新疆“生命營養(yǎng)液”抑菌能力評價及其菌種分離純化

趙 婷， 吾布利·卡地爾， 翟 磊， 白飛榮， 程 池，*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊 830000）

新疆“生命營養(yǎng)液”抑菌能力評價及其菌種分離純化

趙 婷1， 吾布利·卡地爾2， 翟 磊1， 白飛榮1， 程 池1，*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊 830000）

評價新疆特色功能飲料“生命營養(yǎng)液”，對5種常見食源性致病菌和5種食品常見益生菌的抑菌能力，并對該飲料中微生物菌種進(jìn)行初步分離純化。結(jié)果顯示，“生命營養(yǎng)液”30 μL原液對5種常見食源性致病菌腸沙門氏菌腸亞種（Salmonella enterica subsp.Enterica）、出血性大腸埃希氏菌（Escherichia coli EHEC O157∶H7）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas eruginosa）均具有抑菌能力，抑菌圈直徑分別為10.5，12.0，12.0，12.5，10.0 mm，對4種常見益生菌植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）、動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）均無抑菌能力，僅對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）具有抑菌能力，抑菌圈直徑為27.0 mm。從“生命營養(yǎng)液”中分離純化出3株革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，1株革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，1株產(chǎn)紅褐色可溶性色素絲狀真菌，初步鑒定為紅曲菌屬（Monascus sp.）。

抑菌；分離純化；新疆；功能飲料

“生命營養(yǎng)液”以新疆地區(qū)產(chǎn)的核桃、巴旦木、杏仁、黃豆、綠豆、大米、干鮮果類和蔬菜類等50多種天然產(chǎn)品為原料，以傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，經(jīng)過獨特的方法多次發(fā)酵制備而生產(chǎn)，發(fā)酵工藝特點為等重量配比的原料粉碎、混合，將混合料與水按質(zhì)量比為1∶3加水，煮30 min，冷卻至常溫后過濾，將濾液發(fā)酵4個月，第一月18℃無氧發(fā)酵，第二和第三個月24℃無氧發(fā)酵，最后一個月20℃有氧發(fā)酵，是一種新疆地區(qū)特色功能性飲料［1］。

研究表明“生命營養(yǎng)液”富含蛋白質(zhì)、粗脂肪、維生素、礦物質(zhì)和營養(yǎng)纖維素，能夠有效控制并配合治療心腦血管疾病、糖尿病、各類炎癥和男科、婦科疾病、加強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，促進(jìn)細(xì)胞再生、幫助傷口組織愈合，為人體各組織器官提供充足營養(yǎng)［2］。在新疆地區(qū)，維吾爾族民間常飲用“生命營養(yǎng)液”用于營養(yǎng)保健，對其有圖騰般的崇拜，但其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)原理還未深入研究。本文評價了“生命營養(yǎng)液”對5種常見食源性致病菌和5種食品中常見益生菌的抑菌能力，并對其優(yōu)勢微生物菌群進(jìn)行了初步分離與純化，為“生命營養(yǎng)液”的抑菌活性及發(fā)酵菌株分析及功能性研究提供重要基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

生命營養(yǎng)液，由新疆埃杜升（ALDOS）生物開發(fā)有限公司提供。

1.1.2 實驗菌株

5種常見食源性致病菌和5種食品中常見益生菌，均保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），見表1。

表1 實驗菌株Tab.1 10 kinds of strains in test

1.1.3 培養(yǎng)基

Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基（MHA），乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS），營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NA），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），麥芽瓊脂培養(yǎng)基（MEA）均購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.4 抑菌劑載體

5 mm直徑圓形新華一號定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理后，置120℃干燥2 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 厭氧裝置

MGC厭氧培養(yǎng)盒及厭氧產(chǎn)氣袋AnaeroPack均購自日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社。

1.2 抑菌能力評價

目前抑菌能力測定的方法有紙片擴(kuò)散（Kirby-Bauer，KB）法、最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）法、抑菌效力檢查法等［3-9］，實驗參考《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）紙片擴(kuò)散法［3］。

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

按照實驗所需劑量稱取MHA培養(yǎng)基或MRS瓊脂培養(yǎng)基干粉，加蒸餾水?dāng)嚢瑁訜嶂蠓兄镣耆芙猓?21℃滅菌20 min，冷卻至50℃傾注平板備用。

1.2.2 實驗菌株菌懸液的制備

將10株實驗菌株分別在適宜的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，分別蘸取1～2環(huán)生長對數(shù)期菌體至1 mL無菌0.85%生理鹽水中，渦旋振蕩15 s，用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管校正菌懸液濃度為0.5 McF，即5×105～5×106CFU/mL。

