紫外線誘變選育高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉

葉生梅 劉 艷 徐成明 郭興林

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

紫外線誘變選育高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉

葉生梅 劉 艷 徐成明 郭興林

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

為了選育能利用纖維素產(chǎn)酸的黑曲霉，拓展檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料。通過紫外線（UV）誘變選育檸檬酸產(chǎn)量提高的菌株，結(jié)果表明，紫外誘變獲得了一株遺傳性能穩(wěn)定的優(yōu)良菌株UV-4，產(chǎn)酸為26.77±0.67g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)酸增幅達50.39%，且UV-4利用稻草纖維素產(chǎn)酸達10.055±0.42 g/L，較出發(fā)菌株提高28.04%。

紫外線誘變；篩選；檸檬酸；黑曲霉

由于人類的生產(chǎn)需要和生活水平的提高，對能源的需求和使用日益增加。地球上的石油、煤、天然氣等化石能源被大量開采面臨枯竭，且由于化石能源的大量使用帶來了大氣污染、水污染等，使人類面臨能源枯竭和環(huán)境污染的嚴重威脅。尋求可再生的環(huán)境友好的新能源是保護我們的地球和可持續(xù)發(fā)展的迫切要求。我國是農(nóng)業(yè)大國有豐富的可再生的秸稈資源，秸稈資源中豐富的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的高值化利用，對解決我國的秸稈焚燒、三農(nóng)問題和促進農(nóng)業(yè)和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展具有現(xiàn)實意義。

紫外線是一種最常用的物理誘變因素。它的主要作用是使DNA雙鏈之間或同一條鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶間形成二聚體，阻礙雙鏈的分開、復(fù)制和堿基的正常配對，從而引起突變［1］。我國利用山芋粉、玉米粉等淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)檸檬酸水平處于世界領(lǐng)先，選育了多株高產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌種［2-4］。而利用纖維素原料生產(chǎn)檸檬酸的菌種選育未見報道［5-6］。本文通過對一株能利用秸稈纖維素產(chǎn)酸的黑曲霉菌株［7］進行誘變選育，以期獲得檸檬酸產(chǎn)率和利用稻草秸稈產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)率提高的變異株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藥品 蔗糖、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH等均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純。麥芽汁，自制。

主要儀器設(shè)備 QHZ-123B全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PYXDHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；掃描電子顯微鏡：日本日立S-4800。

黑曲霉S6（Aspergillus niger S6）從堆放中藥渣的土壤中分離篩選，本校微生物實驗室保存；斜面培養(yǎng)基PDA；誘變后初篩培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基中添加0.02%溴甲酚綠指示劑；誘變后搖瓶復(fù)篩和發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）（NH4）2SO42.8，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，蔗糖 14.0，pH值6.0，250mL三角瓶分裝50mL培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。

以預(yù)處理稻草［8］為基質(zhì)的產(chǎn)酸發(fā)酵種子培養(yǎng)基/%葡萄糖3，麥芽汁2，（NH4）2SO40.2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）預(yù)處理稻草30.0，麥芽汁20.0，葡萄糖20.0，（NH4）2SO42.8，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5；pH值 6.0，250mL三角瓶分裝50mL，115℃滅菌30min。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉孢子懸液的制備

用無菌生理鹽水將活化的斜面菌種孢子刮下，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶并振蕩，再用四層擦鏡紙過濾得單孢子懸液，調(diào)整孢子數(shù)約106-107個/mL。

1.2.2 紫外線誘變及突變株篩選 參照［1］方法

取3mL孢子懸液于平皿中，打開皿蓋，在距離30cm，功率15W的紫外燈下照射2、4、6、8、10min。以誘變前的孢子懸液為對照，每種誘變處理及對照均按10倍稀釋法稀釋，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度涂布于篩選平板，35℃培養(yǎng)三天，計算菌落數(shù)及致死率。用接種環(huán)從篩選平板中挑起變色圈直徑（T）與菌落直徑的比值（R）較大的黑曲霉菌株接種于斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)4-6d后用無菌水沖洗斜面孢子并過濾制成單孢子懸液，用于復(fù)篩及產(chǎn)酸發(fā)酵。

1.2.3 種子培養(yǎng)及發(fā)酵 參照［7］方法進行。

搖瓶復(fù)篩及檸檬酸發(fā)酵：直接用誘變篩選的黑曲霉孢子懸液接種，1mL/瓶，35℃，250r/min，培養(yǎng)4d。每個發(fā)酵三重復(fù)。

工程測量過程中的一系列測繪工作需進一步改進，應(yīng)不僅對大范圍的工程項目進行監(jiān)測，還應(yīng)適當縮小監(jiān)測的范圍來使用無人機技術(shù)測繪，對工程項目進行更為精準和全面的監(jiān)測。在遙感監(jiān)測的過程中，應(yīng)確保無人機測繪技術(shù)能對大范圍的項目，檢測的范圍可以擴大，并保證應(yīng)用的穩(wěn)定性及可控性，能夠?qū)ΡO(jiān)測范圍、監(jiān)測尺度進行調(diào)節(jié)控制，項目監(jiān)測的區(qū)域可用三維模式來展現(xiàn)。對于較惡劣、復(fù)雜的環(huán)境，比如高山、叢林等，使用無人機測繪技術(shù)還可以進行低空航拍，測量及拍攝更為靈活，用途更為廣泛。

1.3 分析測試方法

總酸的測定—NaOH滴定法［2］：發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，記錄所消耗的氫氧化鈉溶液的體積V，計算產(chǎn)酸量A。

A=C×V×M×1000/3×1000式中A為產(chǎn)酸量，g/L；C為氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；M為檸檬酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；V為消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL。

pH的測定：精密pH試紙。

發(fā)酵前后稻草纖維結(jié)構(gòu)的變化 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變致死率

