正交試驗(yàn)優(yōu)選歡天安神飲的水提工藝

郭華 李文 趙穎 朱維娜

（南京市中醫(yī)院，江蘇南京 210001）

正交試驗(yàn)優(yōu)選歡天安神飲的水提工藝

郭華 李文 趙穎 朱維娜

（南京市中醫(yī)院，江蘇南京 210001）

目的：研究歡天安神飲中部分藥物的水提工藝，優(yōu)選提取工藝條件。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以飲片中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和丹酚酸B的提取率為考察指標(biāo)，以浸泡時(shí)間、加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間等為考察因素，采用HPLC法測(cè)定，所得的結(jié)果進(jìn)行方差分析，綜合兩個(gè)指標(biāo)結(jié)果確定最佳工藝。結(jié)果：此復(fù)方中合歡皮、丹參等藥物確定的最佳水提工藝條件為：加飲片總量25倍量的水分3次提取，每次1.5h。結(jié)論：優(yōu)選的工藝穩(wěn)定，方法可行。

歡天安神飲 提取工藝 正交試驗(yàn)

1 儀器與試藥

1.1 儀器1290型安捷倫超高效液相色譜儀；紫外檢測(cè)器；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；KQ-500型醫(yī)用超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（IKA）。

1.2 試藥（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），供含量測(cè)定用，批號(hào)：111911-201101；丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），供含量測(cè)定用，批號(hào)：111562-201212；甲醇、乙腈為色譜純；其余所用試劑均為分析純，均購(gòu)自上海化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9（34）正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，對(duì)浸泡時(shí)間、加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間進(jìn)行考察，以（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行水提工藝最佳參數(shù)的確定［1］。提取工藝因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。稱取4劑處方量的合歡皮、丹參等9味藥材共9份，按相應(yīng)的因素水平進(jìn)行水煎，水煎液濃縮成約250mL，備用。

表1 提取工藝因素水平設(shè)計(jì)

2.2 供試品溶液的制備取約相當(dāng)于0.5g合歡皮藥材的濃縮液5mL，精密量取，置錐形瓶中，精密加入甲醇10mL、水5mL，使溶液甲醇濃度為50%，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC測(cè)定（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷含量

2.3.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（2）5u柱（250mm× 4.6mm，225-1125）；流動(dòng)相為甲醇：水梯度洗脫，0～30min（18∶82），35～40min（100∶0），45～50min（18∶82）；檢測(cè)波長(zhǎng)：204nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察精密稱取于五氧化二磷減壓干燥器中干燥24h的（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1mg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取1mg/mL（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品溶液0.125、0.25、0.75、1.25、1.75、2.5mL分別置于25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使?jié)舛确謩e為0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1mg/mL。分別吸取上述各對(duì)照品溶液20μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，以峰面積均值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=59.12.83X+ 9.68，r=0.9989。結(jié)果表明（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.1～2μg范圍內(nèi)呈良好的線性。

2.3.3 樣品中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液（濃度為0.01、0.05mg/mL）及各供試品溶液20μL注入液相色譜儀，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣2次，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，測(cè)定各樣品中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.4 HPLC法測(cè)定丹酚酸B含量

2.4.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈：2%乙酸溶液梯度洗脫，0～5min（17∶83）；19～26min（27∶73）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：284nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算不低于2000。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 （-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷方差分析

2.4.2 對(duì)照品溶液及線性關(guān)系考察精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥24h的丹酚酸B對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取1mg/mL的丹酚酸B儲(chǔ)備液0.1、0.5、1、2、3、5mL，用50%甲醇定容至10mL的容量瓶中，搖勻，分別得到濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5mg/mL的丹酚酸B系列對(duì)照品溶液。分別吸取上述各對(duì)照品溶液10μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，以峰面積均值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y= 11784.73X－58.80，r=0.9999（n=6）。結(jié)果表明丹酚酸B進(jìn)樣量在0.1～5μg范圍內(nèi)呈良好的線性。

