嗜酸乳桿菌不同成分體外抗TGEV作用的研究

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嗜酸乳桿菌不同成分體外抗TGEV作用的研究

魏萍，劉冠群，賈國東，趙毅博，夏璐

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：文章探討嗜酸性乳桿菌不同成分在抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）中的作用，并分析益生菌抗病毒可能存在的機(jī)制。試驗(yàn)分離嗜酸乳桿菌不同成分和TGEV氨肽酶受體抑制劑Bestatin，按照感染后處理組、處理后感染組和同時(shí)感染處理組試驗(yàn)。采用MTT法，在豬睪丸細(xì)胞（ST）上評(píng)價(jià)各成分對(duì)TGEV抑制作用。在Bestatin封閉ST細(xì)胞基礎(chǔ)上添加S-層蛋白，研究二者聯(lián)合作用。結(jié)果表明，抑制率大小順序：S-層蛋白>菌體>脫S-層蛋白菌體>代謝產(chǎn)物>牛血清白蛋白。S-層蛋白對(duì)TGEV抑制作用與Bestatin相當(dāng)。由此可知，嗜酸乳桿菌S-層蛋白對(duì)TGEV 在ST細(xì)胞上的復(fù)制有抑制作用。氨肽酶抑制劑Bestatin預(yù)先處理ST細(xì)胞對(duì)S-層蛋白抑制TGEV的感染具有協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：嗜酸乳桿菌；S-層蛋白；抗病毒

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-3-13 15:21:00

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150313.1521.002.html

魏萍,劉冠群,賈國東,等.嗜酸乳桿菌不同成分體外抗TGEV作用的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(3): 59-66.

仔豬病毒性腹瀉是豬場(chǎng)常發(fā)且危害嚴(yán)重的一類傳染病，目前尚無有效預(yù)防該類疾病的商品化藥物。多種益生菌可以抑制細(xì)菌性腹瀉且部分益生菌具有抗病毒作用，同時(shí)具有安全可靠、增加營養(yǎng)物質(zhì)吸收、增強(qiáng)粘膜屏障、提高免疫力等優(yōu)點(diǎn)[1]。這些益生菌在抗病毒過程中，其多種成分可發(fā)揮抗病毒作用[2]。其中，存在于某些益生菌菌株表面的S-層蛋白有較強(qiáng)抗病毒能力[3]。Martínez等研究表明S-層蛋白可與樹突狀細(xì)胞受體結(jié)合而抑制病毒感染[4]。對(duì)益生菌的抗病毒研究很多，但其抗病毒機(jī)制研究較少。本文旨在篩選出抗傳染性胃腸類（TGEV）且具有S-層蛋白的益生菌菌株，探究S-層蛋白的抗病毒機(jī)制。為進(jìn)一步研究益生菌抗病毒機(jī)制和研發(fā)抗病毒益生菌制劑奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

一株嗜酸乳桿菌（La-A），用LAC表示，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；MRS培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜（DMSO）、LiCl、牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；豬睪丸細(xì)胞（ST）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）TO163株，由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1嗜酸乳桿菌S-層蛋白鑒定

1.2.1.1嗜酸乳桿菌S-層蛋白提取及SDS-PAGE檢測(cè)

按照Karen等酸性LiCl方法制備S-層蛋白[5]。按1%接種量在MRS培養(yǎng)基中加入菌種，37℃恒溫過夜培養(yǎng)。去培養(yǎng)物于4℃，5 000 r·min-1離心5 min。PBS洗滌菌體兩次。菌體用5 mol·L-1LiCl懸起，室溫處理30 min。4℃，12 000 r·min-1，離心10 min，保留上清。將上清液轉(zhuǎn)移至透析袋中，在50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）溶液中，4℃透析24 h，每12 h換1次透析液。利用PEG 20000對(duì)樣本適量濃縮。收集透析袋中液體轉(zhuǎn)移至EP管中。4℃，12 000 r·min-1，離心10 min，保留上清。測(cè)定所提取的蛋白濃度并做SDS-PAGE，測(cè)定蛋白分子質(zhì)量。

