深海放線菌生淀粉酶基因的克隆表達及酶學(xué)特性研究

李麗珍，楊 鍵，田新朋，麥志茂，蘇宏飛，龍麗娟，張 偲

（1.中國科學(xué)院 南海海洋研究所 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東省海洋藥物重點實驗室，廣東 廣州 510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

深海放線菌生淀粉酶基因的克隆表達及酶學(xué)特性研究

李麗珍1，2，楊 鍵1，田新朋1，麥志茂1，2，蘇宏飛1，2，龍麗娟1，2，張 偲1，2

（1.中國科學(xué)院 南海海洋研究所 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東省海洋藥物重點實驗室，廣東 廣州 510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

從深海放線菌Streptomyces sp.SCSIO 03032基因組中擴增到1條含淀粉結(jié)合域的水解糖苷13家族基因amy032，該基因編碼氨基酸與已知蛋白一致性最高為67%。將amy032插入表達載體pET32a啟動子下游，構(gòu)建重組載體pET-amy。重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosseta（DE3）菌株中，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示目的基因成功實現(xiàn)異源表達。Ni-NTA對重組酶進行純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行表征。結(jié)果表明：重組淀粉酶AMY032的最適作用溫度為50℃，最適 pH為8.0，以可溶性淀粉為底物時的比酶活為（276±57）U/mg，Km為0.02g/L，Vmax為 70mg/（L·min）。Ca2+能提高該酶的催化活性，Ni2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+對該酶有抑制作用。AMY032對生玉米淀粉和生大米淀粉具有水解活性，其比酶活分別為（49±12）U/mg和（39±11）U/mg；掃描電鏡結(jié)果顯示AMY032使生玉米淀粉的表面產(chǎn)生明顯凹陷。

深海放線菌；基因組挖掘；有機物降解；淀粉結(jié)合域；克隆表達

生淀粉是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜而致密的有機大分子顆粒，其外層有水化層包裹，一般淀粉酶難以進入生淀粉內(nèi)部對其進行水解，所以生淀粉的糖化往往需要通過高溫蒸煮來破壞生淀粉顆粒的水化層結(jié)構(gòu)［1］。生淀粉酶對不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒表現(xiàn)出強水解活性［2］，可將傳統(tǒng)的淀粉糊化、液化、糖化工藝合并為一步直接糖化［3］。若將生淀粉酶應(yīng)用于無蒸煮的酒精發(fā)酵，總耗能可節(jié)約30%～40%［4］，因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度關(guān)注。

具有生淀粉降解活性的酶通常具有3個結(jié)構(gòu)域［5］：催化域（catalytic domain，CD）、淀粉結(jié)合域（starch-binding domain，SBD）和一段連接區(qū)域。淀粉結(jié)合域（SBD）對于生淀粉的酶解至關(guān)重要，一方面它使酶吸附到淀粉顆粒上從而有利于酶的水解作用，另一方面它本身就會破壞淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)從而促進酶解［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，沒有淀粉結(jié)合區(qū)域的葡萄糖淀粉酶對可溶性淀粉的水解速率不變，而對生淀粉顆粒的水解能力非常低［7］。目前為止，絕大多數(shù)生淀粉酶的來源是陸地微生物［8］，也有少量海洋細菌的α-淀粉酶被報道具有生淀粉降解活性，分別來自Bacillus sp.ALSHL3［9］和Bacillus aquimaris MKSC 6.2［10］。

以海洋動植物的有機體為主的大分子有機物（包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類）源源不斷地向沉積物中沉降，為沉積物中的異養(yǎng)微生物提供了充足的營養(yǎng)來源。出于攝食的需求，這些微生物往往首先要分泌出一系列水解酶類將顆粒有機物水解為可吸收的小分子物質(zhì)。因而海洋沉積環(huán)境來源的微生物具有生產(chǎn)高活性有機物水解酶的潛力。

筆者從1株深海放線菌Streptomyces sp.SCSIO 03032的全基因組序列中挖掘出1條具有CBM20家族淀粉結(jié)合域的新型α-淀粉酶基因amy032，其編碼的蛋白具有潛在水解生淀粉的能力，將該基因進行異源表達，并表征其酶學(xué)特性，以期為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海洋放線菌Streptomyces sp.SCSIO 03032（分離于3 412 m深的印度洋沉積物）、Escherichia coli Rosseta（DE3）、Escherichia coli DH5α，保藏于熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室；表達載體pET32a，Novagen公司；LA taq酶、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶，TaKaRa公司；膠回收試劑盒，OMEGA公司。3，5-二硝基水楊酸（DNS）等化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 Streptomyces sp.SCSIO 03032基因組 DNA的提取

