離體培養(yǎng)藏紅花細胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性

扶文君，袁麗紅

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800）

離體培養(yǎng)藏紅花細胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性

扶文君，袁麗紅

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800）

研究pH、溫度、光照、氧化劑、還原劑、食品添加劑和金屬離子對離體培養(yǎng)的藏紅花細胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性的影響，并與藏紅花柱頭色素進行比較。結(jié)果表明：藏紅花細胞合成的色素與柱頭色素均為水溶性色素，呈亮黃色，對食品添加劑（食鹽、檸檬酸、蔗糖、苯甲酸鈉）和H2O2表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。與柱頭色素相比，藏紅花細胞合成的色素對強酸（pH 1）、高溫（80、100℃）和光照（日光燈光、紫外光）表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，對VC和Cu2+（0.001 mol/L）的穩(wěn)定性略差。稀堿溶液（0.47 mol/L Na2CO3、0.1 mol/L NaOH）、Na2SO3、Fe2+（0.050 mol/L）和Fe3+能使細胞合成的色素色強增強。

藏紅花；藏紅花色素；離體培養(yǎng)；穩(wěn)定性

藏紅花（Crocus sativus L.）又名番紅花、西紅花，為鳶尾科植物，由于藏紅花柱頭中主要成分藏紅花苷（crocin）具有較好的水溶性和極強的著色力，藏紅花醛（safranal）具有獨特的香味，因此，藏紅花可作為珍貴的調(diào)味劑、香料和染料［1-2］。近年來，研究人員通過醫(yī)藥學研究發(fā)現(xiàn)藏紅花在抗腫瘤［3］、免疫調(diào)節(jié)［4］、治療心腦血管系統(tǒng)疾?。?］和抗抑郁［6］等方面亦具有良好功效。

植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的建立和發(fā)展為解決藏紅花資源短缺提供了一條有效途徑。國內(nèi)外已開展藏紅花細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花色素的研究，并取得了一定進展。陳書安、Dufreshe等［7］和孟風來等［6-8］對藏紅花細胞的懸浮培養(yǎng)進行了研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)20 d后細胞生物量為12.3g/L（以細胞干質(zhì)量計），28 d藏紅花素含量和產(chǎn)量分別為95.8mg/g和0.92g/L。Dufresne等［7］利用藏紅花細胞葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase）進行藏紅花酸（crocetin）糖基化，在培養(yǎng)12 d的100mL細胞培養(yǎng)物中加入30mg藏紅花酸，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4 d可轉(zhuǎn)化形成9mg/g藏紅花酸糖酯。

藏紅花色素在貯存中受到環(huán)境中溫度、pH和光照等因素的干擾，直接影響色素的藥用價值。而藏紅花色素的主要成分為藏紅花苷、藏紅花苦素、藏紅花醛和一些類胡蘿卜素類物質(zhì)。其中，類胡蘿卜素因具有不穩(wěn)定性，而能發(fā)生直接化學氧化降解、光氧化降解和熱氧化降解［9］。在自然界中植物代謝產(chǎn)物糖基化現(xiàn)象普遍存在，通過糖基化化合物由非結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)，可使穩(wěn)定性增強［10］。

以藏紅花球莖和幼芽為外植體誘導獲得了性狀優(yōu)良的細胞系［11］，在此基礎(chǔ)上對細胞性狀進行調(diào)控并建立了藏紅花細胞懸浮培養(yǎng)體系，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化和添加誘導子［12］等措施，發(fā)現(xiàn)藏紅花細胞表現(xiàn)出穩(wěn)定的色素合成能力。為評價離體培養(yǎng)藏紅花細胞合成的色素的應用潛力，本實驗系統(tǒng)研究pH、溫度、光照、氧化劑、還原劑、食品添加劑以及金屬離子對其穩(wěn)定性的影響，并與柱頭色素進行比較，以期為該色素資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藏紅花球莖愈傷組織（橙黃色，質(zhì)地疏松、不透明），由筆者所在實驗室誘導和篩選。藏紅花干柱頭，購于上海崇明島。

1.2 試劑

NaOH、Na2CO3、H2O2、Na2SO3、VC、CuCl2、FeCl3、FeSO4、Na2HPO4、甲醇、乙醇、乙醚、三氯甲烷、環(huán)己烷、濃鹽酸、食鹽、檸檬酸、蔗糖和苯甲酸鈉等，均為市售分析純。