1.2.1.2嗜酸乳桿菌Slp基因提取

將培養(yǎng)好的嗜酸乳桿菌按照Vilgalys介紹方法提取DNA[6]，并略有改進(jìn)，具體步驟如下：取1.5 mL新鮮培養(yǎng)物，4℃、12 000 r·min-1離心5 min。棄上清，加200 μL裂解液，再加溶菌酶和蛋白酶K，56℃溫浴1.5 h。加66 μL 5 mol·L-1NaCl，12 000 r·min-1離心10 min。取上清加等體積酚，靜止3 min，12 000 r·min-1離心10 min。再取上清加等體積氯仿異戊醇混合液靜止5 min，12 000 r·min-1離心10 min。取上清重復(fù)步驟4、5。取上清加0.6倍體積的異丙醇室溫靜止10 min后12 000 r·min-1離心10 min。棄上清加400 μL的75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r·min-1離心10 min。室溫靜止待乙醇揮發(fā)盡。加50 μL TE緩沖液懸起沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank已發(fā)表的SlpA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，由大連寶生物公司合成，具體序列為：PF：5' GAATYGTKAGCGCTSCTGCTGC 3'；PR：5' GTAAACGTAWGCGTTGTGCTTC 3'，目的基因大小為1 200 bp。95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2嗜酸乳桿菌各成分的提取

取生長對(duì)數(shù)期的嗜酸乳桿菌，細(xì)菌數(shù)目為108cfu·mL-1。菌體：將處理好的菌液3 000 r·min-1離心10 min，取沉淀；S-層蛋白：按照1.2.1.1提取S-層蛋白；脫S-層蛋白菌體的處理：將菌液按照1.2.1.1方法，收集菌體，即得到脫S-層蛋白的菌體；代謝產(chǎn)物：將處理好的菌液12 000 r·min-1離心10 min，取上清，用0.22 μm濾器過濾，收集濾液；牛血清白蛋白：將牛血清白蛋白，按S-層蛋白各稀釋度等濃度配置。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)Bestatin的最大試驗(yàn)濃度為8.0 mg·mL-1。

1.2.3嗜酸乳桿菌各成分細(xì)胞毒性測(cè)定

分別將各濃度嗜酸乳桿菌體、脫S-層蛋白的菌體、代謝產(chǎn)物、S-層蛋白、牛血清白蛋白、Bestatin加入已長成單層的96孔培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2中培養(yǎng)90 min后洗滌，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)。按時(shí)觀察CPE情況，當(dāng)病毒對(duì)照組CPE出現(xiàn)+++和++++時(shí)，用MTT法測(cè)定其OD570值，通過細(xì)胞存活率計(jì)算，選擇各組成分最大無毒劑量。

1.2.4嗜酸乳桿菌不同成分對(duì)TGEV在ST上增殖的影響

將各濃度菌體稀釋液、脫S-層蛋白菌體稀釋液、菌代謝上清稀釋液、S-層蛋白稀釋液、牛血清白蛋白稀釋液、Bestatin稀釋液。牛血清白蛋白與S-層蛋白等濃度處理。按照下面3種處理方式接入細(xì)胞。設(shè)置病毒對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組。

試驗(yàn)分3種處理如下：①各成分預(yù)先處理細(xì)胞后在攻毒（處理后感染組）：將每個(gè)試驗(yàn)組成分以0.1 mL量分別孵育細(xì)胞90 min，洗滌，以100 TCID50·0.1 mL的病毒量接入細(xì)胞，置37℃、5% CO2培養(yǎng)90 min，洗滌，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。②病毒感染細(xì)胞后接入各成分（感染后處理組）：以100 TCID50·0.1 mL的病毒量接入細(xì)胞，置37℃、5% CO2溫箱，孵育90 min后洗滌，再加入每個(gè)試驗(yàn)組成分0.1 mL繼續(xù)孵育90 min后洗滌，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)。③試驗(yàn)組成分與病毒等體積作用后接入細(xì)胞（同時(shí)處理感染組）：將各個(gè)試驗(yàn)組0.1 mL分別與等體積的100 TCID5·00.1 mL的病毒孵育90 min后共同接入細(xì)胞，孵育細(xì)胞90 min后洗滌，加入維持液，置于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

以上試驗(yàn)均設(shè)置病毒對(duì)照組與正常細(xì)胞對(duì)照組，每種指標(biāo)均設(shè)置3孔重復(fù)。當(dāng)3種處理方式的病毒對(duì)照組出現(xiàn)CPE達(dá)到+++和++++時(shí)，用MTT方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