有關(guān)DNA的提取方法參照文獻［11］進行。

1.3 α-淀粉酶基因amy032的克隆

Streptomyces sp.SCSIO 03032的淀粉酶基因序列已經(jīng)通過基因組測序獲得，使用生物信息學(xué)軟件Vector NTI進行引物設(shè)計，獲得上游引物5′-ATATGGATCCCTCACCGTCGCCGCCCCCGCCGCCCAGG-3′和下游引物5′-ATATCTCGAGGGTGCGCCAGACGTCGCTCAGGCTG-3′。使用所設(shè)計的上下游引物，以Streptomyces sp.SCSIO 03032基因組DNA為模板PCR擴增α-淀粉酶基因amy032，用限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切 α-淀粉酶基因amy032后，與經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切的表達載體pET32a進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上篩選克隆。進一步提取質(zhì)粒DNA，雙酶切驗證正確后命名重組質(zhì)粒為pET-amy。

1.4 重組菌株的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

將重組質(zhì)粒pET-amy轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta（DE3）中，接種至50mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，待OD600為0.6時，加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，28℃誘導(dǎo)10 h。9 000r/min離心10min，收集菌體，用10mL濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液重懸菌體，超聲破胞10min。12 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，上清即為AMY032的粗酶液。

1.5 α-淀粉酶的分離純化

粗酶液過鎳柱，用pH為8.0的5 mmol/L的咪唑溶液平衡柱子，加入酶液后再用5 mmol/L和20 mmol/L的咪唑溶液洗掉雜蛋白，最后用 500 mmol/L的咪唑溶液洗脫目的蛋白，收集到的洗脫液為純化后的酶液，用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行檢測。

1.6 α-淀粉酶AMY032酶活的測定

取50 μL稀釋一定倍數(shù)的純化重組酶AMY032，加入到450 μL 0.01g/L的淀粉溶液（Tris-HCl pH8.0）中，50℃水浴10min后，加入500 μLDNS溶液。沸水中反應(yīng)5min，室溫冷卻，分光光度計測量在545 nm下的吸光值。吸光值與不同含量的葡萄糖吸光度標準曲線圖做比較計算酶活。一個酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化等價于1 μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 溫度對酶活性的影響

在反應(yīng)溫度分別為20、30、40、50、60和70℃的條件下，測定不同溫度條件下的酶活。以酶活最高為100%，其余為相對酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

1.7.2 pH對酶活性的影響

用pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和11.0的緩沖液配制不同pH的0.01g/L可溶性淀粉溶液，測定相應(yīng)的酶活力。以酶活最高為100%，其余為相對酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

1.7.3 金屬離子對酶活性的影響

以不加金屬離子為對照，分別在酶液中加入5 mmol/L的 Ca2+、Na+、Ni2+、Ba2+、Mg2+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+處理，再加入1%質(zhì)量分數(shù)的可溶性淀粉反應(yīng)，測定酶活。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

1.7.4 降解生淀粉能力的比較

取50 μL稀釋一定倍數(shù)的純化重組酶AMY032，分別與0.01g/L生玉米淀粉、生大米粉、生紅薯粉和生木薯粉混合后，于50℃搖床、100r/min反應(yīng)20min，測定上清液中還原糖的量，計算酶的比酶活，并與可溶性淀粉對比。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

1.8 掃描電鏡表征

0.01g/L的生淀粉添加50 U的AMY032降解30min后，離心，沉淀后用無水乙醇洗滌3次，自然風(fēng)干。使用 Ion Sputter E 1010型離子濺射儀（Hitachi公司）在5.0 kV和20 mA的條件下對淀粉顆粒噴40 s，使顆粒表面鍍Pt。采用Hitachi S 4800型掃描電鏡（Hitachi公司）觀察和拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-淀粉酶基因amy032的核苷酸序列分析以及編碼產(chǎn)物AMY032的氨基酸序列分析

