組臀鰭的ARαmRNA轉(zhuǎn)錄水 平呈顯著升高，分別達(dá)到2.99倍(P＜0.001)和1.98倍(P＜0.01)。10%和40%濃度組的轉(zhuǎn)錄水平則無(wú)顯著性差 別，其中10%濃度組略為降低（0.78倍，P＞0.05），而40%濃度組則稍微升高（1.21倍，P＞0.05）。

圖4 廢水暴露致雌性食蚊魚(yú)臀鰭ARαmRNA 轉(zhuǎn)錄水平

圖5 廢水暴露致雄性食蚊魚(yú)肝臟VTGαmRNA和ERα mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

2.3.2 雄性食蚊魚(yú)目標(biāo)基因mRNA表達(dá)變化用不同濃度的污水處理廠出水對(duì)食蚊魚(yú)暴露35d之后檢測(cè) 了各個(gè)濃度組食蚊魚(yú)肝臟中VTGαmRNA和ERαmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，其結(jié)果如圖5所示。其中80%濃度組的VTGαmRNA轉(zhuǎn)錄水平是清水對(duì)照組轉(zhuǎn)錄水平的25倍以上(P＜0.001)，而 60%濃度組和40%濃度組也分別 達(dá)到了24.8倍(P＜0.001)和9.5倍(P＜0.001)。從 整個(gè)變化趨勢(shì)來(lái)看，低 濃度10%到高濃度80%，其VTGαmRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨之相應(yīng)上升，而且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。而ERαmRNA的變化與暴露濃度的變化則無(wú)明顯的相關(guān)性，與對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄水平相比未呈現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

暴露實(shí)驗(yàn)水質(zhì)的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的溫度和pH 都無(wú)明顯差異，且控制在一個(gè)較小的范圍內(nèi)，說(shuō)明喂食過(guò)程中的食物殘?jiān)玫搅思皶r(shí)清理，不引起水質(zhì)變壞，DO 值保持在6.0mg/L以上，表明水中的溶解氧供給足夠食蚊魚(yú)正常生活。對(duì)照組電導(dǎo)值為 209μs/cm，該值較干凈的河水（東莞流溪 河，86.7 μs/cm）[11]略 偏高，其原因是實(shí)驗(yàn)用的為自來(lái)水，水中有用于消毒的次氯酸鈣成分而造成水中 含有大量離子，但這些離子不會(huì)影響食蚊魚(yú)的正常生活。污水按不同比例稀釋后電導(dǎo)值也呈現(xiàn)一定的變 化趨勢(shì)，而且變化與稀釋比例一致，相關(guān)系數(shù)為R= 0.982，說(shuō)明污水處理廠出水含有大量的金屬礦質(zhì)離 子和各類酸根離子，同時(shí)也表明本實(shí)驗(yàn)對(duì)稀釋水樣操作時(shí)工作的嚴(yán)謹(jǐn)性。

雌性食蚊魚(yú)和雄性食蚊魚(yú)的第 14、15、16 根椎肋骨呈現(xiàn)形態(tài)與功能相適應(yīng)的特征，因其在不同性 別中的功能不同而呈現(xiàn)形態(tài)上的“二態(tài)性”，表現(xiàn)為雄魚(yú)的椎肋骨粗大，向頭部彎曲，與臀鰭聯(lián)系緊密，而雌魚(yú)的這3 根椎肋骨向尾部彎曲，椎肋骨細(xì)長(zhǎng)且與臀鰭無(wú)緊密聯(lián)系。本暴露實(shí)驗(yàn)中，雄激素 MT誘 導(dǎo)后臀鰭出現(xiàn)明顯延長(zhǎng)直至發(fā)展為與雄魚(yú)類似的生殖足，第 14、15、16 根椎肋骨完全改變，基本趨 近于雄性食蚊魚(yú)的椎肋形態(tài)，再次驗(yàn)證已經(jīng)報(bào)道的強(qiáng)雄激素可以導(dǎo)致食蚊魚(yú)性逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[9,22]。同時(shí)也與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制漿造紙廢水暴露食蚊魚(yú)可以使雌性食蚊魚(yú)性腺出現(xiàn)“卵睪”、臀鰭延長(zhǎng)成為生殖足；造紙 廢水能誘導(dǎo)出雙性魚(yú)的結(jié)果相一致[23]。本研究中，廢水暴露 35d 后高濃度組的部分雌性食蚊魚(yú)出現(xiàn)臀 鰭輕度延長(zhǎng)，骨骼經(jīng)過(guò)處理之后可見(jiàn)第 14、15、16 根椎肋骨開(kāi)始出現(xiàn)膨大，向后彎曲的角度減小（也即 P:D的比值變?。?，顯示食蚊魚(yú)發(fā)生形態(tài)雄性化轉(zhuǎn)變。推測(cè)在廢水暴露過(guò)程中，雄激素類物質(zhì)作用于雌性食蚊魚(yú)，紊亂其體內(nèi)的雄激素水平，刺激雌性食蚊魚(yú)發(fā)生第 14～16 根椎肋骨膨大彎曲，臀鰭延 長(zhǎng)等變化。本研究的廢水室內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)在食蚊魚(yú)形態(tài)特征上的體現(xiàn)[11]。然而，由于暴露實(shí)驗(yàn)添加到水中雄激素物質(zhì)含量較低，此外采用的實(shí)驗(yàn)魚(yú)已經(jīng)完成性分化階段，實(shí)驗(yàn)魚(yú)在一定程度上已經(jīng)具備抵御外界內(nèi)分泌干擾物的干擾的能力，因此表現(xiàn)出來(lái)的雄激素 效應(yīng)相對(duì)微弱。