1.2.5 Bestatin與S-層蛋白對(duì)TGEV感染ST細(xì)胞抑制作用的比較

1.2.5.1不同濃度S-層蛋白與Bestatin對(duì)TGEV感染ST細(xì)胞的抑制比較

將對(duì)ST細(xì)胞最大無毒劑量的S-層蛋白和Bestatin同時(shí)進(jìn)行2倍稀釋。取不同濃度的兩種成分接入到長滿單層的ST細(xì)胞中，置37℃、5% CO2溫箱，孵育90 min，棄去成分，洗滌細(xì)胞2~3次，感染100 TCID5·00.1mL TGEV，置37℃、5% CO2溫箱，90 min后，棄去成分，加入細(xì)胞維持液。設(shè)立病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。每日觀察細(xì)胞，待病毒對(duì)照組出現(xiàn)明顯病變時(shí)，進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.2.5.2 Bestatin和S-層蛋白聯(lián)合對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上增殖的抑制

將最大無毒劑量的Bestatin接入長滿單層的ST細(xì)胞上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min后，棄Bestatin，洗滌細(xì)胞。加入0.8 mg·mL-1的S-層蛋白，置于37℃、5% CO2溫箱90 min后，棄S-層蛋白，洗滌細(xì)胞。感染100 TCID50·0.1mL TGEV，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)90 min后，棄病毒液，加入細(xì)胞維持液。設(shè)置病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。每日觀察細(xì)胞病變情況，待病毒對(duì)照組出現(xiàn)明顯CPE時(shí)，采用MTT法檢測(cè)。1.2.6 MTT測(cè)定方法

參照方蓉等方法[7]，病毒抑制率（%）=[（各成分處理組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）/（細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）]× 100%。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用Dun?can法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間標(biāo)有不同大寫字母者表示差異極顯著（P<0.01）；標(biāo)有不同小寫字母者表示差異顯著（P<0.05）；標(biāo)有相同小寫字母者表示差異不顯著（P>0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1 TGEV繁殖滴度測(cè)定結(jié)果

采用Reed-Muench法計(jì)算TGEV TO163毒株的

TCID50·0.1 mL為10-5.92。

2.2嗜酸乳桿菌S-層蛋白鑒定結(jié)果

由圖1、2可知，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)蛋白大小為45 ku。與S-層蛋白大小一致。PCR擴(kuò)增檢測(cè)顯示目的條帶大小為1 200 bp。與S-層蛋白基因大小一致。初步鑒定所提取蛋白樣本為S-層蛋白。

2.3嗜酸乳桿菌的最大無毒劑量結(jié)果

將各種不同稀釋度的成分與細(xì)胞孵育后，通過觀察細(xì)胞CPE變化程度和MTT檢測(cè)計(jì)算出細(xì)胞活力。嗜酸乳桿菌和脫S-層蛋白的嗜酸乳桿菌最大無毒劑量為1011cfu·mL-1。代謝產(chǎn)物最大無毒劑量益生菌108cfu·mL-1濃度下代謝產(chǎn)物1?2的稀釋液，S-蛋白最大無毒劑量益生菌108cfu·mL-1濃度下1?16的稀釋液。牛血清白蛋白在S-層蛋白最大無毒劑量下對(duì)細(xì)胞無毒性。Bestatin的最大無毒劑量為4 mg·mL-1。

2.4嗜酸乳桿菌不同成分對(duì)TGEV在ST中增殖的影響

2.4.1嗜酸乳桿菌不同作用方式對(duì)TGEV抑制率的對(duì)比

由表1可以看出，嗜酸乳桿菌對(duì)病毒抑制率隨濃度升高而增強(qiáng)，108cfu·mL-1濃度時(shí)抑制率最高，再增加菌體濃度則抑制率隨之降低；在3種不同處理試驗(yàn)中，感染后處理組對(duì)病毒的抑制率明顯低于其他兩組，同時(shí)感染處理組病毒抑制率顯著強(qiáng)于處理后感染組。

圖1　S-層蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)Fig. 1　SDS-PAGE of S-layer protein

圖2　S-層蛋白基因PCR檢測(cè)Fig. 2　PCR test of S-layer protein's gene

表1　嗜酸乳桿菌不同加入順序?qū)GEV抑制率對(duì)比(X±SD)Table 1　Comparison of different concentrations of LAC on the inhibitory rate of TGEV(X±SD)

