食用菌拮抗反應(yīng)的定量分析

劉 昆 宋小亞 蔣 俊 路新彥

（麗水農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

食用菌拮抗反應(yīng)的定量分析

劉 昆 宋小亞 蔣 俊 路新彥

（麗水農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

應(yīng)用Photoshop軟件對(duì)拮抗反應(yīng)中的菌絲生長(zhǎng)面積進(jìn)行量化分析。試驗(yàn)采用18個(gè)香菇菌株，經(jīng)對(duì)各菌株菌絲培養(yǎng)，測(cè)量相對(duì)生長(zhǎng)面積，計(jì)算對(duì)照菌株L808對(duì)其他17個(gè)菌株的拮抗系數(shù)。以拮抗系數(shù)為依據(jù)，判別各參試菌株的拮抗能力，拮抗系數(shù)越大，其拮抗能力越強(qiáng)。此可作為食用菌菌種鑒別新的量化指標(biāo)參數(shù)。

Photoshop；拮抗反應(yīng)；香菇

擔(dān)子菌中的拮抗現(xiàn)象（antagonism）是由多基因控制的異源不親合反應(yīng)。控制兩個(gè)菌株雙核菌絲體不親合性的多個(gè)基因位點(diǎn)只要有一處不同，菌絲體相互接觸時(shí)不親合反應(yīng)就會(huì)發(fā)生，并會(huì)在接觸區(qū)出現(xiàn)色素，菌絲隆起和菌絲稀疏等［1］。因拮抗反應(yīng)的試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果也比較容易辨別，常被用于食用菌的菌種鑒別研究。但以往的研究多關(guān)注拮抗線部位的形態(tài)特征，而未對(duì)菌絲生長(zhǎng)面積的大小做過探討。

隨著科技的進(jìn)步，數(shù)字化圖像處理和分析技術(shù)在多個(gè)行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。Photoshop軟件因其圖像處理功能強(qiáng)大常被科研工作者應(yīng)用。利用軟件中直方圖分析不規(guī)則形狀面積的方法在林業(yè)遙感測(cè)量、醫(yī)療中瘢痕計(jì)算、植物病斑面積計(jì)算等工作中發(fā)揮了重要功能［2～4］。本文在他人的研究基礎(chǔ)上，介紹一種應(yīng)用Photoshop軟件對(duì)拮抗反應(yīng)中菌絲生長(zhǎng)面積進(jìn)行量化分析的方法。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

18個(gè)香菇菌株，分別為L(zhǎng)808、L868、L135、L9015、L939、L241-4、慶科20、武香1號(hào)、蘇香1號(hào)、申香1號(hào)、申香2號(hào)、申香8號(hào)、申香10號(hào)、申93、L26、Cr04、Cr66和Cr33，均由麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院大型真菌種質(zhì)資源庫(kù)提供。

Adobe Photoshop CS6 簡(jiǎn)體中文試用版由Adobe公司的中文主頁(yè)下載而得。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）菌絲的培養(yǎng)。培養(yǎng)基量為每皿20 mL，在培養(yǎng)皿底部（直徑90 mm，下同）平面上，距圓心15 mm處分別作直徑為5 mm的圓，滅菌備用。將供試菌株轉(zhuǎn)接至PDA試管中，25 ℃黑暗條件下活化培養(yǎng)。試管長(zhǎng)滿菌絲后，將菌株接種至PDA平板的中央，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。

當(dāng)菌絲長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3面積時(shí)，用直徑5 mm的打孔器在菌絲邊緣打孔，取菌絲塊。分別將L808與其他17個(gè)菌株的菌絲塊接種到上述備用培養(yǎng)皿圓中，于25 ℃黑暗下對(duì)峙培養(yǎng)。當(dāng)兩菌株菌絲相互接觸后，在光下培養(yǎng)5～7天。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿在相同的拍攝參數(shù)上進(jìn)行正反面拍照。

