產(chǎn)花生四烯酸油脂高山被孢霉干法造粒提油及菌粕的重復(fù)利用

商靜生，紀(jì)曉俊，聶志奎，張璦琿，顏佳鋮，張 鑫，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

產(chǎn)花生四烯酸油脂高山被孢霉干法造粒提油及菌粕的重復(fù)利用

商靜生，紀(jì)曉俊，聶志奎，張璦琿，顏佳鋮，張 鑫，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

對(duì)高產(chǎn)花生四烯酸油脂高山被孢霉干法造粒提油工藝中3個(gè)參數(shù)及菌粕重復(fù)利用進(jìn)行研究。設(shè)計(jì)三因素四水平L16（43）正交試驗(yàn)，考察造粒直徑、正己烷與菌粕的比例、萃取時(shí)間對(duì)提油效率及正己烷回收率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)含水率20%～25%、造粒直徑1.2mm、正己烷的體積與顆粒的質(zhì)量比20∶1 L/g、萃取時(shí)間5 h時(shí)，每克干菌體油脂得率0.559 4g，正己烷的回收率達(dá)90%。與均質(zhì)濕法提油相比，分別提高了17.35%和83.67%。用堿性蛋白酶及復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶和堿性蛋白酶）處理菌粕，以50%替代氮源（酵母膏）添加到培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期分別為10 d和7 d。此時(shí)，生物量、油脂產(chǎn)量、花生四烯酸產(chǎn)量都達(dá)到了最大值，分別為30.33g/L、16.25g/L、8.59g/L（堿性蛋白酶處理）；29.77g/L、16.89g/L、7.12g/L（復(fù)合酶處理）。其中，復(fù)合酶處理菌粕的生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)4.253g/（L·d）、2.413g/（L·d）和1.017g/（L·d），與堿性蛋白酶處理相比，其生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了40.22%、48.49%和18.39%。干法造粒提油是有效的，且酶法處理菌粕的方法有應(yīng)用前景。

花生四烯酸；高山被孢霉；干法造粒；菌粕；生產(chǎn)強(qiáng)度

花生四烯酸（5，8，11，14-二十碳四烯酸，arachidonic acid，ARA）屬于ω-6系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs），是人體中分布最廣、含量最高和最活躍的一種必需 PUFAs［1］，具有多種生物活性。它是嬰幼兒成長(zhǎng)過(guò)程中大腦和視神經(jīng)發(fā)育不可缺少的物質(zhì)，因此成為配方奶粉中的重要成分［2］；同時(shí)也被批準(zhǔn)作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用于特殊膳食及調(diào)制乳粉中或作為新資源應(yīng)用于食品中。另外，它還是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類(lèi)等類(lèi)二十烷酸的直接前體［3］。所以，ARA在促進(jìn)智力發(fā)育、提高人體視力、降低血脂、增強(qiáng)免疫力和抗癌等方面具有重要作用［4］，在生物醫(yī)藥、化妝品、功能性食品和保健品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用［5-6］。

ARA的傳統(tǒng)來(lái)源是動(dòng)物肝臟、豬腎上腺素及蛋黃［7］，但動(dòng)物組織中的ARA含量較低，無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求［8］。目前，ARA的生產(chǎn)主要采用高山被孢霉發(fā)酵，而國(guó)內(nèi)外圍繞這方面的研究則主要集中在菌種選育［9］、發(fā)酵調(diào)控［10］和油脂提?。?1］等方面。

傳統(tǒng)的微生物油脂提取采取濕法提油和干法造粒提法，其中，濕法提油法又分為均質(zhì)提油或酶解提油這兩種方法，兩者的主要區(qū)別是破壁的方式不同。均質(zhì)提油使用膠體磨和高壓均質(zhì)機(jī)破壁，酶解提油采用一定濃度的酶解液破壁，兩種提油方式在油脂提取過(guò)程中都需要加入水分和乙醇來(lái)提高萃取劑（正己烷）的提油效率。此方法不僅加大了溶劑的消耗，同時(shí)需要高攪拌功率和大體積萃取罐，加大了設(shè)備和成本投入。而干法造粒提油在提油前菌體需要干燥到很低的含水量，可在體積較小的萃取罐中操作。

