東亞三角渦蟲Djtraf3基因的時空表達模式

范曉靜，周魯明，劉殿辰，趙博生

（山東理工大學 生命科學學院 發(fā)育與進化生物學實驗室，山東 淄博 255049）

東亞三角渦蟲Djtraf3基因的時空表達模式

范曉靜，周魯明，劉殿辰，趙博生

（山東理工大學 生命科學學院 發(fā)育與進化生物學實驗室，山東 淄博 255049）

腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）作為TRAF家族的成員之一，通過介導TLRs信號通路，參與動物的免疫反應。通過構建東亞三角渦蟲Djtraf3的cDNA文庫獲得Djtraf3基因并分析基因結構。結果發(fā)現(xiàn)，該最大開放閱讀框為564 bp，編碼的蛋白質含187個氨基酸，含有1個TRAF結構域。進化分析表明，DjTRAF3和果蠅的TRAF3聚群，位于進化樹的基部；整體原位雜交結果顯示，在渦蟲成體及不同再生階段，Djtraf3在整個腸部表達。這些結果為進一步探究其功能提供了依據(jù)和方向。

東亞三角渦蟲；Djtraf3；DIG-labeling RNA探針；原位雜交

腫瘤壞死因子受體相關因子（tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是介導生物體內細胞因子間信號傳導的一類適配蛋白［1］，1994年12月，Hu等［2］通過酵母雙雜交技術得到了一個含有高度保守的TRAF結構域和鋅指結構的新蛋白，該蛋白可以通過與 CD40蛋白相互作用來促進下游信號通路的傳導，將該蛋白命名為TRAF3，也叫CD40結合蛋白。TRAF3是TRAFs家族功能最為多樣化的成員之一，TRAF3可以與 MyD88（myeloid differentiation factor 88）、TRIF（toll-receptorassociated activator of interferon）相互作用，促進TRAF3與IRAK-1（interleukin-1（IL-1）-receptorassociated kinase-1）、TBK-1（TRAF-associated NFKB activator binding kinase-1）和IKK-ε（IkB kinase-ε）蛋白復合物的形成，誘導IFN（type I interferon）的表達，介導TLRs信號通路，從而參與機體的免疫［3-4］；Oganesyan等［5］發(fā)現(xiàn)TRAF3在不依賴TLRs信號通路的抗病毒過程中也有重要作用。TRAF3蛋白還能通過自身指環(huán)結構的活性和TRAF結構域與NF-κB誘導激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）的綁定結合來調控MAPK（mitogen-activated protein kinases），激活蛋白激酶的蛋白水平，從而調控pl00轉變?yōu)閜52的NF-κB活化過程，同時，TRAF3還可以通過抑制NF-κB的活性參與淋巴毒素β受體（LTβR）誘導細胞凋亡的過程［6-9］。此外，TRAF3還與EBV（epstein-barr virus）介導的疾病、套細胞淋巴癌和自身免疫疾病相關。目前，通過對Hodgkin疾病的研究，證明抑制TRAF3的降解，有助于對于該疾病的治療［10］。迄今為止，已在線蟲、果蠅、斑馬魚、鼠和人等多種生物體中發(fā)現(xiàn)了TRAF3的存在，在哺乳動物中，traf3基因廣泛表達于體內的各個組織，例如心、脾、肺、肝臟和腸等［11］。

東亞三角渦蟲（Dujesia japonica）屬于扁形動物門（Platyhelminthes）、渦蟲綱（Turbelaria）、三腸目（Tricladicla）、三角渦蟲科（Dugesiidae）、真渦蟲屬（Dugesia），是扁形動物門渦蟲綱的代表動物。扁形動物是在動物演化進程中是首次出現(xiàn)兩側對稱、三胚層的類群［12-13］，且渦蟲具有很強的再生能力，身體的每一小段都能再生成一個完整的個體，因而其已成為研究進化、發(fā)育和再生機制的模式動物［14-15］。

筆者通過DIG-labeling RNA探針和原位雜交技術來研究Djtraf3基因在渦蟲成體和不同再生階段的具體位置，為進一步研究其功能奠定基礎，同時為探究該基因在不同物種中的生物學功能及進化歷程提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

東亞三角渦蟲采于山東省博山區(qū)泉河頭，用大約20℃滅菌且用充氧過夜的涼開水飼養(yǎng)，每周用雞蛋黃喂食渦蟲1次，隔天換水，實驗前渦蟲饑餓處理1周。含東亞三角渦蟲Djtraf3基因的重組質粒pcDNA 3.0-Djtraf3保存在由筆者所在實驗室成員構建的渦蟲cDNA文庫中。Nde I、Sp6 RNA聚合酶、RNase Inhibitor、Dnase，F(xiàn)ermentas公司；Yeast Extract、甘氨酸（Gly）、蛋白酶 K，Amresco公司；DIG RNA labeling Mix、地高辛抗體、blocking reagent，Roche公司，其他藥品為市售分析純。