1.3 儀器設(shè)備

BS-224S型電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；FreeZone 2.5型凍干機，美國Labconco公司；UV-2800型紫外可見分光光度計，尤尼科（上海）儀器有限公司；PHS-3C型pH計，上海精科儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋和光照培養(yǎng)箱，上海博迅有限公司儀器設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 藏紅花細胞培養(yǎng)合成藏紅花色素

將MS培養(yǎng)基上（附加2mg/L萘乙酸（NAA）、0.5mg/L 6-芐基嘌呤（6-BA）、30g/L蔗糖、6.5g/L瓊脂，滅菌前調(diào)pH 6.0～6.1）培養(yǎng)30 d的藏紅花細胞接種于1/2 B5培養(yǎng)基（大量元素減半，附加2mg/L吲哚乙酸（IAA）、0.5mg/L 6-BA、20g/L蔗糖，滅菌前調(diào)pH 6.0～6.1），接種量為100mL培養(yǎng)基接種15g細胞，（21±0.5）℃振蕩培養(yǎng)28～30 d后收獲，轉(zhuǎn)速為150r/min。收獲的細胞培養(yǎng)物于4℃、8 000r/min離心15min，用去離子水洗滌2次，收獲細胞并凍干。

1.4.2 色素溶解性的測定

分別稱取等量凍干細胞和柱頭于5mL容量瓶中，加入蒸餾水、無水甲醇、體積分數(shù)50%甲醇、無水乙醇、體積分數(shù)50%乙醇、乙醚、三氯甲烷、環(huán)己烷、0.1 mol/L NaOH、0.47 mol/L Na2CO3和 0.1 mol/L HCl等溶劑，觀察色素在不同溶劑中的溶解性及溶液顏色。

1.4.3 色素母液配制

分別稱取一定量凍干細胞和干柱頭于容量瓶中，加蒸餾水浸提48 h后過濾并定容至1 L，即得色素母液。

1.4.4 色素光譜特性的測定

測定色素母液在200～600 nm的紫外-可見吸收光譜。

1.4.5 pH對色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL pH 3、5和7的0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4緩沖液，pH為9的0.05 mol/L硼砂-0.2 mol/L硼酸緩沖液，pH為 11的 0.1 mol/L NaOH-0.05 mol/L Na2HPO4緩沖液及0.1 mol/L HCl，混勻，靜置2 h后觀察顏色并在440 nm處測吸光值；以加入5mL蒸餾水作對照。

1.4.6 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

取等體積的細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別置于20、40、60、80和100℃的恒溫水浴鍋中加熱1 h，在440 nm處測吸光值。

1.4.7 光照對色素穩(wěn)定性的影響

取等體積的細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別放置于光照培養(yǎng)箱（光照強度15 000 lx）、避光和紫外燈（15 W）一定時間，在440 nm處測吸光值。

1.4.8 氧化劑對色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 0.33、0.66、0.99 mol/L H2O2溶液，室溫下放置2 h后在440 nm處測吸光值；以加入5mL蒸餾水作對照。

1.4.9 還原劑對色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 0.2、0.4、0.6和0.8g/L Na2SO3溶液，1、2和3g/L VC溶液，室溫下放置2 h，在440 nm處測吸光值；以加入5mL蒸餾水作對照。

1.4.10 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 10、20、30和40g/L食鹽溶液，5、10、15和20g/L檸檬酸溶液，20、40、60和80g/L蔗糖溶液，0.5、1.0、1.5和2.0g/L苯甲酸鈉溶液，室溫下放置2 h，在440 nm處測吸光值；以加入5mL蒸餾水作對照。

1.4.11 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 0.001、0.005、0.01、0.05 mol/L CuCl2、FeCl3和FeSO4溶液，室溫下放置2 h，在440 nm處測吸光值；以加入5mL蒸餾水作對照。為消除Fe3+顏色的影響，以相應濃度的FeCl3溶液做參比。

1.4.12 數(shù)據(jù)分析

1.4.5～1.4.11試驗色素穩(wěn)定性以色素殘存率表示；上述所有試驗結(jié)果均為3次重復實驗所得的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 色素的溶解性

2.2 色素的光譜特性

藏紅花細胞合成的色素和柱頭色素在紫外區(qū)和可見光區(qū)均有吸收，但二者吸收特征具有一定差異（圖1）。由圖1可知：細胞合成的色素在紫外區(qū)吸收很強，并且明顯強于可見光區(qū)的吸收，在280和330 nm有2個顯著的吸收特征峰，在400～500 nm可見光區(qū)也有吸收，但由于多個吸收峰的重疊未表現(xiàn)出顯著的吸收特征峰，且呈現(xiàn)出寬的吸收特征，吸收則隨波長的減少吸收增強。柱頭色素有3個吸收特征峰，分別為254、330和440 nm。此外，二者都有末端吸收。