圖1 紫外線照射時間對致死率的影響

2.2 突變菌株的篩選結(jié)果

選取5min為紫外線誘變照射時間，通過初篩從篩選平板中挑取變色圈直徑（T）與菌落直徑（G）的比值（R）較大的黑曲霉菌株10株接種斜面，35℃培養(yǎng) 4d后和用無菌水制備孢子懸液用于搖瓶復(fù)篩，篩選結(jié)果見表1。從表1可見誘變篩選到的10菌株產(chǎn)酸量與出發(fā)菌S6相比得到不同程度提高。其中產(chǎn)酸最高的是UV-4號菌株為26.90±0.87g/L，產(chǎn)酸較出發(fā)菌株S提高51.1%。這說明經(jīng)過UV明顯提高了黑曲霉菌株的產(chǎn)酸能力。

表1 突變菌株初篩、復(fù)篩結(jié)果

2.3 突變菌株產(chǎn)酸穩(wěn)定性

選取產(chǎn)酸提高最大及產(chǎn)酸增幅最大的突變株uv-4，進一步傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代5次，對其遺傳穩(wěn)定性進行檢驗，實驗結(jié)果見表2。

表2 突變株UV-4的產(chǎn)酸穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由表2可看出，突變株UV-4產(chǎn)酸在傳代過程中產(chǎn)酸性能穩(wěn)定，平均產(chǎn)酸26.77±0.67g/L。UV-4是一株產(chǎn)酸性能穩(wěn)定的黑曲霉變異菌株?？勺鳛槔醚芯坷w維素產(chǎn)酸的實驗菌種，以期拓展檸檬酸生產(chǎn)的原料，在農(nóng)作物秸稈高值化利用方面進行有益探索。

2.4 UV-4利用纖維素原料產(chǎn)酸考察

2.4.1 突變前后利用纖維素產(chǎn)酸比較

以預(yù)處理稻草為基質(zhì)產(chǎn)酸發(fā)酵，每隔12h取樣，發(fā)酵液過濾，濾液測定酸度，實驗結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，菌株UV-4和S6均能利用的其纖維素酶系和產(chǎn)酸酶系分解纖維素原料產(chǎn)酸，但UV-4利用預(yù)處理稻草發(fā)酵產(chǎn)酸量高于S6，到72h時UV-4產(chǎn)酸量10.05±0.42 g/L，比S6提高了28%。可見UV誘變提高了菌株利用纖維素原料的性能，UV-4是一株利用纖維素原料產(chǎn)酸的目的菌株，有一定的研究和利用的價值。

2.4.2 UV-4利用預(yù)處理稻草粉產(chǎn)酸發(fā)酵前后稻草纖維顯微結(jié)構(gòu)比較

UV-4菌株發(fā)酵預(yù)處理稻草產(chǎn)酸84h后，發(fā)酵液過濾，濾渣用蒸餾水洗至中性，60℃烘干備用。精確稱取一定量的濾渣、未處理稻草粉、預(yù)處理稻草粉，分別加入一定量的中性洗滌劑放入已沸的高壓蒸汽滅菌鍋中，100℃保溫1h，取出用沙芯漏斗過濾，殘渣用蒸餾水洗、丙酮洗滌。置于60℃干燥，干燥后的纖維用掃描電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。電鏡觀察圖如圖3所示。

圖2 誘變前后菌株發(fā)酵稻草產(chǎn)酸比較

圖3 稻草秸稈SEM顯微結(jié)構(gòu)比較

從SEM圖可見，預(yù)處理后稻草秸稈表面比未處理的光滑，纖維暴露，顏色變淺，這是由于預(yù)處理使秸稈中的大部分木質(zhì)素溶出的緣故。從圖c，f看出，預(yù)處理稻草經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，殘存的稻草纖維截面平整，表面更光滑及纖維崩解現(xiàn)象。通過顯微觀察進一步說明在發(fā)酵過程中黑曲霉利用了秸稈纖維素。

3 小結(jié)

紫外線誘變操作簡單、有效是廣泛采用的物理誘變手段。本文利用UV誘變選育到黑曲霉利用預(yù)處理稻草發(fā)酵產(chǎn)酸提高的目的菌株UV-4。UV-4利用稻草纖維素產(chǎn)酸達10.05±0.42 g/L，較出發(fā)菌株提高28%。

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ON MUTATION AND BREEDING OF Aspergillus niger OF PRODUCTIVE CITRIC ACID FERMENTATION THROUGH ULTRAVIOLET RAYS

YE Sheng-mei LIU Yan XU Cheng-ming GUO Xing-lin
（School of Biological&Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu Anhui 241000）

This paper is designed to breed the Aspergillus niger through adopting cellulose to produce acid and to enrich the raw materials of citric acid fermentation.Breeding of Aspergillus niger for citric acid fermentation through ultraviolet rays has been studied in this paper.A good niger UV-4 has been obtained through ultraviolet rays，which has genetic stability.The citric acid yield is 26.77±0.67g/L and is 50.39%higher than that of the original niger.UV-4 can produce 10.05±0.42g/L of the citric acid through using straw cellulose by，and it is 28.04%higher than that of the original niger.

ultraviolet mutation；screening；citric acid；Aspergillus niger

陳小舉

TQ920

A

1672-2868（2015）03-0054-05

2015-01-10

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項目（項目編號：KJ2010A349）；安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才項目（項目編號：2012SQRL087）

葉生梅（1963-），女，安徽太湖人。安徽工程大學(xué)，高級實驗師，碩士。研究方向：微生物菌種選育研究。

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