用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上的軟件如ORF Finder、BLAST對α-淀粉酶DNA序列進行分析發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶基因amy032的開放閱讀框由1 737個脫氧核苷酸組成。其中起始密碼子為GTG，終止密碼子為TGA，測序結(jié)果提交GenBank，基因登錄號為KJ577548。α-淀粉酶基因amy032編碼1個含579個氨基酸的蛋白質(zhì)。使用BLAST搜索GenBank數(shù)據(jù)庫，與AMY032催化功能域相似性最高的為灰黃鏈霉菌（Streptomyces flavogriseus）的假定水解糖苷酶蛋白，其氨基酸一致性為67%（圖1）。用組件結(jié)構(gòu)研究工具Pfam分析來源于海洋放線菌 Streptomyces sp.SCSIO 03032的 α-淀粉酶AMY032的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：自N端的1～39位氨基酸為信號肽，自N端的71～345位氨基酸為家族13水解糖苷酶的催化功能域，自N端第397～467位氨基酸為α-淀粉酶的C端β折疊域，自N端483～569位氨基酸為CBM20淀粉結(jié)合功能域。淀粉結(jié)合域在真菌生淀粉酶中非常常見，大多數(shù)真菌生淀粉酶的淀粉結(jié)合域都位于羧基端，但是米根霉的糖化酶的SBD是位于氨基端。真菌來源的糖化酶的SBD包括了大約100個氨基酸殘基，這個區(qū)域可能處于催化區(qū)域的后面，也可能是處在一個糖基化連接區(qū)域的后面。

2.2 α-淀粉酶基因amy032在大腸桿菌中的表達及重組酶的純化

筆者前期嘗試使用pET28a和pET22b對基因amy032進行表達，表達產(chǎn)物均以無活性的包涵體形式存在，pET32a表達載體在多克隆位點的上游添加315 bp的Trx標簽用于輔助蛋白折疊。重組質(zhì)粒pET-amy導(dǎo)入大腸桿菌后，重組細胞裂解液表現(xiàn)出淀粉酶活性。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明α-淀粉酶基因amy032在Escherichia coli Rosseta（DE3）中得到表達，在約7.5×104附近出現(xiàn)了明顯條帶，與預(yù)測的蛋白大小相符（包括Trx標簽1.0×104在內(nèi)）。粗酶液經(jīng)鎳柱親和層析純化后得到單一的電泳條帶（圖2），純度達95%以上，可用于酶學(xué)性質(zhì)分析。

圖2 重組菌株表達α-淀粉酶的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of amy032 expression in E.coli

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

考察溫度對AMY032酶活力的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：溫度為50℃時，酶活力最大。當溫度大于50℃時，酶活力下降較快。溫度達到70℃時，該酶僅存有20%酶活力。由此可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。

圖3 反應(yīng)溫度對AMY032酶活的影響Fig.3 Effects of temperature on activity of AMY032

考察pH對AMY032酶活力影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：當pH為8.0時，酶活力最高；當pH大于10.0時，酶活力僅有17%。由此可發(fā)現(xiàn)，該酶反應(yīng)的最適pH為8.0。

考察金屬離子對AMY032酶活力的影響，結(jié)果見表1。由表1可知：Ca2+對生淀粉酶有促進作用，Ni2+、Cu2+、Zn2+和 Mn2+對該酶有抑制作用，用金屬離子Ni2+處理酶液后，相對酶活只剩18%；Cu2+處理酶液后，相對酶活為34%；Zn2+處理酶液后，相對酶活僅剩 14%；Mn2+處理酶液后，酶活為24%。

圖4 pH對AMY032酶活的影響Fig.4 Effects of pH on the activity of AMY032

表1 金屬離子對AMY032酶活的影響Table 1 Effects of metal ions on enzyme activity of AMY032

以可溶性淀粉為底物，在pH8.0、溫度50℃的條件下取不同質(zhì)量濃度（ρS）的可溶性淀粉，測得反應(yīng)速率（V），得到1/V與1/ρS的關(guān)系，結(jié)果見圖5。由圖5雙倒數(shù)線結(jié)果計算重組淀粉酶AMY032對可溶性淀粉的Km值為0.02g/L，最大反應(yīng)速率（Vmax）為70.18mg/（L·min）。