1.2.3 “生命營養(yǎng)液”抑菌片的制備

取無菌并干燥的濾紙片，每片滴加30 μL“生命營養(yǎng)液”原液，然后將濾紙片平放于清潔的無菌平皿內(nèi)，置37℃溫箱烘干備用。

1.2.4 陰性對照樣片的制備

取無菌干燥濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水30 μL，干燥后備用。

1.2.5 實驗菌的接種

CICC 21513、CICC 21530、CICC 21534、CICC 21600、CICC 21636接種于MHA瓊脂培養(yǎng)基，CICC 6009、CICC 6035、CICC 6064、CICC 6069、CICC 21710接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，用無菌棉簽蘸取實驗菌株菌懸液，平板表面均勻涂抹3次，每涂抹1次，平板轉(zhuǎn)動60℃，最后將棉簽繞平板邊緣涂抹1周。蓋好平皿，室溫干燥5 min。

1.2.6 “生命營養(yǎng)液”抑菌劑樣片貼放

每個平板貼放1片實驗樣片，1片陰性對照樣片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面，樣片中心之間相距25 mm以上，與平板的周緣相距15 mm以上。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面，蓋好平皿。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 培養(yǎng)觀察測量

5種常見致病菌在MHA培養(yǎng)基上好氧37℃培養(yǎng)1 d，5種常見益生菌在MRS培養(yǎng)基上厭氧37℃培養(yǎng)1～3 d。用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)直徑（包括貼片）并記錄。測量抑菌環(huán)時，應(yīng)選均勻而完全無菌生長的抑菌環(huán)進(jìn)行，測量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。

1.3 菌種分離與純化

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

按照實驗所需劑量稱取NA、MRS、PDA、MEA瓊脂培養(yǎng)基干粉，加蒸餾水?dāng)嚢?，同時加熱煮沸至完全溶解，121℃滅菌20 min，冷卻至50℃傾注平板備用。

1.3.2 菌種分離純化

在無菌條件下，稱取25.0 mL“生命營養(yǎng)液”，放入盛有225.0 mL無菌水帶玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩20 min，之后靜置5 min。采用梯度稀釋法制備10-2到10-6的系列稀釋液，分別涂布于NA、MRS培養(yǎng)基平板中37℃好氧培養(yǎng)48～72 h，涂布于MEA、PDA培養(yǎng)基平板中25℃好氧培養(yǎng)4 d。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至新鮮斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并于4℃保藏。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察

純化的菌株在適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，通過肉眼觀察并描述菌落質(zhì)地、顏色、形狀、大小等菌落形態(tài)。在光學(xué)顯微鏡下，通過革蘭氏染色法觀察并描述細(xì)菌菌體形態(tài)，通過水浸片法觀察并描述真菌菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等菌體形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌能力評價

參考消毒技術(shù)規(guī)范（2002版）抑菌環(huán)實驗［3］，測定抑菌產(chǎn)品對細(xì)菌的抑菌作用，樣品劑量為“生命營養(yǎng)液”原液30 μL，抑菌環(huán)直徑＞7 mm者，判為有抑菌作用，抑菌環(huán)直徑≤7 mm者，判為無抑菌作用。3次實驗結(jié)果取平均值，實驗設(shè)陰性對照，抑菌圈直徑及判定結(jié)果見表2，培養(yǎng)照片見圖1。

表2 實驗樣品對10種細(xì)菌的抗（抑）菌實驗結(jié)果Tab.2 Results of antimicrobial ability for test sample to 10 kinds of bacteria

圖1 實驗樣品對10種細(xì)菌的抗（抑）菌實驗照片F(xiàn)ig.1 Photos of antimicrobial test for sample to 10 kinds of bacteria

新疆特色功能飲料“生命營養(yǎng)液”對5種常見食源性致病菌腸沙門氏菌腸亞種（Salmonella enterica subsp.Enterica）、出血性大腸埃希氏菌（Escherichia coli EHEC O 157：H7）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas eruginosa）均具有較好的抑菌能力，抑菌圈直徑分別為10.5，12.0，12.0，12.5，10.0 mm。對4種常見益生菌植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）、動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）無抑菌能力，僅對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）具有抑菌能力，抑菌圈直徑為27.0 mm。CICC 6035嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）在接菌量同為0.5 McF情況下，生長相對較弱，在平皿上形成細(xì)密的單菌落，而其他9株菌生長良好，在平皿上形成成片菌落。