高山被孢霉作為一種產(chǎn)油微生物，在萃取得到微生物油脂后，剩余大多數(shù)的菌渣，是微生物細(xì)胞及結(jié)構(gòu)的成分，其富含豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物及少量幾丁質(zhì)微纖維。在全球提倡廢棄物充分合理利用的情況下，高山被孢霉菌渣如何合理高效利用是亟待解決的問(wèn)題。合適的提油方法和菌渣再利用研究是解決此問(wèn)題的關(guān)鍵。高壓均質(zhì)提油和酶解提油得到的菌渣呈現(xiàn)流體狀，殘留大量有機(jī)溶劑且不易去除［12］，沒(méi)有太大的應(yīng)用價(jià)值或再應(yīng)用范圍存在局限性，一般作為廢棄物被填埋，這不僅是對(duì)資源的極大浪費(fèi)，而且還會(huì)引起污染——環(huán)境富營(yíng)養(yǎng)化。干法造粒提油在提油階段不需要水的參與，是有機(jī)溶劑與破壁造粒菌體直接接觸［13］，提油后菌渣呈顆粒狀，對(duì)菌渣進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，即可將殘留有機(jī)溶劑去除，可用于飼料或酶解處理［14］后替代高山被孢霉發(fā)酵所用的昂貴酵母膏，不僅節(jié)約了生產(chǎn)成本，同時(shí)有效利用了資源。因此，本文筆者利用干法造粒提油法來(lái)處理高山被孢霉，考察相關(guān)的工藝參數(shù)及菌渣的重復(fù)利用，為綜合利用高山被孢霉菌渣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：高山被孢霉（Mortierella alpina）R807［15］。在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期2012年4月23日，保藏編號(hào)為CCTCC M 2012118。

酶制劑：堿性蛋白酶（200 U/mg），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；纖維素酶（＞750 U/mg）、果膠酶（＞99%），BIOSHARP公司。

試劑：葡萄糖（AR）、瓊脂（BR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母膏（工業(yè)級(jí)），安琪酵母股份有限公司；玉米漿（工業(yè)級(jí)），靖江市陳氏工貿(mào)發(fā)展有限公司；NaNO3（AR），西隴化工股份有限公司；KH2PO4（AR）、MgSO4·7H2O（AR），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂25g，定容到1 000mL。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，玉米漿10，酵母膏2，KH2PO42。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 80，酵母膏 10，NaNO33，KH2PO44，MgSO4.7H2O 0.5。

1.3 培養(yǎng)方法

種子接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，25℃下培養(yǎng)5～7 d。

液體培養(yǎng)基活化 菌株從斜面接入裝液量為20%的250mL的凹槽搖瓶中，25℃下培養(yǎng)2 d。轉(zhuǎn)接入裝液量為20%的500mL凹槽種子搖瓶中，25℃下培養(yǎng)1 d。

發(fā)酵培養(yǎng) 將活化好的種子以10%的接種量接入500mL的凹槽搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基為用酶解菌粕以0%～100%的質(zhì)量比替代原始培養(yǎng)基中的酵母膏。

1.4 分析方法

葡萄糖濃度的測(cè)定 利用SBA-40C型生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量濃度。

菌絲體干質(zhì)量（生物量）的測(cè)定 量取一定體積的發(fā)酵液（V），加入等量的蒸餾水，將混合物抽濾，并用蒸餾水洗滌3次，65℃下烘至恒質(zhì)量（含水量在4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）以下），稱(chēng)質(zhì)量（m）。

生物量的計(jì)算見(jiàn)式（1）。

式中：W為生物量（g/L）；m為干菌體質(zhì)量（g）；V為發(fā)酵液體積（L）。

生物量的生產(chǎn)強(qiáng)度計(jì)算見(jiàn)式（2）。

式中：q為生物量的生產(chǎn)強(qiáng)度（g/（L·d））；t為發(fā)酵時(shí)間（d）。

油脂的測(cè)定 稱(chēng)取1g干菌體，加入50mL石油醚，抽提3 h，利用SZF-06GI型粗脂肪測(cè)定儀測(cè)定。

ARA含量測(cè)定［16］稱(chēng)取0.1g干菌體于2mL的離心管中，加入1.5mL色譜純正己烷和0.2mL 4 mol/L的KOH-甲醇溶液，振蕩混勻，靜置12min。5 000r/min下離心5min，取0.3mL上清液于1.5mL的離心管中，加入0.5mL去離子水搖勻，5 000r/min下離心3min。取上清液0.08mL于2mL的離心管中，加入0.8mL色譜純正己烷和少量的無(wú)水Na2SO4（吸水作用），取1 μL進(jìn)樣。