圖5 淀粉酶AMY032 Km值的測定Fig.5 Linewear-Burk plots of AMY032

2.4 AMY032對生淀粉的水解

以不同的生淀粉為底物，測定AMY032對不同生淀粉的降解能力，結(jié)果見表2。由表2可知：生玉米淀粉和生大米粉對酶解作用敏感，其比酶活分別是（49±12）和（39±11）U/mg，但與陸地來源的生淀粉酶比較，AMY032對生淀粉的水解率還需要提高而與海洋來源的生淀粉酶 AmyP［17］（39.6±1.4）U/mg相比，AMY032具有良好的水解生淀粉能力。而生紅薯粉和生木薯粉對酶解作用不敏感。

表2 AMY032對不同生淀粉的降解活性Table 2 Degrading activities of AMY032 to various raw starch

圖6 AMY032水解生淀粉的SEM照片F(xiàn)ig.6 SEM images of untreated and treated raw corn starch granules with AMY032 by scanning electron microscopy

使用掃描電鏡觀察了AMY032降解生淀粉前后淀粉顆粒的變化情況，以未加入生淀粉酶為對照組，結(jié)果見圖6。由圖6可知：在50℃反應(yīng)20min后淀粉顆粒表面致密光滑（圖6（a）），而反應(yīng)組中經(jīng)過重組淀粉酶AMY032處理后的生玉米淀粉顆粒表面出現(xiàn)許多細密的孔洞（圖 6（b）），說明AMY032能有效破壞生玉米淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)并釋放還原糖。目前，很多來自陸地的具有生淀粉降解能力的α-淀粉酶被廣泛的研究，龐宗文等［13］報道從土壤中分離到4株具有生淀粉分解酶活性的根霉，其中Rhiizous sp.2和Rhiizous sp.3的生淀粉分解酶活性最高，分別為每克干曲520 U和405 U。郭愛蓮等［14］報道從自然界分離到1株高酶活的生淀粉糖化酶菌株黑曲霉Sx，在最適產(chǎn)酶條件下酶活達到382 U/g。丁立孝等［15］報道從23份土樣中篩選出105株野生型霉菌，其中有10株具有較高的糖化生淀粉的能力。AMY032對不同生淀粉的降解能力存在差異，主要是因為不同植物來源的天然生淀粉對生淀粉酶的敏感性差異很大，淀粉顆粒的大小、表面特性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)都成為影響因素［16］。一般來說，谷物來源的淀粉較其他來源的淀粉容易被降解［17］。

3 結(jié)論

克隆到來源于印度洋 Streptomyces sp.SCSIO 03032的α-淀粉酶基因，并檢測到純化的α-淀粉酶具有生淀粉的降解能力，測定最適溫度為50℃，最適pH為8.0。AMY032對生玉米淀粉具有水解活性，其比酶活為（49±12）U/mg，AMY032的成熟肽中有非常重要的兩部分，一是自N端的第71～345位氨基酸為家族13水解糖苷酶的催化功能域，二是自N端第483～569位氨基酸為CBM20淀粉結(jié)合功能域。

基于氨基酸相似性，CBM分成了42個家族，在CAZy的分類中，CBM中有六類是SBD家族，分別是CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34和CBM41。筆者研究的生淀粉酶AMY032的羧基端含有約100個氨基酸的CBM20類淀粉結(jié)合域，這段淀粉結(jié)合域很可能對AMY032水解生淀粉的能力有重要貢獻，因而有必要對羧基端的氨基酸功能進行深入研究。

［1］Robertson G H，Wong D W，Lee C C，et al.Native or raw starch digestion：a key step in energy efficient biorefining of grain［J］.J Agric Food Chem，2006，54（2）：353-65.

［2］Kaneko T，Ohno T，Ohisa N.Purification and characterization of a thermostable raw starth digesting amylase from a Streptomyces sp. isolated in a milling factory［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2005，69（6）：1073-1081.

［3］Matsubara T，Ben A Y，Anindyawati T，et al.Degradation of raw starch granulesby alpha-amylasepurified from culture of Aspergillus awamori KT-11［J］.J Biochem Mol Biol，2004，37（4）：422-8.

［4］謝慧玲，阮森林，劉亮偉，等.酸性生淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（10）：85-87.

［5］Sauer J，Sigurskjold B W，Christensen U，et al.Glucoamylase：structure/function relationships，and protein engineering［J］. Biochim Biophys Acta，2000，1543（2）：275-293.