新疆特色功能飲料“生命營養(yǎng)液”的抑菌能力和范圍，推測其具有選擇性抑菌特性，與其在促進(jìn)細(xì)胞再生、幫助傷口組織愈合方面的功能相關(guān)，明確機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

2.2 菌種分離純化

2.2.1 菌種分離純化

從“生命營養(yǎng)液”中分離純化出5種優(yōu)勢菌，包括4種細(xì)菌，分別編號為B1、B2、B3、B4；1種真菌，編號為F1。分離情況詳見表3。

表3 “生命營養(yǎng)液”微生物菌種分離與純化Tab.3 Separation and purification of strains in“l(fā)ife nutrient liquid”

2.2.2 菌種形態(tài)學(xué)觀察

2.2.2.1 菌落特征觀察

分離菌株B1、B2、B3、B4、F1菌落形態(tài)描述見表4，菌落形態(tài)照片見圖2。

表4 “生命營養(yǎng)液”分離菌株B1、B2、B3、B4、F1菌落形態(tài)描述Tab.4 Colony morphology description of strain B1，B2，B3，B4，F(xiàn)1，which were isolated from“l(fā)ife nutrient liquid”

圖2 “生命營養(yǎng)液”分離菌株B1、B2、B3、B4、F1菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strains B1，B2，B3，B4，F(xiàn)1，which were isolated from“l(fā)ife nutrient liquid”

2.2.2.2 菌體特征觀察

分離得到的菌株B1、B2、B3、B4、F1菌體形態(tài)描述見表5，菌體形態(tài)照片見圖3。

表5 菌株B1、B2、B3、B4、F1菌體形態(tài)Tab.5 Cell morphology of strain B1，B2，B3，B4，F(xiàn)1

圖3 “生命營養(yǎng)液”分離菌株B1、B2、B3、B4、F1菌體形態(tài)Fig.3 Microscopy morphology of strains B1，B2，B3，B4，F(xiàn)1，which were isolated from“l(fā)ife nutrient liquid”

菌株B1、B2、B3革蘭氏染色紅色，為革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，菌株B4革蘭氏染色紫紅色，為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，需要進(jìn)一步的多相鑒定到種水平。菌株F1菌落粉紅色，絲絨狀，表面平坦，產(chǎn)可溶性紅褐色色素絲狀真菌；無性生殖分生孢子單生或鏈生，著生在菌絲頂端，倒梨形至近球形，菌絲有橫隔；有性生殖閉囊殼球形，成熟后殼壁透明。其與紅曲菌屬菌絲形態(tài)、無性世代及有性世代特征符合，初步鑒定為紅曲菌屬（Monascus sp.）。

3 討 論

在全球抗生素類藥物耐藥性問題日益突出的背景下［10-11］，抗生素濫用的控制越來越受到重視，開發(fā)新型天然抑菌功能類產(chǎn)品顯得尤為迫切。文獻(xiàn)報道［12-15］，多種食品及飲料如橄欖油、醋、茶、牛奶等含有的天然物質(zhì)中，均具有抑制常見食源性致病菌的活性成分，如茶多酚、乳烴素等，這些含有活性成分并具有一定保健功能的食品和飲料，在人體保健養(yǎng)生方面起到積極的輔助作用。推測新疆特色功能飲料“生命營養(yǎng)液”也含有類似的天然抑菌活性成分，并具有選擇性抑菌特性，使其在促進(jìn)組織傷口愈合、抑制細(xì)胞增值等方面具有輔助治療及保健功能［2］，課題組對海南西沙諾尼（Noni）發(fā)酵果汁也進(jìn)行了抑菌能力評價，具有類似的抑菌效果。因此，開發(fā)具有天然抑菌功效的發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品，具有廣闊的應(yīng)用前景。

“生命營養(yǎng)液”為天然果蔬發(fā)酵而成，原料和環(huán)境中的自然菌株參與了發(fā)酵過程，初步推測其抑菌活性成分為微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物或微生物本身，抑菌活性成分可能與其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、多酚、黃酮、多糖等相關(guān)。目前認(rèn)為抑制細(xì)菌繁殖的可能機(jī)制有：抑制細(xì)胞膜合成；抑制蛋白質(zhì)合成；干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄；阻斷微生物代謝等［16］?！吧鼱I養(yǎng)液”抑菌活性成分分析及抑菌機(jī)理的確認(rèn)需要進(jìn)一步深入研究。