2.4.2脫S-層蛋白嗜酸乳桿菌不同作用方式對(duì)TGEV抑制率的對(duì)比

由表2可見，脫S-層蛋白菌體對(duì)病毒依然具有抑制性，感染后處理組對(duì)病毒抑制率極顯著低于其他兩組，同時(shí)感染處理組與處理后感染組對(duì)病毒的抑制率相當(dāng)。最強(qiáng)抑制病毒的菌體濃度是108cfu·mL-1，抑制性隨其濃度變化產(chǎn)生相應(yīng)變化。

表2　不同濃度脫S-層蛋白菌體不同接入順序?qū)GEV抑制率對(duì)比(X±SD)Table 2　 Comparison of different concentrations of off S-layer LAC on the inhibitory rate of TGEV(X±SD)

2.4.3嗜酸乳桿菌S-層蛋白不同作用方式對(duì)TGEV抑制率的對(duì)比

由表3可知，隨S-層蛋白濃度增加，對(duì)病毒抑制率隨之加強(qiáng)。S-層蛋白濃度為0.8 mg·mL-1，抑制作用最強(qiáng)。

其中在每組濃度數(shù)據(jù)中，同時(shí)感染處理組的抑制率最大，顯著高于處理后感染組，極顯著高于感染后處理組。

2.4.4牛血清白蛋白不同作用方式對(duì)TGEV抑制率的對(duì)比

由表4可知，牛血清白蛋白對(duì)病毒有一定的抑制作用，抑制率隨蛋白濃度變化而變化，牛血清白蛋白濃度越高，抑制率越高。但抑制率明顯低于嗜酸乳桿菌各成分。在3種處理組中，同時(shí)感染處理組和處理后感染組對(duì)病毒的抑制率相近，略高于感染后處理組。

2.4.5嗜酸乳桿菌代謝產(chǎn)物不同作用方式對(duì)TGEV抑制率的對(duì)比

如表5所示，2、4倍稀釋液，抑制率明顯，同時(shí)感染處理組對(duì)病毒抑制率顯著強(qiáng)于處理后感染組，極顯著強(qiáng)于感染后處理組；8倍和16倍稀釋液抑制作用不強(qiáng)，但同時(shí)感染處理組抑制率明顯高于其他處理。32、64倍稀釋液，3組抑制率均較低，作用強(qiáng)度無顯著差異。

表3　不同濃度S-層蛋白不同接入順序?qū)GEV抑制率對(duì)比(X±SD) Table 3　Comparison of different concentrations of S-layer protein on the inhibitory rate of TGEV(X±SD)

表4　不同濃度BSA不同接入順序?qū)GEV抑制率對(duì)比(X±SD)Table 4　Comparison of different concentrations of BSA on the inhibitory rate of TGEV(X±SD)

表5　不同濃度代謝產(chǎn)物不同接入順序?qū)GEV抑制率對(duì)比(X±SD)Table 5　Comparison of different dilution of metabolites on the inhibitory rate of TGEV(X±SD)

2.4.6不同濃度Bestatin和S-層蛋白對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上增殖的抑制比較

由表6可知，Bestatin不同濃度對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上的增殖均起到試驗(yàn)明顯抑制作用。其抑制作用與Bestatin濃度呈明顯的計(jì)量相關(guān)性。濃度越大抑制作用越強(qiáng)。S-層蛋白稀釋度也是從細(xì)胞的最大無毒劑量開始。但S-層蛋白不是在最大無毒劑量時(shí)對(duì)病毒抑制作用最強(qiáng)，而是在最大無毒劑量的2倍稀釋液的濃度最大，也就是0.8 mg·mL-1。S-層蛋白對(duì)病毒的抑制率與其濃度沒有計(jì)量相關(guān)效應(yīng)。但S-層蛋白對(duì)病毒的抑制率與Bestatin相近。

表6　不同濃度Bestatin和S-層蛋白對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上增殖的抑制比較(X±SD)Table 6　Comparison of different dilution of Bestatin and S-layer protein on the inhibitory rate of TGEV(X±SD)