［6］Penninga D，van der Veen B A，Knegtel R M，et al.The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251［J］.J Biol Chem，1996，271（51）：32777-32784.

［7］Southalla S M，Simpson P J，Gilbert H J，et al.The starch-binding domain from glucoamylase disrupts the structure of starch［J］. FEBS Lett，1996，447（1）：58-60.

［8］Sun H，Zhao P，Ge X，et al.Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010，160（4）：988-1003.

［9］Vidilaseris K，Hidayat K，Retnoningrum D S，et al.Biochemical characterization of a raw starch degrading α-amylase from the Indonesian marine bacterium Bacillus sp.ALSHL3［J］.Biologia，2009，64（6）：1047-1052.

［10］Puspasari F，Nurachman Z，Noer A S，et al.Characteristics of raw starch degrading α-amylase from Bacillus aquimaris MKSC 6.2 associated with soft coral Sinularia sp.［J］.Starch-St?rke，2011，63（8）：461-467.

［11］薩姆布魯克J，魯塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

［12］彭惠，雷寅，劉源濤，等.海洋環(huán)境來源的淀粉酶AmyP對生玉米淀粉的降解特性［J］.中國生物工程雜志，2012，32（7）：79-83.

［13］龐宗文，梁靜娟，陳桂光.生淀粉分解酶產(chǎn)生菌的分離篩選［J］.中國釀造，1997（3）：10-11.

［14］郭愛蓮，郭延巍，楊琳，等.生淀粉糖化酶的菌種篩選及酶學(xué)研究［J］.食品科學(xué)，2001，22（10）：45-48.

［15］丁立孝，顧軍，倪新江，等.無蒸煮生淀粉糖化酶霉菌的選育［J］.食品科學(xué)，2002，23（2）：78-80.

［16］Wang W J，Powell A D，Oates C G.Pattern of enzyme hydrolysis in raw sago starch：effects of processing history［J］.Carbohydr Polym，1995，26（2）：91-97.

［17］Li J H，Vasanthan T，Hoover R，et al.Starch from hull-less barley：V.in-vitro susceptibility of waxy，normal，and high-amylose starches towards hydrolysis by alpha-amylases and amyloglucosidase［J］.Food Chem，2004，84（4）：621-632.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Cloning，expression and characterization of raw amylase gene fromdeep-sea actinomycete

LI Lizhen1，2，YANG Jian1，TIAN Xinpeng1，MAI Zhimao1，2，SUN Hongfei1，2，LONG Lijuan1，2，ZHANG Si1，2
（1.Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica，CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

The glycoside hydrolase family 13 gene amy032，deduced amino acid sequence of which exhibited highest identity of 67%with known protein in GenBank，was amplified from a deep sea strain Streptomyces sp.SCSIO 03032.The mature gene was inserted into pET32a under T7 promoter. Recombinant vector was transformed in Escherichia coli Rosetta（DE3）cells，and SDS-PAGE analysis results showed that the amylase gene was successfully expressed.Enzyme AMY032 was then purified by nickel-affinity chromatography and characterized.The optimum temperature of the purified enzyme was 50℃，and optimum pH 8.0.With soluble starch as substrate，specific activity was（276±57）U/mg，Kmwas 0.02g/L and Vmaxwas 70mg/（L·min）.The catalytic activity of the enzyme was slightly improved by Ca2+and restrained by Ni2+，Cu2+，Zn2+and Mn2+.AMY032 could hydrolyze raw corn starch and raw rice starch，with specific activity of（49±12）U/mg and（39±11）U/mg，respectively.Scanning electron microscope showed AMY032 generate obviously dents on raw corn starch surface.

deep-sea actinomycete；genome mining；organic matter degradation；starch-binding domain；cloning and expression

Q93；TQ925.1

A

1672-3678（2015）02-0035-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.007

2014-04-02

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA092104）；國家自然科學(xué)基金重點項目（41230962）；國家海洋公益專項（201305018）；廣東海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目（GD2012-D01-002）；中國科學(xué)院重點部署項目（KSCX2-EW-B-13）

李麗珍（1989—），女，廣東汕頭人，碩士研究生，研究方向：海洋生物學(xué)；張偲（聯(lián)系人），研究員，E-mail：zhsimd@scsio.ac.cn