1.2 生物信息學分析

經初步分析的DjTRAF3氨基酸序列，在NCBI進行 Blastp比對，尋找保守區(qū)域（conservation domain，CD）和同源蛋白序列。用DNASTAR軟件包中的MegAlign軟件分析同源蛋白的CD序列之間的相似性；用 PHYLIP 3.5c軟件包中的 Neighbor-Joining方法，采用bootstrap復制數(shù)為1 000，并用Cavia porcellus TRAF2作為外類群構建進化樹。

1.3 DIG標記的RNA探針的合成

堿裂解法提取pcDNA3-Djtraf3質粒，NdeⅠ限制性內切酶酶切pcDNA3-Djtraf3質粒，以線性化的pcDNA3-Djtraf3質粒DNA為模板，用SP6 RNA聚合酶體外轉錄合成反義的DIG標記的RNA探針；對照利用T7 RNA聚合酶合成正義鏈的探針。

1.4 再生渦蟲及成體渦蟲的制備

選擇大小適中的渦蟲，將其切割成頭、中、尾3部分，隔天換水，依次收集再生3、5、7和10 d的渦蟲各15條，將再生渦蟲與20條成體渦蟲用2%（體積分數(shù)）的鹽酸殺死，除去鹽酸，加入4%（體積分數(shù)）的多聚甲醛于4℃固定4 h，用30%、50%和70%（體積分數(shù)）的乙醇依次脫水，每次1min，最后溶于70%的乙醇中，-20℃保存。

1.5 原位雜交

標本經6%（體積分數(shù)）H2O2漂白，20 μg/mL的Protease K消化25min，Gly終止后，用磷酸鈉-吐溫緩沖液（NaPBSTw）和磷酸鈉緩沖液（NaPBS）洗滌，40g/L多聚甲醛固定1 h，0.1 mol/L三乙醇胺加0.25%（體積分數(shù)）乙酸酐進行乙?；?，56℃預雜交3 h，加入DIG標記的探針56℃雜交36 h，其中5條成體渦蟲不加探針作為空白對照組。雜交后分別用檸檬酸鈉緩沖液（saline sodium citrate）2、0.5和0.2倍體積洗脫，20 μg/mL RNA酶A 37℃消化30min，100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）含150 mmol/L NaCl洗3次。1%Blocking solution（100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）含150 mmol/L NaCl），室溫封閉1 h，在含Anti-dig antibody（1∶4 000）的Blocking solution中，室溫孵育2 h，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）含150 mmol/L NaCl和50 mmol/L MgCl2洗3次，然后氯化硝基四氮唑藍-四唑硝基藍（NBT/ BCIP）顯色，NikonAZ100顯微鏡觀察拍照。重復以上實驗6次。

2 結果與討論

2.1 生物信息學分析

pcDNA3.0-Djtraf3的 cDNA全長為 746 bp（圖1）。由圖1可知：最大開放閱讀框為564 bp，編碼的蛋白質含187個氨基酸，蛋白相對分子質量大小約為 2.13×104。蛋白序列經 NCBI的BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白包含1個MATH（meprin and TRAF-C homology）superfamily結構域，也即TRAF結構域，包含約150個氨基酸殘基，預測其底物結合區(qū)位于98～159位氨基酸區(qū)域內，與其他動物類群的TRAF3氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與果蠅相似度約23%，與斑馬魚相似度約36%，與哺乳動物相似度高達35%～39%。利用DNASTAR軟件包中的MegAlign程序對各物種的TRAF3蛋白序列中TRAF結構域進行比對，結果顯示TRAF3蛋白中的TRAF結構域具有高度保守性，尤其是TRAF-C區(qū)域（圖2）。利用Philip3.5c軟件包，采用鄰位相連法，Cavia porcellus的TRAF2為外類群（GenBank登錄號：XP_003473154.1），1 000次重復，對代表物種的TRAF3蛋白進行進化分析，結果見圖3。由圖3可知：DjTRAF3和果蠅的TRAF3聚群，位于進化樹的基部，屬于TRAF3的原始類型。

圖1 pcDNA3-Djtraf3菌落不同溫度梯度的PCR檢測結果Fig.1 PCR results from recombinant pcDNA3-Djtraf3 plasmid

2.2 Djtraf3在渦蟲整體和再生過程中的時空表達

利用地高辛標記的探針進行原位雜交，不含探針的空白對照組成體渦蟲，結果見圖4。由圖4可知：不含探針的空白對照組沒有出現(xiàn)陽性信號；Djtraf3陽性信號遍于渦蟲整個腸上，而且重復實驗結果一致。這表明，Djtraf3特異性地表達于成熟渦蟲的腸。同時，在渦蟲再生過程中的不同時間和不同切段，陽性信號均廣泛分布于切段和新再生的腸，再生7 d后恢復到類似于成蟲的表達圖式（圖 5），而在渦蟲的再生胚基中，未觀察到Djtraf3的表達，由此推測，Djtraf3基因可能在渦蟲再生過程中并不發(fā)揮作用，而主要是參與渦蟲的先天免疫。