2.4.7 S-層蛋白與Bestatin聯(lián)合作用對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上增殖的影響

0.8 mg·mL-1的S-層蛋白對(duì)TGEV的抑制率為86%，Bestatin最大無毒劑量對(duì)TGEV的抑制率為80%，而當(dāng)Bestatin先預(yù)處理ST細(xì)胞后加入S-層蛋白孵育細(xì)胞后，再感染TGEV，對(duì)病毒的抑制率為91.3%。

3　討論

3.1不同方式處理嗜酸乳桿菌S-層蛋白對(duì)抑制TGEV感染ST細(xì)胞存在差異

采用3種不同添加方式研究S-層蛋白對(duì)病毒的作用，結(jié)果顯示S-層蛋白預(yù)先孵育細(xì)胞再感染病毒的預(yù)先處理組抑制率最高。與Martínez等研究嗜酸乳桿菌的S-層蛋白對(duì)JUNV的抑制中結(jié)果一致[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明S-層蛋白對(duì)ST細(xì)胞的保護(hù)作用發(fā)生在TGEV病毒感染ST細(xì)胞之前。感染TGEV病毒后，S-層蛋白對(duì)ST細(xì)胞的保護(hù)作用較小。而S-層蛋白直接與病毒處理后再感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)并沒有很強(qiáng)的抑制效果，也可以說明S-層蛋白對(duì)病毒并沒有直接作用。Sergey等在研究嗜酸乳桿菌NCFM的S-層蛋白對(duì)未成熟的樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的調(diào)節(jié)中，試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明預(yù)先將S-層蛋白與病毒處理后，觀察病毒結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)S-層蛋白并不能破壞病毒粒子結(jié)構(gòu)[8]。

嗜酸乳桿菌菌體、脫S-層蛋白嗜酸乳桿菌菌體和嗜酸乳桿菌代謝產(chǎn)物，也發(fā)現(xiàn)預(yù)先處理組對(duì)TGEV病毒的抑制率明顯高于處理后感染組和同時(shí)感染處理組的抑制率，說明當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)益生菌成分無法起到明顯抑制病毒增殖作用。Botic[2]、王占峰[9]和高長春[10]等用不同益生菌菌體抑制不同病毒在不同細(xì)胞上的繁殖研究中，均能證實(shí)先感染病毒再添加益生菌組對(duì)抑制病毒感染作用不強(qiáng)。菌體最高的病毒抑制率出現(xiàn)在混合感染組和處理后感染組中，菌體感染后處理組的病毒抑制率明顯高于S-層蛋白組、脫S-層蛋白菌體組和代謝產(chǎn)物組，說明菌體的綜合抗病毒能力強(qiáng)于各自成分，并對(duì)已感染病毒的ST有一定保護(hù)作用。