ARA質(zhì)量濃度的計(jì)算見(jiàn)式（3）。

式中：H為ARA的質(zhì)量濃度（g/L）；A為ARA在油脂中的含量（%）；Y為油脂的質(zhì)量濃度（g/L）。

ARA生產(chǎn)強(qiáng)度的計(jì)算見(jiàn)式（4）。

式中，X為ARA的生產(chǎn)強(qiáng)度（g/（L·d））。

1.5 菌粕預(yù)處理

單一堿性蛋白酶處理：稱(chēng)取一定質(zhì)量的菌粕，用去離子水稀釋10倍，調(diào)節(jié)pH為9.3～9.7之間，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的堿性蛋白酶，60℃、170r/min下酶解3 h，備用。

混合酶處理：稱(chēng)取一定質(zhì)量的菌粕，用去離子水稀釋10倍，調(diào)節(jié)pH為4.3～4.7之間。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的纖維素酶和3%的果膠酶，50℃、170r/min下恒溫酶解5 h。調(diào)節(jié)pH為9.3～9.7，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的堿性蛋白酶，60℃、170r/min下酶解3 h，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 干法造粒提油工藝的研究

圖1是干法造粒提油工藝。在60℃下發(fā)酵液經(jīng)巴斯德滅菌滅活脂肪酶，降低脂肪酸的氧化。經(jīng)板框過(guò)濾、水洗干燥去除菌體中的水分。粉碎機(jī)破壁，加入極少量的水造粒，可使顆粒成型。萃取劑（正己烷）萃取，真空蒸餾得到毛油，剩余的菌渣中含有豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物，可用作飼料或處理后添加到培養(yǎng)基中。

圖1 干法造粒提油工藝流程Fig.1 Dry granulation oil extraction process

干法提油過(guò)程中首先應(yīng)控制粉碎菌渣的含水量，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)含水率為20%～25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，可得到顆粒均勻、分散良好的菌粒。其次是對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)中重要參數(shù)的研究，比如造粒直徑、萃取劑添加量和萃取時(shí)間對(duì)提油效率和正己烷回收率的影響。

2.2 干法造粒提油參數(shù)的研究

通過(guò)L16（43）正交試驗(yàn)來(lái)考察造粒直徑、正己烷的添加量、萃取時(shí)間對(duì)單位干菌體油脂得率和正己烷回收率的影響，相關(guān)因素的水平設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。以單位干菌體得率為優(yōu)化目標(biāo)的直觀分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design and results of L16（43）orthogonal experiment

表2 以單位干菌體得率為優(yōu)化目標(biāo)的直觀分析Table 2 Range analysis of orthogonal experimental results on yeild of per gram dry biomass

菌粒直徑大小直接影響正己烷與菌體接觸面積和浸潤(rùn)程度。提油過(guò)程中，無(wú)需攪拌，若菌粒直徑太小，顆粒之間的縫隙較小，無(wú)法與正己烷完全接觸，同時(shí)影響菌粒形狀，成型的顆粒經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間浸泡后松散；菌粒太大，減弱正己烷在菌粒中的傳質(zhì)。隨著正己烷添加量的增加和萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，傳質(zhì)動(dòng)力提高，增加單位干菌體的油脂得率，但會(huì)降低正己烷的回收率，增加成本。綜合表1和表2數(shù)據(jù)可知：當(dāng)顆粒直徑1.2mm、正己烷的添加量100mL、萃取時(shí)間5 h時(shí)，正己烷的回收率和單位干菌體的油脂得率最大，分別為90%和0.559 4g。與均質(zhì)提油的49%和0.476 7g（本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)）相比，提高了83.67%和17.35%。

2.3 菌粕替代發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究

2.3.1 不同菌粕添加比例對(duì)發(fā)酵的影響

為了得到最優(yōu)的菌粕添加比例，將酶解的菌粕以10%～100%的比例替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母膏，考察發(fā)酵結(jié)束后生物量、油脂含量和ARA的濃度。圖2是兩種不同酶解方法下的發(fā)酵數(shù)據(jù)。由圖2可知：隨著菌粕添加比例的增加，生物量、油脂濃度和ARA濃度呈不規(guī)則變化，分析原因可能是菌粕未被完全利用及菌粕中殘?jiān)挠绊?。在菌粕添加比例?0%時(shí)，兩者生物量、油脂濃度和ARA的濃度都達(dá)到最大值，分別為 30.33g/L、16.25g/L、8.59g/L及 29.77g/L、16.89g/L、7.12g/L，發(fā)酵周期為10 d和7 d。酶解菌粕中的殘?jiān)暗春坑绊懥司w的代謝速率，較之堿性蛋白酶，復(fù)合酶酶解得徹底，殘?jiān)枯^少，繼而發(fā)酵周期縮短。較小添加比例，氮源不足；較大添加比例，殘?jiān)^多，使不同的添加比例出現(xiàn)不同的發(fā)酵結(jié)果。