表1 藏紅花色素的溶解性Table 1 The solubilities of pigments in different solvents

圖1 藏紅花色素的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of pigments

藏紅花苷在可見光區(qū)和紫外區(qū)均有吸收特征峰。糖酯鍵使藏紅花苷在260 nm處具有第一個吸收帶；全反式類胡蘿卜素類化合物使其在400～470 nm處具有第二個吸收帶，最大吸收波長為440 nm；全順式結(jié)構(gòu)使其在328 nm處具有第三個吸收帶［13］。本實驗中藏紅花細胞合成的色素與柱頭色素在上述3個波長段均有吸收，含有主要物質(zhì)藏紅花苷，但細胞合成的色素的紫外吸收很強?？梢?，藏紅花細胞合成的色素可能較天然色素成分更復雜，色素中除了含有主要物質(zhì)藏紅花苷外，還含有其他紫外吸收物質(zhì)，與天然藏紅花色素成分存在差異。

2.3 pH對色素穩(wěn)定性的影響分析

圖2為pH對2種色素穩(wěn)定性影響的結(jié)果。從圖2可以看出，在不同pH溶液中2種色素穩(wěn)定性具有一定差異。在pH為1時細胞合成的色素的色素殘存率為90.0%，柱頭色素殘存率只有45.2%，說明細胞合成的色素在pH為1時的穩(wěn)定性優(yōu)于柱頭色素。在pH 3～11范圍內(nèi)柱頭色素比較穩(wěn)定，色調(diào)均為亮黃色。柯貴珍［13］報道了在pH為11、12溶液中天然藏紅花色素溶液吸光度明顯增加的現(xiàn)象，而本研究中柱頭色素在堿性條件下比較穩(wěn)定，但未表現(xiàn)出增色現(xiàn)象，這可能與藏紅花柱頭的來源（產(chǎn)地、質(zhì)量）有關(guān)。細胞合成的色素在pH為1～5范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，色調(diào)為亮黃色，但在中性到堿性條件下具有顯著的增色效應，并且增色效應隨堿性的增強而增強，在pH=7的緩沖液中呈橙黃色，在pH為9或11緩沖液中呈橙紅色。

圖2 pH對色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of pH on stabilities of pigments

2.4 溫度對色素穩(wěn)定性的影響分析

（1）由四川省發(fā)改委統(tǒng)籌協(xié)調(diào)編制天然氣分布式能源規(guī)劃。各地市政府在全省“十三五”能源發(fā)展規(guī)劃和相關(guān)政策指導下依據(jù)當?shù)爻鞘锌傮w規(guī)劃、供熱規(guī)劃、熱力電力需求、資源稟賦、環(huán)境約束等條件，因地制宜、統(tǒng)籌謀劃、科學編制各地天然氣分布式能源建設(shè)規(guī)劃并報省發(fā)改委審批。

溫度對2種色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出：溫度對2種色素的穩(wěn)定性影響不同。20～60℃柱頭色素殘存率變化不大，具有一定的熱穩(wěn)定性，但隨溫度的升高，80和100℃色素殘存率明顯下降。高麗等［14］也報道了梔子黃色素（主要成分為藏紅花苷）具有一定耐熱性。細胞合成的色素隨溫度的升高色強增強，100℃色素殘存率為115.9%。說明高溫對藏紅花細胞合成的色素具有明顯的增色作用。

圖3 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature on stabilities of pigments

2.5 光照對色素穩(wěn)定性的影響分析

光照對色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖4。從圖4（a）可以看出：在日光燈光照下，柱頭色素對光極不穩(wěn)定，褪色嚴重，放置 3 d后色素殘存率只有12.8%；細胞合成的色素在放置11 d過程中色素殘存率呈逐漸下降趨勢，但變化幅度不大，未見明顯褪色現(xiàn)象，11 d后色素殘存率仍達78.6%。說明細胞合成的色素對光的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于柱頭色素。

圖4 光照對色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of light on stabilities of pigments