目前，已在從低等到高等的多種生物體內（如線蟲、果蠅、斑馬魚、鼠、人等）中發(fā)現(xiàn)了traf3基因的存在，渦蟲在該基因進化歷程中屬于較原始類群。哺乳動物的TRAF結構域可以介導TRAFs成員和受體、TRAFs成員之間、TRAFs成員和一些胞內蛋白或信號分子的相互作用。TRAF結構域包含約200個氨基酸殘基，可劃分為TRAF-N和TRAF-C兩部分［16-17］。 TRAF-C區(qū)域為高度保守的氨基酸同源結構域，含160～165個氨基酸殘基，可以介導TRAF分子形成同源或異源二聚體或多聚體，并分別與不同受體蛋白胞內段的TRAF結構域或胞漿中其他含有TRAF結構域的蛋白結合。TRAF-C可以與TANK、NIK等下游信號分子結合［18］。TRAF-N含有周期排列的疏水性氨基酸殘基，可形成環(huán)-環(huán)α螺旋結構，此結構對TRAF3分子形成三聚體不可或缺［19］。哺乳動物的TRAF3分子的N端都含有1個RING指模序結構，RING指模序結構后有5～7個鋅指結構域［20］。RING指模序介導DNA-蛋白質以及蛋白質-蛋白質間的相互作用，同時還與NF-κB的激活相關，之后還發(fā)現(xiàn)環(huán)指結構參與TRAFs的蛋白酶體依賴的降解過程［21］，而鋅指結構域對NF-кB和JNK的激活都十分重要，TRAF-N能與c-IAPI和c-IAPZ等抗凋亡分子相互作用［22］。本實驗研究表明渦蟲的 Djtraf3基因編碼的蛋白亦含有 1個TRAF結構域，且其TRAF-C區(qū)域高度保守，因而推測DjTRAF3在渦蟲體內也有類似作用機制。同時，筆者通過DIG-labeling RNA探針和原位雜交技術確定了Djtraf3基因在渦蟲整體的具體位置和在不同再生階段的表達位置，結果顯示，Djtraf3在渦蟲成體及不同再生階段均一致表達于整個腸上，因而推測其參與渦蟲的先天免疫，是渦蟲免疫信號通路中的一個調試蛋白，抵抗外界病原微生物的入侵。

圖2 DjTRAF3蛋白序列與其他代表物種的TRAF3氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences of TRAF3 proteins including DjTRAF3

圖3 DjTRAF3和其他物種TRAF3蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of DjTRAF3 and other animal TRAF3 proteins

圖4 Djtraf3基因在渦蟲成體的表達模式Fig.4 Expression patterns of Djtraf3 in adult intact

3 結論

研究發(fā)現(xiàn)，渦蟲TRAF3屬于TRAF3的原始類型，可能在渦蟲的天然免疫中發(fā)揮作用，對于豐富TRAF3的進化意義以及進一步闡明其作用機制、攻克相關疾病提供了依據(jù)和方向。

圖5 Djtraf3基因在渦蟲不同再生階段中的表達模式Fig.5 Expression patterns of Djtraf3 in regenerating planarians during different stages

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（責任編輯 荀志金）

Expression of Djtraf3 in planarian Dugesia japonica

FAN Xiaojing，ZHOU Luming，LIU Dianchen，ZHAO Bosheng
（Laboratory of Developmental and Evolutionary Biology，School of Life Sciences，Shandong University of Technology，Zibo 255049，China）

Tumor necrosis factor receptor-associated factors 3（TRAF3）takes part in immune response in animals by mediated TLRs signal pathway.The cDNA Djtraf3 encoding a planarian TRAF3，contained a 564 bp open reading frame corresponding to a deduced protein of 187 amino acids，and a TRAF conservation domain.Phylogenetic analysis shows that DjTRAF3 and Drosophila melanogaste TRAF3 proteins are grouped together，and falling at the base clade.The study probed the expression patterns of Djtraf3 in adult and different regeneration courses of planarian Dugesia japonica.The results showed that Djtraf3 located in digestive system in homeostasis and regeneration.These findings provide the basis and direction for further exploring its function.

Dugesia japonica；Djtraf3 gene；DIG-labeling RNA probe；whole-mount in situ hybridization

Q785

A

1672-3678（2015）02-0047-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.009

2014-01-06

山東省自然科學基金（ZR2013CM011）

范曉靜（1986—），女，山東濟寧人，碩士研究生，研究方向：發(fā)育與進化生物學；趙博生（聯(lián)系人），教授，E-mail：zhaobosheng@sdut.edu.cn