圖2 兩種酶解菌粕的不同添加比例對(duì)生物量、油脂濃度及ARA質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effects of different proportion of fungal residues hydrolyzed by two methods on biomass，lipids and ARA

2.3.2 酶解方法對(duì)發(fā)酵強(qiáng)度的影響

菌粕中主要成分為蛋白質(zhì)類(lèi)化合物及少量纖維素等，部分物質(zhì)在水中較難溶解。作為氮源直接添加到培養(yǎng)基中，會(huì)降低其利用率或無(wú)法被利用。本實(shí)驗(yàn)中，筆者研究了兩種酶解方法——單一堿性蛋白酶水解和復(fù)合酶水解對(duì)生物量、油脂濃度和ARA濃度的影響。圖3是酶解方式對(duì)生物量生產(chǎn)強(qiáng)度、油脂生產(chǎn)強(qiáng)度和ARA生產(chǎn)強(qiáng)度的影響結(jié)果。由圖3可知：任何添加比例下，復(fù)合酶酶解的發(fā)酵強(qiáng)度高于單一堿性蛋白酶酶解。生物量、油脂和ARA的最高生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá) 4.253g/（L·d）、2.413g/（L·d）和1.017g/（L·d）。與堿性蛋白酶相比，分別提高了40.22%、48.49%和18.39%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)高山被孢霉干法造粒提油工藝和菌粕利用的研究，發(fā)現(xiàn)此循環(huán)工藝是可行的。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：造粒直徑為1.2mm、正己烷的體積與顆粒的質(zhì)量比為20∶1、萃取時(shí)間為5 h，單位干菌體可得油脂0.559 4g，正己烷的回收率可達(dá)90%，分別提高了17.35%和83.67%。堿性蛋白酶及纖維素酶、果膠酶、堿性蛋白酶復(fù)合酶前處理干菌體，以一定的比例替代氮源（酵母膏），兩種處理方式下的發(fā)酵周期分別為10 d和7 d，當(dāng)添加的比例為50%時(shí)，生物量、油脂含量和ARA含量都達(dá)到最大值，分別為30.33g/L、16.25g/L和8.59g/L；29.77g/L、16.89g/L和7.12g/L。而復(fù)合酶處理菌渣發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度最大，分別為 4.253、2.413和 1.017g/（L·d）。本研究只對(duì)干法提油工藝參數(shù)中的3種情況進(jìn)行了優(yōu)化，而干燥溫度、顆粒形態(tài)及不同溶劑這些影響條件也值得進(jìn)一步研究。

圖3 酶解方法對(duì)發(fā)酵強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of different enzymatic methods on producvitity of fermentation

［1］Ji X J，Ren L J，Nie Z K，et al.Fungal arachidonic acid-rich oil：research，development and indstrialization［J］.Crit Rev Biotechnol，2014，34（3）：197-214.

［2］Birch E E，Garfield S，Hoffman D R，et al.A randomized controlled trial of early dietary supply of long-chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants［J］.Dev Med Child Neurol，2000，42（3）：174-181.

［3］Singh G，Chandra R K.Biochemical and cellular effects of fish and fish oils［J］.Prog Food Nutr Sci，1988，12（4）：371-419.

［4］Gill I，Valivtry R.Polyunsaturated fatty acid：part 1.occurrence，biological activities and applications［J］.Trends Biotechnol，1997，15：401-409.

［5］汪志明.花生四烯酸的生產(chǎn)及應(yīng)用［J］.中國(guó)食品添加劑，2001（1）：30-33.

［6］周正雄，盧英華，班甲，等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸油脂的研究進(jìn)展［J］.生物加工過(guò)程，2013，11（4）：72-78.

［7］Bajpai P K，Bajpai P，Ward O P.Production of arachidonic acid byMortierella alpina ATCC 32222［J］.JInd Microbiol Biotechnol，1991，8（3）：179-186.