（2）菌絲相對(duì)生長(zhǎng)面積的測(cè)量。用Photoshop軟件打開培養(yǎng)皿背面的拮抗照片。菜單欄中選擇“圖像—調(diào)整—曲線”，打開曲線調(diào)整對(duì)話框，向下調(diào)整曲線中間調(diào)（圖1），提高菌絲與背景之間及拮抗線自身的清晰度。工具欄中選取“磁性套索工具”，羽化值設(shè)為3，沿拮抗線和培養(yǎng)皿的邊緣選取一個(gè)菌株的菌絲覆蓋處。菜單欄中選擇“窗口—直方圖”調(diào)出直方圖對(duì)話框（圖2），記錄其中的像素?cái)?shù)，記做P1。同樣的方法測(cè)量整個(gè)培養(yǎng)皿底部的像素?cái)?shù)，記做P2。

圖1 曲線調(diào)整對(duì)話框

圖2 從直方圖中讀取整個(gè)培養(yǎng)皿的像素信息

（3）相對(duì)生長(zhǎng)面積的計(jì)算。試驗(yàn)原理參照參考文獻(xiàn)［4］，方法略有修改。數(shù)碼照片的分辨率是單位長(zhǎng)度上容納像素的數(shù)量。通常所講72像素的分辨率指1英寸長(zhǎng)度的位置上包含72個(gè)像素，即1平方英寸面積上含有72×72=5 184個(gè)像素。因此數(shù)碼照片中的實(shí)際面積S可以用其所包含的像素?cái)?shù)P除以分辨率R得到。拮抗反應(yīng)試驗(yàn)同一照片（分辨率R相同）中兩不同菌絲覆蓋面積的比值A(chǔ)（以下稱為拮抗系數(shù)）可用下列公式求得：

S1表示測(cè)試菌株的菌絲生長(zhǎng)面積；S2表示對(duì)照菌株的菌絲生長(zhǎng)面積；P1表示測(cè)試菌株菌絲所覆蓋培養(yǎng)皿的像素?cái)?shù)；P2表示整個(gè)培養(yǎng)皿的像素?cái)?shù)，R表示分辨率。

2 結(jié)果與分析

2.1 圖片的選用

拮抗反應(yīng)試驗(yàn)中L808與大部分菌株均有明顯的拮抗反應(yīng)，培養(yǎng)皿中不同的菌株以拮抗線為分界線形成了2個(gè)區(qū)域，界限明顯，方便軟件進(jìn)行測(cè)量。但也有部分菌株，從培養(yǎng)皿正面觀察不易分清兩者菌絲的生長(zhǎng)邊界，而培養(yǎng)皿背面則非常容易將兩者區(qū)分開（圖3）。同時(shí)因拮抗時(shí)所用的菌株菌絲一般均為同一顏色，而且某些菌株因其特性會(huì)形成色素、菌絲球和菌落不均勻等現(xiàn)象，會(huì)干擾軟件的測(cè)量。因此測(cè)量數(shù)據(jù)時(shí)，以培養(yǎng)皿背面的圖片為好。

圖3 L808與L135的拮抗反應(yīng)試驗(yàn)正面（左）與背面（右）

圖4 L808對(duì)其他菌株的拮抗系數(shù)曲線

試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)以照片中的像素?cái)?shù)為基礎(chǔ)，因此在拍照時(shí)，圖片的參數(shù)要統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 拮抗能力分析

根據(jù)L808對(duì)其他17個(gè)菌株拮抗系數(shù)的分析結(jié)果（圖4），拮抗系數(shù)曲線呈明顯的上升趨勢(shì)。隨著拮抗系數(shù)的增加，L808對(duì)其他菌株的拮抗能力依次增強(qiáng)，其中對(duì)L868的拮抗能力最弱，對(duì)L135的拮抗能力最強(qiáng)。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表1），按照顯著性差異大小，可將17個(gè)試驗(yàn)菌株分成7組：L868、Cr04、L26、申香1號(hào)4個(gè)菌株為第1組；申香8號(hào)、Cr33、武香1號(hào)、L939、蘇香1號(hào)、申香2號(hào)、申93共7個(gè)菌株為第2組；申香10號(hào)、Cr66為第3組；L241-4、L9015、慶科20、L135分別單獨(dú)成為第4、第5、第6、第7組。