3.2 S-層蛋白與牛血清白蛋白在抑制TGEV感染ST細(xì)胞能力和方式的差別

S-層蛋白和牛血清白蛋白均能抑制TGEV感染ST細(xì)胞，并且同時(shí)感染處理組抑制率高于其他組，說明蛋白本身可能與病毒粘附，從而減弱試驗(yàn)病毒感染細(xì)胞的能力。嗜酸乳桿菌S-層蛋白分子質(zhì)量為45 ku，牛血清白蛋白分子質(zhì)量66.43 ku，牛血清白蛋白的高分子質(zhì)量要高于S-層蛋白的分子質(zhì)量。如果S-層蛋白僅僅只是非特異性地粘附在病毒表面，則其對(duì)病毒抑制作用應(yīng)該比牛血清白蛋白小，但是S-層蛋白的抗病毒能力明顯強(qiáng)于牛血清白蛋白。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示牛血清白蛋白對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上的抑制作用與其濃度呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。濃度越高抑制作用越強(qiáng)。而本試驗(yàn)嗜酸乳桿菌菌株的S-層蛋白對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上的抑制作用與其濃度間并不成劑量效應(yīng)關(guān)系。由此推斷S-層蛋白和TGEV病毒之間的作用不同于牛血清白蛋白與TGEV病毒之間的作用，S-層蛋白對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上的抑制作用不僅是蛋白憑借物理作用與細(xì)胞表面的吸附，而是有獨(dú)特方式。Martínez在研究嗜酸乳桿菌抗病毒作用中，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌可能存在一種憑借高等電點(diǎn)產(chǎn)生的靜電吸引阻礙病毒與易感細(xì)胞上的受體結(jié)合的機(jī)制[4]。而本試驗(yàn)中嗜酸乳桿菌等電點(diǎn)為9.35，而牛血清白蛋白等電點(diǎn)為4.7。S-層蛋白高等電點(diǎn)明顯高于牛血清白蛋白。分析兩種蛋白在抗TGEV感染ST細(xì)胞上能力存在的差異，可能是因?yàn)镾-層蛋白的高等電點(diǎn)，可以產(chǎn)生靜電力，吸引ST細(xì)胞上TGEV的病毒受體，從而干擾TGEV與ST上病毒受體的結(jié)合，以此達(dá)到抑制TGEV在ST上增殖的作用。S-層蛋白對(duì)TGEV的最高抑制率出現(xiàn)在0.8 mg·mL-1而非1.0 mg·mL-1，S-層蛋白對(duì)TGEV病毒的抑制作用不完全符合劑量-效應(yīng)梯度變化規(guī)律。S-層蛋白具備在高濃度下可以自行恢復(fù)成晶格狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的性質(zhì)[5]。所以當(dāng)S-層蛋白濃度處于最大無毒劑量濃度時(shí)，可能是因?yàn)镾-層蛋白處于高濃度下，S-層蛋白單體自行聚集，恢復(fù)成晶體狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致S-層蛋白對(duì)TGEV在ST細(xì)胞繁殖的抑制作用較低?？芍琒-層蛋白只有在單體形式下才具有較強(qiáng)的抗病毒能力。S-層蛋白單體與其自身單體的結(jié)合能力強(qiáng)于與細(xì)胞上病毒受體的結(jié)合能力。

3.3 S-層蛋白可能通過封閉TGEV細(xì)胞受體氨肽酶發(fā)揮抗病毒作用

Delmas等已經(jīng)證實(shí)TGEV受體為氨肽酶[11]。Bestatin是從橄欖網(wǎng)狀鏈霉菌（Stretomyces olivorectic?uli）培養(yǎng)液中分離出來的化學(xué)物質(zhì)，有抑制氨肽酶活性功效，是目前唯一上市的APN抑制劑[12]。本試驗(yàn)選取試驗(yàn)氨肽酶抑制劑Bestatin，研究其對(duì)TGEV感染ST細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，Bestatin對(duì)TGEV具有較強(qiáng)的抑制作用。Bestatin對(duì)病毒的抑制呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨劑量增加對(duì)病毒抑制率增強(qiáng)。其抑制作用與S-層蛋白對(duì)TGEV感染ST的抑制作用一致。當(dāng)Bestatin與S-層蛋白共同作用時(shí)，同樣可提高對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，降低病毒對(duì)細(xì)胞的感染。Sergey研究試驗(yàn)嗜酸乳桿菌NCFM的S-層蛋白，研究發(fā)現(xiàn)此菌可以依靠S-層蛋白的高等電點(diǎn)產(chǎn)生的靜電吸引DC-SIGN。DC-SIGN是一種能參于表達(dá)與樹突狀細(xì)胞（DC）兼有模式識(shí)別受體和細(xì)胞黏附功能的C型凝集素。證明試驗(yàn)DC-SIGN配體為嗜酸乳桿菌NCFM的S-層蛋白[8]。樹突細(xì)胞與嗜酸乳桿菌作用，實(shí)際上是DC-SIGN 和S-層蛋白作用調(diào)節(jié)試驗(yàn)細(xì)胞免疫。本研究選用的嗜酸乳桿菌S-層蛋白很有可能借助其高等點(diǎn)產(chǎn)生的靜電引力與TGEV受體氨肽酶結(jié)合，阻礙試驗(yàn)TGEV與ST細(xì)胞上受體氨肽酶的結(jié)合，通過競(jìng)爭(zhēng)病毒受體氨肽酶的方式抑制TGEV病毒對(duì)細(xì)胞的感染。