［8］Chen H，Chang C，Chen C.Optimization of arachidonic acid production by Mortierella alpina Wuji-H4 isolate［J］.J Am Oil Chem Soc，1997，74（5）：569-578.

［9］Liu X，Zhang H M，Ji X J，et al.An improved sampling protocol for analysis of intracellular metabolites in Mortierella alpina［J］. Biotechnol Lett，2012，34（12）：2275-2282.

［10］Peng C，Huang H，Jing M J，et al.Optimization of medium components for biomass and arachidonic acid production by Mortierella alpina ME-1 using response surface methodology［J］. Food Sci，2009，30（13）：205-211.

［11］Nisha A，Udaya Sankar K，Venkateswaran G.Supercritical CO2 extraction of Mortierella alpina single cell oil：comparison with organic solvent extraction［J］.Food Chem，2012，133（1）：220-226.

［12］You J Y，Peng C，Liu X，et al.Enzymatic hydrolysis and extraction of arachidonic acid rich lipids from Mortierella alpina［J］. Bioresour Technol，2011，102（10）：6088-6094.

［13］Zhu M，Zhou P P，Yu L J.Extraction of lipids from Mortierella alpina and enrichment of arachidonic acid from the fungal lipids［J］.Bioresour Technol，2002，84（1）：93-95.

［14］Zheng H L，Gao Z，Ji X J，et al.Lipid production of Chlorella vulgaris from lipid-extracted microalgal biomass residues through two-step enzymatic hydrolysis［J］.Bioresour Technol，2012，117：1-6.

［15］叢蕾蕾，紀(jì)曉俊，聶志奎，等.花生四烯酸油脂高產(chǎn)菌株的選育［J］.生物加工過(guò)程，2012，10（5）：34-38.

［16］鄧中濤，紀(jì)曉俊，聶志奎，等.高山被孢霉三階段培養(yǎng)法高效生產(chǎn)花生四烯酸油脂工藝研究［J］.生物加工過(guò)程，2013，11（4）：8-13.

（責(zé)任編輯 荀志金）

Extraction of lipids from arachidonic acid-rich oil producing Mortierella alpina with dry granulation and reusing fungal residues

SHANG Jingsheng，JI Xiaojun，NIE Zhikui，ZHANG Aihui，YAN Jiacheng，ZHANG Xin，HANG He
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210009，China）

Extracting lipids from arachidonic acid-rich oil producing Mortierella alpina with dry granulation and fungal residues reuse methods were developed.The effects of three parameters，including fungal particle diameter，proportion of n-hexane-to-fungal residues and extraction time，on the lipid extraction efficiency and n-hexane recovery rate were investigated through L16（43）orthogonal experiment. When the moisture content of fungal particles was between 20%and 25%，with the aforementimed three parameters being 1.2mm，20∶1 L/g and 5 h，respectively，the lipid and n-hexane recovery yield reached 0.559 4g/g dry biomass and 90%，increased by 17.35%and 83.67%，comparing with the traditionally used homogeneous wet extraction method.Pretreating with alcalase and complex enzyme including cellulose，pectinase and alcalase，fungal residues could be resued to replace the nitrogen source partly forthe growth of M.alpina.When 50%proportion of fungal residues were added into the medium，the fermentation time was 10 d with alcalase pretreatment and 7 d with complex enzyme pretreatment.At the same time，biomass，lipid and ARA content reached 30.33g/L，16.25g/L，8.59g/L（alcalase pretreatment），and 29.77g/L，16.89g/L and 7.12g/L（complex enzymatic pretreatment），respectively. The productivity of fungal residues pretreated with compound enzyme could reach 4.253，2.413 and 1.017g/（L·d），respectively.Comparing with pretreating by alcalase，the productivity increased by 40.22%，48.49%and 18.39%，respectively.Extraction with dry grandation is effective and pretreatment of fungal residue with enzyme is also promising.

arachidonic acid；Mortierella alpina；dry granulation；fungal residues；productivity

TS224.4；Q815

A

1672-3678（2015）02-0024-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.005

2014-03-07

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2014AA021703）；國(guó)家自然科學(xué)基金（21376002、21476111）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131405）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

商靜生（1987—），男，河北保定人，碩士研究生，研究方向：生物化工；紀(jì)曉俊（聯(lián)系人），副教授，E-mail：xiaojunji@njtech.edu.cn