“生命營養(yǎng)液”自然發(fā)酵過程使其本身帶有多種活菌，產(chǎn)品菌落總數(shù)2.8×104CFU/mL，在一定程度上影響飲品的口感及功能，因此分析微生物菌群優(yōu)勢微生物種類顯得尤為重要，實驗通過培養(yǎng)法初步分離了5種優(yōu)勢微生物，其中F1初步鑒定為紅曲菌屬（Monascus sp.），紅曲菌是我國食品中傳統(tǒng)使用的真菌，后續(xù)需要對這5種微生物進(jìn)行多相分類鑒定，獲得準(zhǔn)確的種水平分類地位，進(jìn)而分析其對飲品功能性的影響。同時，批次產(chǎn)品間的抑菌性能穩(wěn)定性需要評估，生產(chǎn)工藝需要進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，實驗樣品量需進(jìn)一步擴(kuò)大。

［1］亞森·克力木.一種保健營養(yǎng)液及其制備方法：中國，201110111492.8［P］.2011-11-02.

［2］新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司.埃杜升生命營養(yǎng)液［EB/OL］.［2014-06-01］http：∥www.aldost.com/cn/ product_show.php？id=1.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部.消毒技術(shù)規(guī)范2002—2.1.8. 2抑菌環(huán)試驗［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T 125—1999紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1999.

［5］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 1944—2007動物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定紙片擴(kuò)散法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

［6］Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI M38-A2-2008 reference method for broth dilution antifungal susceptibilitytestingoffilamentousfungi，approved standard-second edition［S］.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［7］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；twentyfirst informational supplement CLSI document M100-S21-2011［S］.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2011.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典-二部附錄XIX N：抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則［M］.9版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：215-216.

［9］Food and Agriculture Organization and World Health Or-ganization Expert Committee on Food Additives.Combined compendium of food additive specifications volume 4，analytical methods，test procedures and laboratory solution used by and referenced in the food additive specifications［M］.Rome：Food and Agriculture Organization of the United Nations，2006：22-24.

［10］Center for Disease Control and Prevention.About antimicrobial resistance：a brief overview［EB/OL］.［2014-06-01］http：∥www.cdc.gov/drugresistance/about.html.

［11］World Health Organization.Antimicrobial resistance global report on surveillance［R］.Geneva：WHO，2014.

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［16］Tenover F C.Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria［J］.The American Journal of Medicine，2006，119（6）：3-10.

Evaluation of Antimicrobial Ability and Isolation of Strains from Xinjiang“Life Nutrient Liquid”

ZHAO Ting1， UBUL·Kadir2， ZHAI Lei1， BAI Feirong1， CHENG Chi1，*
（1.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015，China；（2.Xinjiang ALDOS Biological Development Co.Ltd.，Urumqi 830000，China）

Evaluation of antimicrobial ability of Xinjiang unique functional beverage“l(fā)ife nutrient liquid”on five kinds of common food-borne pathogenic bacteria and 5 kinds of common probiotics in food industry.At the same time，microbe strains were separated and purified from this functional beverage.Results showed 30 μL“l(fā)ife nutrient liquid”had antibacterial property for all 5 kinds of pathogenic bacteria：Salmonella enterica subsp.Enterica，Escherichia coli EHEC O157：H7，Shigella flexneri，Staphylococcus aureus，and Pseudomonas eruginosa，and the inhibitory zone diameters were 10.5 mm，12.0 mm，12.0 mm，12.5 mm，and 10.0 mm，respectively.For 4 kinds of probiotics：Lactobacillus plantarum subsp. Plantarum，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，Bifidobacterium infantis，and Bifidobacterium animalis subsp.lactis，the beverage has no obvious antibacterial properties except Streptococcus thermophilus，which the inhibitory zone diameter was 27.0 mm.Three different gram-negative rod-shaped bacteria，a gram-positive rod-shaped bacterium and a fungus which produced reddish brown soluble pigment were isolated from the beverage.The fungus was preliminary identified as Monascus sp.The test results provided a basic reference data for the systematically functional research of Xinjiang unique functional beverage“l(fā)ife nutrient liquid”.

antimicrobial ability；separation and purification；Xinjiang；functional beverage

李 寧）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.009

2095-6002（2015）02-0048-06

趙婷，吾布利·卡地爾，翟磊，等.新疆“生命營養(yǎng)液”抑菌能力評價及其菌種分離純化［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2015，33（2）：48-53.

ZHAO Ting，UBUL·Kadir，ZHAI Lei，et al.Evaluation of antimicrobial ability and isolation of strains from Xinjiang“l(fā)ife nutrient liquid”［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：48-53.

2014-06-11

國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B11）。

趙 婷，女，高級工程師，碩士，主要從事微生物菌種鑒定與評價方面的研究；

*程 池，男，教授級高級工程師，主要從事微生物學(xué)方面的研究。

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