3.4 Bestatin和嗜酸乳桿菌S-層蛋白聯(lián)合對(duì)細(xì)胞保護(hù)的增強(qiáng)作用

Eeuri等在研究氨肽酶密度對(duì)PEDV感染的作用中已經(jīng)證實(shí)ST細(xì)胞可以表達(dá)氨肽酶[13]。所以，本試驗(yàn)選擇ST細(xì)胞作為細(xì)胞平臺(tái)，研究氨肽酶抑制劑對(duì)TGEV的抑制作用。氨肽酶也是冠狀病毒家族中PEDV的病毒受體。Eeuri等研究表明ST細(xì)胞不能感染PEDV的原因是ST細(xì)胞氨肽酶密度較小。提高ST細(xì)胞氨肽酶密度，PEDV可大量感染ST細(xì)胞[13]。TGEV在ST細(xì)胞上增殖，不僅病變時(shí)間早，而且毒價(jià)高。所以ST細(xì)胞是TGEV繁毒的常用細(xì)胞。TGEV的病毒受體為氨肽酶，而ST細(xì)胞上的氨肽酶含量又很少，可以分析出TGEV感染ST細(xì)胞與氨肽酶密度大小無關(guān)。本試驗(yàn)氨肽酶活力抑制劑Bestatin加入抑制試驗(yàn)TGEV在ST細(xì)胞上的繁殖，TGEV感染ST細(xì)胞的程度更依賴于氨肽酶活性，而不是氨肽酶密度。

Bestatin不是完全抑制氨肽酶活性而是部分抑制。所以試驗(yàn)在Bestatin預(yù)處理細(xì)胞的基礎(chǔ)上添加嗜酸乳桿菌的S-層蛋白作用于細(xì)胞后感染TGEV病毒。發(fā)現(xiàn)Bestatin與S-層蛋白的聯(lián)合作用對(duì)病毒抑制率顯著高于二者單獨(dú)對(duì)病毒的抑制。S-層蛋白有高效的基因表達(dá)系統(tǒng)并且蛋白合成、分泌能力極強(qiáng)[5]。通過ST細(xì)胞平臺(tái)評(píng)價(jià)S-層蛋白對(duì)TGEV的抑制作用，S-層蛋白在較低濃度下即可表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗TGEV病毒能力且與Bestatin一起作用可以明顯抑制TGEV對(duì)ST細(xì)胞的感染?？蓪-層蛋白添加入Bestatin，二者聯(lián)合，有望合成治療TGEV病毒感染仔豬的新型藥劑。嗜酸乳桿菌S-層蛋白在抗TGEV應(yīng)用領(lǐng)域具有一定前景。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，該株嗜酸乳桿菌S-層蛋白可抑制TGEV在ST細(xì)胞上的增殖，與TGEV氨肽酶抑制劑Bestatin對(duì)TGEV在ST細(xì)胞上的增殖影響呈類似功效。氨肽酶抑制劑Bestain預(yù)處理ST細(xì)胞對(duì)S-層蛋白抑制TGEV感染具有協(xié)同作用。S-層蛋白研究為揭示益生菌抗病毒機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

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Wei Ping, Liu Guanqun, Jia Guodong, et al. Study of antivirus actions at different LAC component in TGEV infecting ST cell [J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(3): 59-66. (in Chinese with English abstract)

Study of antivirus actions at different LAC component in TGEV infect?

ing ST ce

ll/WEI Ping, LIU Guanqun, JIA Guodong, ZHAO Yibo, XIA Lu(School of Veteinary Medi-cines, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:The study was used different LAC component in TGEV infecting ST cell in order to explore the antivirsl activity of probiotics and possible mechanism thereof. Lactobacillus acidophilus was isolated different components and Bestatin. Experiment was divided into three groups: preventing group, treating group and mixed infectious group. With MTT of ST, virus inhibition rate were determined to evaluate the impact of different LAC component on TGEV. S-layer protein were added based on Bestatin closing ST cells, in order to study on the combined effect. The experimental results showed that the S-layer protein inhibited virus strongest, followed probiotics, later off S protein probiotics, metabolites, BSA lowest. S-layer protein inhibition of S-layer protein almost was equal with Bestatin. The experimental concluded that anti-virus capability of S-layer protein was descripted. The combined effects of Bestatin and S-layer strengthened the inhibition rate of TGEV infected ST cells invitro.

Key words:Lactobacillusacidophilus; S-layer protein; antivirus

作者簡介：魏萍（1961-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)傳染病學(xué)與流行病學(xué)。E-mail: weiiping@163.com

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（12521z001）；哈爾濱市科技局項(xiàng)目（2014RFXGJ096）

收稿日期：2014-02-11

文章編號(hào)：1005-9369（2015）03-0059-08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：S855.3；S858.28