從圖4（b）可以看出：在避光條件下，柱頭色素殘存率逐漸下降，但較日光燈光照下穩(wěn)定，11 d色素殘存率仍有61.6%。細胞合成的色素變化不大，且色強略有增強，11 d后色素殘存率為104.5%，說明在避光條件下細胞合成的色素穩(wěn)定性優(yōu)于柱頭色素。

從圖4（c）可以看出：在紫外光照射下，柱頭色素殘存率呈逐漸下降趨勢，變化沒有日光燈光照下明顯，但比避光條件下變化幅度大，6 d后色素殘留率為62.1%；而細胞合成的色素放置3 d后色強明顯增強，色素殘存率為125.5%，之后變化幅度不大，6 d后色素殘留率為124.9%。可見，細胞合成的色素對紫外光亦表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

2.6 氧化劑和還原劑對色素穩(wěn)定性的影響分析

圖5為氧化劑和還原劑對2種色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果。從圖5（a）可以看出：加入H2O2后，2種色素殘存率略有下降，但加大濃度后2種色素均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，加入0.99 mol/L H2O2后細胞合成的色素與柱頭色素的色素殘存率仍達90.9%和 91.4%。從圖5（b）、5（c）可以看出：還原劑Na2SO3和VC對2種色素的穩(wěn)定性影響不同。Na2SO3和VC對柱頭色素穩(wěn)定性沒有明顯影響，但Na2SO3對藏紅花細胞合成的色素具有顯著的增色作用，并且增色效應隨Na2SO3濃度提高而增強；VC使細胞合成的色素的色素殘存率有一定降低，并且在1～3g/L實驗濃度范圍內(nèi)色素殘存率基本一致，說明還原劑對細胞合成的色素穩(wěn)定性影響與還原劑種類有一定關(guān)系。

2.7 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響分析

圖6為食品添加劑對2種色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果。由圖6可知：食鹽、檸檬酸、蔗糖和苯甲酸鈉對細胞合成的色素和柱頭色素穩(wěn)定性影響不大，2種色素對4種食品添加劑均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

圖5 氧化劑和還原劑對色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of oxidant and reductant on stabilities of pigments

2.8 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

圖7為金屬離子對2種色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果。由圖7可知：Cu2+、Fe2+、Fe3+對2種色素穩(wěn)定性影響具有一定差異。Cu2+對柱頭色素的影響不大，殘存率基本不變，在98.0%～102.0%范圍。細胞合成的色素在低濃度的Cu2+（0.001 mol/L）溶液中色強下降，色素殘留率為86.0%，但在0.005、0.010和0.050 mol/L Cu2+溶液中表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性，色素殘存率為 94.2%～99.2%。在 0.001、0.005和0.010 mol/L Fe2+溶液中，2種色素表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；但在高濃度Fe2+（0.050 mol/L）溶液中，2種色素色強都明顯增強，細胞合成的色素與柱頭色素的色素殘存率分別為159.8%和138.6%。柱頭色素對Fe3+極不穩(wěn)定，色素色強明顯下降，色素殘存率為18.9%～35.2%。但細胞合成的色素對Fe3+表現(xiàn)很好的穩(wěn)定性，且具有極強的增色效應，增色效應隨Fe3+濃度提高而增強，色素殘存率為152.5%～175.2%。

高麗等［14］、郝金聲等［15］分別研究了 Cu2+對梔子黃色素和密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)色素的吸光值隨Cu2+濃度增加而增加，并未表現(xiàn)出本實驗中低濃度Cu2+對色素影響的效應。因此關(guān)于低濃度Cu2+對細胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性影響的原因有待進一步探討。

圖7 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of metal ions on stabilities of pigments

3 結(jié)論

藏紅花柱頭色素對pH 3～11堿性溶液、H2O2、Na2CO3、VC、食鹽、檸檬酸、蔗糖、苯甲酸鈉、Cu2+和Fe2+（0.001、0.005、0.010 mol/L）穩(wěn)定性較好，但對pH 1、高溫（80、100℃）、光照（日光燈光、紫外燈光）和Fe3+穩(wěn)定性差。

與藏紅花柱頭色素相比，離體培養(yǎng)藏紅花細胞合成的色素在pH 1、高溫（80、100℃）、光照（日光燈光、紫外燈光）條件下的穩(wěn)定性更佳。細胞合成的色素在稀堿（0.47 mol/L Na2CO3、0.1 mol/L NaOH）、Na2SO3、Fe2+（0.05 mol/L）和Fe3+溶液中色強增強，對VC和Cu2+（0.001 mol/L）的穩(wěn)定性略差。說明離體培養(yǎng)細胞合成的藏紅花色素表現(xiàn)出更加優(yōu)良的穩(wěn)定性，尤其對強酸、高溫和光照的表現(xiàn)更佳，可為該色素的應用提供一定的依據(jù)和幫助。

［1］楊英，趙煥君.中藥藏紅花的研究進展［J］.中醫(yī)藥學刊，2006， 24（12）：2324-2325.