雌性食蚊魚(yú)臀鰭的ARαmRNA轉(zhuǎn)錄水平升高與水中雄激素物質(zhì)刺激有關(guān)，并 且在一定程度上呈現(xiàn)高 度相關(guān)性[24]。雄魚(yú)血液或肝臟中 VTG 則是指示食蚊魚(yú)受到雌激類物質(zhì)污染時(shí)的良好生物標(biāo)志物[25]，而 其mRNA轉(zhuǎn)錄水平更是有精確、快速反映暴露水平的特點(diǎn)[26]。本研究在污水處理對(duì)雌、雄食蚊魚(yú)暴露的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌魚(yú)臀鰭的ARαmRNA轉(zhuǎn)錄水平具有隨濃度增大而上升的趨勢(shì)，對(duì)轉(zhuǎn)錄水平和濃度數(shù)據(jù)進(jìn) 行相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)R=0.758，P＜0.01。這表明雌魚(yú)臀鰭的ARαmRNA轉(zhuǎn)錄水平升高與廢 水濃度的增加具有顯著性相關(guān)，揭示其轉(zhuǎn)錄水平的升高可能與高濃度廢水中所含有的雄激素類物質(zhì)濃度的高低有密切關(guān)聯(lián)。而相比之下，雄魚(yú)肝臟中的VTGαmRNA 轉(zhuǎn)錄水平的升高與濃度的相關(guān)性則更高（R=0.964，P＜0.001），進(jìn)一步表明雄魚(yú)肝臟VTGmRNA這一生物標(biāo)志物在監(jiān)測(cè)廢水雌激素效應(yīng)中所呈 現(xiàn)的優(yōu)越性[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明，城市廢水暴露致雌性食蚊魚(yú)發(fā)生形態(tài)雄性化轉(zhuǎn)變，并致雌魚(yú)臀鰭ARαmRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著提升，表現(xiàn)明顯的雄激素效應(yīng)；而城市廢水暴露致雄魚(yú)肝臟中的VTGαmRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著提升，則表現(xiàn)明顯的雌激素效應(yīng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與東莞寒溪河野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)的雌、雄 激素效應(yīng)在食蚊魚(yú)骨骼形態(tài)特征和目標(biāo)基因表達(dá)上的表現(xiàn)是相一致的，這也表明利用食蚊魚(yú)發(fā)生的形態(tài)雄性化或形態(tài)雌性化轉(zhuǎn)變以及VTGα和ARα目標(biāo)基因作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)城市受污染河涌中的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是可行的。

[1]郭莉.綜合廢水和環(huán)境水樣遺傳毒性評(píng)價(jià)新方法研究[D].大連:大連理工大學(xué),2013.

[2]吳玲玲,陳玲,張亞雷.菲對(duì)斑馬魚(yú)鰓和肝組織結(jié)構(gòu)的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志,2006,26(5):688-692．

[3]甘海燕.城市生活污水對(duì)斑馬魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)和NF-κB基因表達(dá)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(1):179-183.

[4]張青碧,甘仲霖,韓知峽.城市生活污水對(duì)水生動(dòng)物斑馬魚(yú)的發(fā)育毒性研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,35(23):4568-4569．

[5]劉在平,張松林.城市污水對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(12):2911-2915.