2.4.3 樣品中丹酚酸B的含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液（濃度為0.1mg/mL，0.5mg/mL）及各供試品溶液10μL注入液相色譜儀，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣2次，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，測(cè)定各樣品中丹酚酸B的含量。結(jié)果見(jiàn)表2、表4。

表4 丹酚酸B方差分析

綜合（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B含量的方差分析結(jié)果，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際中降低成本、節(jié)約時(shí)間等因素，最終確定最優(yōu)工藝條件為A1B2C3D2。即加飲片總量25倍量水分3次提取，每次1.5h。

2.5 最佳工藝驗(yàn)證取4劑處方量的合歡皮、丹參等9味藥材各3份，按最佳水提工藝進(jìn)行提取，即藥材不浸泡，加飲片總量25倍量的水，分3次煎煮，每次1.5h。合并水煎液，濃縮至250mL，取樣測(cè)定水煎液中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量，色譜條件和供試品溶液的制備方法與水提正交樣品相同。結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果可見(jiàn)，3次試驗(yàn)所測(cè)得的（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量與最佳工藝所測(cè)得的平均含量比較相近，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，飲片的品種繁多，質(zhì)量差異很大，而且有的飲片中含有的有效成分很低，不能達(dá)到制劑的要求，因此在投料前必須控制飲片的質(zhì)量。

（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測(cè)定參照2010版《中國(guó)藥典》一部合歡皮項(xiàng)下（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)曾比較了文獻(xiàn)中合歡皮的含量測(cè)定方法，流動(dòng)相為甲醇∶水（34∶66）［2］，但峰形不好，干擾多，故最終確定2010版《中國(guó)藥典》一部合歡皮項(xiàng)下含量測(cè)定方法。因該方藥味多，60多分鐘仍有峰出現(xiàn)，故最終確定的流動(dòng)相為梯度洗脫。

丹酚酸B的含量測(cè)定參照2010版《中國(guó)藥典》一部丹參項(xiàng)下丹酚酸B的含量測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)曾比較了文獻(xiàn)中丹參的含量測(cè)定方法，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），流動(dòng)相復(fù)雜，因本試驗(yàn)所用高效液相色譜儀為二元泵，需要人工將流動(dòng)相進(jìn)行混合，增加了誤差，經(jīng)查閱了大量的文獻(xiàn)和反復(fù)摸索，故最終確定丹參的流動(dòng)相為上述梯度洗脫方法。

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選歡天安神飲水提工藝，以（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和丹酚酸B含量為指標(biāo)，采用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果進(jìn)行方差分析，最終優(yōu)選出A2B2C3D2的制備工藝，又通過(guò)最佳水提工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也證明了該工藝的合理性。

［1］張建玲，賀祝英，吳紅梅.正交試驗(yàn)優(yōu)選心衰寧合劑水提工藝.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（7）：30

［2］干國(guó)平，朱紅，師磊，等.不同產(chǎn)地山合歡皮中（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-B-D-葡萄糖苷含量的比較.藥物分析雜志，2009，29（4）：606

編輯：吳寧

表5 水提工藝驗(yàn)證結(jié)果

R289.5

A

1672-397X（2015）11-0056-03歡天安神飲為臨床上使用多年的安全、有效方，主要由合歡皮、景天三七、丹參、酸棗仁等9味中藥組成，具有解郁安神、活血消腫的功效。因方中君藥為合歡皮，其有效成分為水溶性成分，且臨床應(yīng)用劑型為湯劑，故本實(shí)驗(yàn)選用水提工藝進(jìn)行研究，以浸泡時(shí)間、加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間等工藝條件為考察因素，以（-）-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B的含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化研究。

郭華（1976—），女，本科學(xué)歷，主管中藥師，中藥學(xué)專業(yè)。

李文，本科學(xué)歷，主任中藥師。510531043@qq.com

2015-05-26