［2］Escribano J，Alonso G L，Coca Prados M，et al.Crocin，safranal and picrocrocin from saffron（Crocus sativus L.）inhibit the growth of human cancer cells in vitro［J］.Cancer Letters，1996，100：23-30.

［3］Escribano J，Diaz M J M，Riese H H，et al.In vitro activation of macrophages by a novel proteoglycan isolated from croms of Crocus sativus L.［J］.Cancer Letters，1999，144：107.

［4］陳瓊，顧仁樾，周端.藏紅花對冠心病心絞痛患者血流變學的作用［J］.遼寧中醫(yī)雜志，1997，24（8）：372-373.

［5］Noorbala A A，Akhondzadeh S，TahmacebiPour N，et al.Hydroalcoholic extract of Crocus sativus L.versus flouxetine in the treatmentof mild moderate depression：a double-blind，randomized pilot trial［J］.Journal of Ethnopharmacology，2005，97：281-284.

［6］陳書安，王曉東，袁曉凡，等.藏紅花細胞懸浮培養(yǎng)動力學研究［J］.生物技術(shù)通報，2011（4）：102-105.

［7］Dufresne C，CormierF，Dorion S，etal.Glycosylation of encapsulated crocetin by a Crocus sativus L.cell culture［J］. Enzyme and Microbial Technology，1999，24：453-462.

［8］孟凡來，趙昶靈，段麗斌，等.高等植物類胡蘿卜素的生物降解途徑研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2013，29（24）：143-150.［9］趙明強，丁家宜.植物培養(yǎng)物對外源化合物的糖基化［J］.藥學實踐雜志，2000，5（18）：340-342.

［10］袁麗紅，陸玉婷，黃晶.藏紅花愈傷組織誘導和褐化抑制［J］.南京工業(yè)大學學報：自然科學版，2009，31（6）：21-26.

［11］孫鎮(zhèn)，袁麗紅，吳頻梅.誘導子對藏紅花懸浮培養(yǎng)細胞生產(chǎn)藏紅花色素的影響［J］.生物加工過程，2013，11（3）：18-23.

［12］Cossignani L，Urbani E，Simonetti M S，ea al.Characterisation of secondary metabolites in saffron from central Italy（Cascia， Umbria）［J］.Food Chemistry，2014，143：446-451.

［13］柯貴珍.天然植物染料藏紅花對真絲織物染色［J］.絲綢，2010（12）：4-6.

［14］高麗，鄧青云，姜益泉，等.梔子黃色素提取及其穩(wěn)定性的研究［J］.中國釀造，2012，31（5）：16-179.

［15］郝金聲，壽慶華，王超英.天然食用密蒙花黃色素的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1994，6（2）：21-32.

（責任編輯 周曉薇）

Stabilities of saffron pigments produced by in vitro cell culture of Crocus sativus L.

FU Wenjun，YUAN Lihong
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

The effects of pH，temperature，light，oxidant，reductant，food additives and metal ions on the stabilities of saffron pigments produced by Crocus sativus cells were investigated，and their stabilities were also compared with those of pigments from saffron stigma.The results showed that they were all watersolubleand bright yellow.They were stable to food additives and H2O2.Compared with saffron stigma pigments，saffron pigments produced by cell culture were more stable to strong acid（pH 1），high temperature（80℃，100℃）and light（incandescent light，UV），and less stable to VCand Cu2+（0.001 mol/L）.The coloring power of saffron pigments produced by cell culture could be increased by dilute alkaline solutions（0.47 mol/L Na2CO3，0.1 mol/L NaOH），Na2SO3，F(xiàn)e2+（0.050 mol/L）and Fe3+.

Crocus sativus L.；saffron pigments；in vitro culture；stabilities

Q943.1

A

1672-3678（2015）02-0041-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.008

2014-04-08

扶文君（1990—），女，江蘇宜興人，碩士研究生，研究方向：植物細胞工程；袁麗紅（聯(lián)系人），教授，E-mail：yuanlihong@njtech.edu.cn