[6]梁秋燕,謝勇平,方展強(qiáng).Zn 2+ 和Cd 2+對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育階段的單一與聯(lián)合毒性研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2012,19(2)：283-292.

[7]李莉,馬陶武,吳振斌.生活污水對(duì)稀有鮈鯽的毒性效應(yīng)研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2004,28(1):40-44．

[8]潘炯華,蘇炳之,鄭文彪.蚊魚(yú)(Gambusia affinis)的生物學(xué)特性及其滅蚊利用的展望[J].華南師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué) 版,1980,(1):117-138.

[9]范俊杰,徐少群,方展強(qiáng),等.17α-甲基睪酮對(duì)食蚊魚(yú)形態(tài)雄性化及目標(biāo)基因表達(dá)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2013,37(1):9-15.

[10]Wen R S,Xie Y P,Wan C X,et al.Estrogenic and androgenic effects in mosquitofish(Gambusia affinis)from municipal effluent contaminated streams in Guangzhou,China[J].Aquatic Toxicology,2013,132-133:165-173.

[11]謝勇平,方展強(qiáng).利用食蚊魚(yú)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平評(píng)價(jià)東莞寒溪河雌/雄激素物質(zhì)污染現(xiàn)狀[J].水生生物學(xué)報(bào),2013,37(4):691-697.

[12]蘇方,謝勇平,方展強(qiáng).苯并[a]芘和鎘暴露對(duì)食蚊魚(yú)求偶行為的影響[J].生物學(xué)雜志,2013,30(4):5-10.

[13]駱曉燕,謝勇平,方展強(qiáng).鎘(Cd 2+ )暴露對(duì)食蚊魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,19(10):1-6.

[14]陳文娟,謝勇平,賴靜萍,等.城市廢水暴露對(duì)食蚊魚(yú)肝臟EROD酶活性的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,20(2):54-59.

[15]鐘林燕,謝勇平,張曉嬋,等.3,4-苯并芘暴露對(duì)食蚊魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育的毒性影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,26(4):94-97.

[16]范俊杰,黎紫蘭,徐少群,等.孕激素暴露致食蚊魚(yú)形態(tài)雄性化的生物學(xué)效應(yīng)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2014,22(4):31-36.

[17]XieY P,Fang Z Q,Hou L P,et al.Altered development and reproduction in western mosquitofish(Gambusia affinis)found in the Hanxi River,soutern China [J].EnvironmentalToxicology andChemistry,2010,29(11):2607-2615.

[18]Ospina-Alvarez N,Piferrer F.Temperature-dependent sex determination in fish revisited:Prevalence,a single sex ratio response pattern,and possible effects of climate change [J].Plos One,2008,3(7):2837.

[19]陳兆南,譚玲,董亞明,等.溶解氧和氣泡對(duì)食蚊魚(yú)生存的影響[J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,36(2):61-65.

[20]Stefan P W Walker,Loic Thibaut,Mark I McCormick.Density-dependent sex ratio adjustment and the allee effect:Amodel and a test using a sex-changing fish [J].American Naturalist,2010,176(3):312-321.

[21]Rawson C,Lim R P,Warne M S J,et al.The effect of 17β-estradiol on the development of modified hemal spines in early life-stageGambusia holbrooki[J].Arch Environ Contam Toxicol,2006,51:253-262.

[22]Ogino Y,Katoh H,Yamada G.Androgen dependent development of a modified anal fin,gonopodium,as a model to understand the mechanism of secondary sexual character expression in vertebrates [J].FEBS Letters,2004,575:119-126.

[23]Drysdale D T,Bortone S A.Laboratory induction of intersexuality in the mosquitofish,Gambusia affinis,using paper mill effluent[J].Bull Environ Contam Toxicol,1989,43:611-617.

[24]Kiyoaki Sone,Megumi Hinago,Misaki Itamoto,et al.Effects of an androgenic growth promoter 17β-trenbolone on masculinization of Mosquitofish(Gambusia affinis affinis)[J].General and Comparative Endocrinology,2005,143:151-160.

[25]溫茹淑,方展強(qiáng),江世貴,等.劍尾魚(yú)卵黃蛋白原的ELISA檢測(cè)[J].環(huán)境科學(xué)研究,2007,20(4):144-149.

[26]黃曄,任華,孫竹筠,等.壬基酚和雙酚A對(duì)雄性斑馬魚(yú)(Danio rerio)卵黃蛋白原mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2008,3(3):274-279.