L808與第一組菌株之間的拮抗系數(shù)小于1，說明其菌絲對(duì)組中菌株的拮抗能力較弱；L808與第2組菌株間的拮抗系數(shù)接近于1，說明其菌絲對(duì)組中菌株的拮抗能力相當(dāng)；L808與第3組的拮抗系數(shù)均超過了1但小于1.3，說明其菌絲對(duì)被測(cè)菌株的拮抗能力較強(qiáng)；L808與第4、第5、第6、第7組的拮抗系數(shù)均超過了1.3，甚至接近2，說明其菌絲對(duì)被測(cè)菌株的拮抗能力非常強(qiáng)。由此可見，拮抗系數(shù)可有效地分析出L808對(duì)不同菌株拮抗能力的大小。

表1 L808對(duì)不同菌株的拮抗系數(shù)

3 討 論

在藥物的抑菌試驗(yàn)中，常通過抑菌圈的大小來判斷藥物的抑菌效應(yīng)。其操作是將供試菌涂布于整個(gè)培養(yǎng)皿中，在其上接種待測(cè)藥物。抑菌圈一般是規(guī)則的圓形，只需要測(cè)定圓的直徑便可測(cè)量出抑菌能力大小。而食用菌的拮抗反應(yīng)試驗(yàn)一般是兩個(gè)菌株或多個(gè)菌株近距離的對(duì)峙培養(yǎng)，其菌絲生長(zhǎng)速度快，在出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象時(shí)，菌絲已經(jīng)布滿培養(yǎng)皿，形成兩個(gè)或多個(gè)不規(guī)則的扇形區(qū)，手工不易準(zhǔn)確測(cè)量其面積的大小。本文結(jié)合藥物抑菌實(shí)驗(yàn)的原理，應(yīng)用Photoshop軟件的直方圖像素信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)食用菌拮抗反應(yīng)中菌絲相對(duì)生長(zhǎng)面積的測(cè)量。

以往利用拮抗反應(yīng)鑒別菌種過程中，會(huì)出現(xiàn)因拮抗反應(yīng)現(xiàn)象不明顯、試驗(yàn)操作不規(guī)范和各人觀察角度不同，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)論有誤差，影響鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究通過用電腦軟件測(cè)量菌絲生長(zhǎng)面積的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同菌株間的拮抗能力鑒別，輔助拮抗反應(yīng)最終結(jié)果的判定，增加拮抗試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。當(dāng)兩菌株之間無明顯的拮抗反應(yīng)，而拮抗系數(shù)明顯小于或大于1時(shí)，則表示兩菌株有差異的概率明顯提高。

通過比較新品種與對(duì)照菌種的拮抗系數(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)其生長(zhǎng)勢(shì)的判斷。測(cè)量新品種與對(duì)照菌之間拮抗系數(shù)的大小，還可判斷其抑菌能力。因此，拮抗系數(shù)可在食用菌育種試驗(yàn)中作為一種新的量化指標(biāo)應(yīng)用。

［1］ 沈?qū)W香， 尚曉冬， 汪虹， 等. 十株香菇菌株間的營(yíng)養(yǎng)體不親合性［J］. 食用菌學(xué)報(bào)， 2008， 13（2）: 1-5.

［2］ 王新， 楊書濤. Photoshop在林業(yè)工作中計(jì)算面積的方法和應(yīng)用［J］. 林業(yè)科學(xué)， 2012， 11: 60.

［3］ 周洲， 張軍鋒， 陳建， 等. Photohshop軟件在免疫組化圖像分析中的應(yīng)用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（24）: 11963-11965.

［4］ 崔華威， 楊艷麗， 黎敬濤， 等. 一種基于Photoshop的葉片相對(duì)病斑面積快速測(cè)定方法［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009，37（22）: 10760-10762， 10805.

S646

A

2095-0934（2015）06-364-03

麗水市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012JYZB26）

劉昆（1984—），男，助理研究員，碩士研究生，主要從事食用菌菌種質(zhì)量檢測(cè)工作。E-mail：tjliukun@126.com